哇巴因誘導(dǎo)人足細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

婁美玉 劉昌璇 陳文莉

·論著·

哇巴因誘導(dǎo)人足細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

婁美玉 劉昌璇 陳文莉

目的 足細(xì)胞凋亡在狼瘡腎炎(lupus nephritis，LN)發(fā)病過程中有重要作用。內(nèi)源性哇巴因為強(qiáng)心甾類固醇中的一種，在慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患者體內(nèi)表達(dá)上調(diào)，在5/6腎切除所模擬的慢性腎衰竭大鼠模型體內(nèi)可誘導(dǎo)腎間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。本研究主要探討哇巴因在LN中誘導(dǎo)人足細(xì)胞(human podocytecell，HPC)凋亡的作用機(jī)制。方法 ①體內(nèi)實驗：選取腎臟腫瘤患者被切除的正常腎組織作為對照組，系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動指數(shù)(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)評分大于5分的活動性LN患者的腎組織作為研究組，通過免疫組織化學(xué)檢測腎活檢組織中nephrin的表達(dá)改變。②體外實驗：培養(yǎng)HPC，以不同濃度哇巴因(0 nmol/L，0.1 nmol/L，1 nmol/L，5 nmol/L，10 nmol/L，100 nmol/L)刺激HPC不同時間(24 h、48 h、72 h)后，用MTT法觀察并測定哇巴因?qū)PC增殖凋亡的影響；以不同濃度哇巴因處理HPC 24 h后，采用Hoechst-33258染色檢測細(xì)胞凋亡；收集各個濃度哇巴因處理的細(xì)胞，用蛋白免疫印跡法檢測鈉鉀ATP酶α1(Na+-K+-ATPase α1，NKAα1)、p-Src、nephrin的表達(dá)情況。③HPC用Src激酶抑制劑PP2(1 μmol/L)提前1 h預(yù)處理，隨后加入不同濃度哇巴因孵育24 h，收集蛋白，行蛋白免疫印跡，檢測p-Src、nephrin的表達(dá)。結(jié)果 ①哇巴因以劑量和時間依賴方式誘導(dǎo)HPC凋亡。②正常對照腎組織中nephrin的表達(dá)沿腎小球基底膜外側(cè)呈均勻、線狀分布，且表達(dá)強(qiáng)；LN組腎組織中nephrin在腎小球的分布不均，且表達(dá)較正常腎組織明顯減弱。③隨著哇巴因濃度增加，HPC細(xì)胞中NKAα1、p-Src的表達(dá)先上調(diào)再下降，同時可檢測到nephrin蛋白表達(dá)逐漸減少。④PP2預(yù)處理HPC，阻斷哇巴因?qū)rc的活化，使得p-Src表達(dá)下調(diào)，逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)，逐漸恢復(fù)nephrin的表達(dá)，使nephrin表達(dá)增加。結(jié)論 哇巴因通過NKAα1/Src下調(diào)nephrin蛋白的表達(dá)參與HPC凋亡。

哇巴因；足細(xì)胞；凋亡；狼瘡腎炎；鈉鉀ATP酶

狼瘡腎炎(lupus nephritis，LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的常見及嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。足細(xì)胞損傷與足細(xì)胞源性的蛋白尿相關(guān)，在LN發(fā)病過程中有重要作用[1]，甚至有學(xué)者提出足細(xì)胞的靶向治療可能是LN治療的新途徑[2]。nephrin的合成或分布異常是腎小球疾病蛋白尿形成機(jī)制中關(guān)鍵的因素之一。強(qiáng)心甾類固醇(cardiotonicsteroids，CTS)可以抑制鈉鉀ATP酶(Na+-K+-ATPase，NKA)的活性，在泵功能上影響細(xì)胞的濃度梯度的分布。近來發(fā)現(xiàn)CTS可以通過與NKA結(jié)合后，激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(如NKA/Src復(fù)合體等)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、凋亡和纖維化，在心血管疾病、腎臟疾病中發(fā)揮作用。內(nèi)源性哇巴因為CTS中的一種，本研究主要探討LN中哇巴因誘導(dǎo)人足細(xì)胞(human podocyte cell, HPC)凋亡中的作用機(jī)制，為治療LN患者足細(xì)胞源性的蛋白尿提供新的可能靶點(diǎn)。

材料與方法

一、實驗材料

本實驗所用的細(xì)胞系為條件永生性的HPC，來源于美國紐約Mount Sinai醫(yī)學(xué)院Peter Mundel教授惠贈。

正常腎臟組織來源于腎腫瘤切除中的正常組織(光學(xué)顯微鏡及免疫熒光均提示正常)。LN患者的腎組織來源于腎穿刺活檢病理確診為LN患者的腎活檢，腎穿刺活檢前均未使用過激素或免疫抑制劑類藥物，且系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動指數(shù)(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)評分大于5分的活動性LN患者。系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2009年美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)新修訂的SLICC-SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過武漢市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究受試對象均簽署知情同意書。

二、方法

1．免疫組織化學(xué)檢測LN患者腎活檢組織中nephrin的表達(dá)及分布 以腎臟腫瘤患者被切除正常腎臟組織為正常對照，腎穿刺活檢病理確診為LN患者的腎組織為LN組，采用二步法免疫組織化學(xué)檢測nephrin表達(dá)及分布情況(檢測試劑盒，北京中杉金橋)。其中，一抗工作濃度為1∶50兔抗人nephrin(英國abcam公司)。實驗步驟和試劑劑量嚴(yán)格按照試劑操作說明書進(jìn)行。

2．細(xì)胞培養(yǎng)與分組

(1)細(xì)胞培養(yǎng)：未分化足細(xì)胞用含10 U/ml γ干擾素的培養(yǎng)基在5% CO2、33 ℃培養(yǎng)孵育箱傳代培養(yǎng)，待達(dá)70%融合時，換用37℃培養(yǎng)基(不含γ干擾素)，轉(zhuǎn)入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)孵箱分化培養(yǎng)10～14 d，刺激前改用1%血清培養(yǎng)基同步化12 h。

(2)實驗分組：①不同濃度哇巴因[0 nmol/L(對照)，0.1 nmol/L，1 nmol/L，5 nmol/L，10 nmol/L，100 nmol/L]刺激不同時間(24 h、48 h、72 h)；②對照組、0.1 nmol/L哇巴因組刺激24 h；③0 nmol/L哇巴因(對照組)、0.1 nmol/L哇巴因組、10 nmol/L哇巴因組、1 μmol/L PP2(Src激酶抑制劑的一種)組、1 μmol/L PP2+0.1 nmol/L哇巴因組、1 μmol/L PP2+10 nmol/L哇巴因組。

3．MTT法檢測HPC的增殖和凋亡 37 ℃體外培養(yǎng)的HPC，將細(xì)胞重懸成單個細(xì)胞懸液并計數(shù)，接種到3個96孔板，次日血清饑餓同步化后加入不同濃度的哇巴因(0 nmol/L，0.1 nmol/L，1 nmol/L，5 nmol/L，10 nmol/L，100 nmol/L)，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，培養(yǎng)終止前4 h每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液后，再加入150 μl DMSO酶標(biāo)儀490 nm檢測吸光度值(A值)。

4．Hoechst33258檢測細(xì)胞凋亡 取泡酸高壓后的潔凈干燥蓋玻片，將蓋玻片置入6孔板內(nèi)，種入HPC細(xì)胞培養(yǎng)，次日血清饑餓同步化后分為對照組和哇巴因組(10 nmol/L)，培養(yǎng)達(dá)24 h，吸盡培養(yǎng)液，加入1 ml固定液固定后，采用Hoechst 33258檢測細(xì)胞凋亡，實驗步驟和試劑劑量嚴(yán)格按照試劑操作說明書進(jìn)行。采用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核染色情況。

5．蛋白免疫印跡法檢測NKA、p-Src、nephrin蛋白的表達(dá) HPC用Src激酶抑制劑PP2(1 μmol/L)提前1 h預(yù)處理，隨后加入0.1 nmol/L或10 nmol/L哇巴因孵育24 h，收集各組細(xì)胞提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。制備10% SDS-PAGE膠，20 μg/孔上樣，恒壓電泳后恒流轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉1 h。分別用抗NKAα1抗體1∶5 000(德國Milipore公司)，抗p-Src抗體1∶2 000(英國abcam公司)，抗nephrin抗體1∶400(英國abcam公司)，4 ℃孵育過夜，次日用1‰ TBST溶液洗膜，HRP標(biāo)記的二抗1∶5 000(美國Dako公司)，室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光試劑盒(美國GE公司)顯影。應(yīng)用GAPDH(德國Milipore公司)作為內(nèi)參照，稀釋濃度為1∶5 000。Quatity one軟件分析蛋白條帶的灰度值。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組間比較用兩樣本t檢驗，多組間兩兩比較用方差分析(one-way ANOVA)中SNK檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、正常腎組織與LN腎組織nephrin的表達(dá)

采用免疫組織化學(xué)法檢測nephrin表達(dá)及分布情況，并在顯微鏡下觀察、拍照，可觀察到腎組織中nephrin免疫組織化學(xué)染色陽性呈棕黃色，正常對照腎組織中nephrin的表達(dá)沿腎小球基底膜外側(cè)呈均勻、線狀分布，且染色深，LN組腎組織中nephrin在腎小球的分布不均，甚至出現(xiàn)線性消失，且染色較正常腎組織明顯減弱(圖1)。

圖1 腎組織nephrin表達(dá)水平

二、哇巴因可誘導(dǎo)HPC凋亡

HPC用不同濃度的哇巴因(0 nmol/L，0.1 nmol/L，1 nmol/L，5 nmol/L，10 nmol/L，100 nmol/L)孵育24 h、48 h及72 h后，用MTT法檢測細(xì)胞的增殖和凋亡?？捎^察到隨著哇巴因濃度的增加，細(xì)胞受到抑制亦逐漸明顯，并且隨著時間延長，抑制愈明顯。由圖2和表1可見，與對照組相比，除了0.1 nmol/L哇巴因刺激HPC 24 h后差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，哇巴因各濃度組作用24、48、72 h后，A值顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

HPC分為對照組和哇巴因組(10 nmol/L)，培養(yǎng)達(dá)24 h，Hoechst 33258染色后，在熒光顯微鏡下，正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色，而10 nmol/L哇巴因組的細(xì)胞中有核固縮現(xiàn)象發(fā)生。(圖3)

注:與對照組(0nmol/L哇巴因)比較,aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001圖2 不同濃度哇巴因不同作用時間對HPC增殖、凋亡的影響

圖3 熒光染色可觀察到HPC凋亡時發(fā)生核固縮現(xiàn)象

表1 不同濃度的哇巴因不同培養(yǎng)時間對HPC增殖和凋亡作用

注：與對照組(0 nmol/L哇巴因)比較，aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001

三、哇巴因活化NKAα1/Src誘導(dǎo)nephrin的表達(dá)下調(diào)

不同濃度(0 nmol/L，0.1 nmol/L，1 nmol/L，10 nmol/L，100 nmol/L)哇巴因刺激HPC 24 h后，收集各個濃度的細(xì)胞，采用蛋白免疫印跡法檢測NKAα1、p-Src、nephrin的表達(dá)情況?？捎^察到哇巴因不同濃度誘導(dǎo)HPC中NKAα1、p-Src的表達(dá)先上調(diào)再下降，同時可觀察到nephrin蛋白表達(dá)逐漸減少。(圖4)

四、PP2阻斷Src活化、抑制nephrin的表達(dá)下調(diào)

采用蛋白免疫印跡檢測p-Src、nephrin蛋白表達(dá)，可觀察到PP2提前干預(yù)HPC后，p-Src蛋白表達(dá)下調(diào)，并可逆轉(zhuǎn)哇巴因誘導(dǎo)的nephrin蛋白表達(dá)下調(diào)，增加nephrin表達(dá)量。(圖5)

注:1～5分別代表0、0.1、1、10、100nmol/L哇巴因圖4 不同濃度哇巴因?qū)PC細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

注:1為對照組(0nmol/L哇巴因);2為0.1nmol/L哇巴因組;3為10nmol/L哇巴因組;4為1μmol/LPP2組;5為1μmol/LPP2+0.1nmol/L哇巴因組;6為1μmol/LPP2+10nmol/L哇巴因組圖5 Src激酶抑制劑PP2對HPC蛋白表達(dá)的影響

討 論

CTS又稱洋地黃類物質(zhì)，包括植物來源的地高辛、哇巴因和動物來源的布法林(Bufalin)、海蟾蜍毒素(marinobufagenin，MBG)等兩大類，近年來發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)亦存在該類物質(zhì)(如哇巴因、MBG等)，稱為內(nèi)源性CTS。CTS存在于心、肝、腎、腦等組織及血漿、尿液與腦脊液中，在體內(nèi)主要由腎上腺、下丘腦及胎盤等產(chǎn)生和分泌，其產(chǎn)生和分泌受到多種生理和病理因素的調(diào)節(jié)，比如鹽攝入增加、妊娠，血管緊張素Ⅱ、促腎上腺皮質(zhì)激素刺激等。CTS在血漿中主要以游離形式和與蛋白質(zhì)結(jié)合形式存在，游離狀態(tài)CTS在體內(nèi)具有生物學(xué)活性，主要通過與NKA特異性結(jié)合，抑制NKA活性，即在泵功能上影響細(xì)胞的濃度梯度分布[3]。NKA是一種廣泛存在于真核細(xì)胞膜上的膜結(jié)合蛋白，主要由四個α亞基(α1、α2、α3、α4)、3個β亞基(β1、β2、β3)和γ亞基組成，每個亞基發(fā)揮著不同的生理作用，α亞基是催化酶反應(yīng)的亞基，在組織中特異表達(dá)，其中，α1亞基是占據(jù)主導(dǎo)地位的，幾乎在高等動物所有細(xì)胞都有表達(dá)，β亞基的主要功能是在細(xì)胞質(zhì)膜上穩(wěn)定α亞基的蛋白構(gòu)型以及調(diào)節(jié)α亞基的活性，γ亞基對已結(jié)合的αβ二聚體發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。近來發(fā)現(xiàn)NKA除了其經(jīng)典的泵功能，即參與Na+和K+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)外，還具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能[4]，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能主要由α亞基尤其是α1亞基參與。Src家族激酶是膜相關(guān)的非受體酪氨酸蛋白激酶，在NKA和Src結(jié)合的復(fù)合物中NKA的α亞基與CTS結(jié)合后，Src的激酶結(jié)構(gòu)域被釋放出，Src得以活化，進(jìn)而激活下游信號級聯(lián)。在這個過程中，可以把NKA/Src復(fù)合物看作一種“二元”受體，受到CTS作用后間接地影響下游蛋白的磷酸化過程，從而介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]，參與心臟及腎臟相關(guān)疾病的發(fā)病過程。

CTS對細(xì)胞生長具有重要的調(diào)節(jié)作用，研究顯示CTS在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、凋亡及纖維化中具有重要作用。目前已有研究證實CTS與NKA結(jié)合后可激活一系列下游信號通路，從而選擇性抑制腫瘤細(xì)胞增殖或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[6-7]，而正常細(xì)胞不受影響，因此具有抗腫瘤活性。在多種血管平滑肌細(xì)胞系、豬腎小管上皮細(xì)胞-LLC-PK1細(xì)胞系等，CTS可刺激細(xì)胞增殖[6,8]。因此，CTS對不同細(xì)胞的生長具有特異性，既可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖，也可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，且這些效應(yīng)是由于細(xì)胞表達(dá)鈉鉀ATP酶α1(Na+-K+-ATPase α1，NKAα1)亞基的量不同所造成的[6-7]。哇巴因?qū)?xì)胞生長的調(diào)節(jié)除了具有上述的特異性，對同種細(xì)胞還具有雙重效應(yīng)，在低濃度時促進(jìn)細(xì)胞增殖，在較高濃度則促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且在人成纖維細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞上均得到證實[9-10]。諸多研究顯示CTS在諸多疾病及動物模型中升高，如透析患者及部分腎切除所模擬的慢性腎衰竭模型等[11-12]。我們前期研究[13]證實MBG在尿毒癥心肌病變中表達(dá)上調(diào)，NKAα1亞基的量決定細(xì)胞存活和凋亡的方向，更進(jìn)一步證實了上述研究結(jié)果。有研究[14-15]發(fā)現(xiàn)MBG能誘導(dǎo)心腎纖維化，抗MBG抗體可減弱纖維化發(fā)生。內(nèi)源性哇巴因在慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)患者體內(nèi)表達(dá)上調(diào)[16]，MBG可誘導(dǎo)豬腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-to-mesenchymaltransition，EMT)，在大鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)腎纖維化[17]。近年研究發(fā)現(xiàn)心臟手術(shù)前哇巴因高水平患者易發(fā)生亞臨床腎損害，并極有可能因麻醉或手術(shù)而加重，增加心臟手術(shù)后急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)的發(fā)生率，因而術(shù)前循環(huán)哇巴因水平可強(qiáng)烈預(yù)測AKI的發(fā)生或作為AKI臨床風(fēng)險評分因子，哇巴因可能直接引起腎損傷[18]。研究還發(fā)現(xiàn)，術(shù)前和術(shù)后哇巴因可作為心力衰竭的標(biāo)志物，甚至可預(yù)測術(shù)后發(fā)生心血管事件風(fēng)險，不僅具有診斷性意義，還為心力衰竭的治療提供了方向[19]。另外，研究還發(fā)現(xiàn)哇巴因的持續(xù)升高，可降低肌酐清除率，增加尿蛋白排泄，減少選擇性足細(xì)胞標(biāo)記蛋白nephrin的表達(dá)，引起足細(xì)胞損害和蛋白尿[18]，關(guān)于哇巴因如何調(diào)節(jié)LN中足細(xì)胞nephrin蛋白的表達(dá)機(jī)制尚不明確。

LN是系統(tǒng)性紅斑狼瘡累及腎臟的常見及嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，雖然糖皮質(zhì)激素聯(lián)合細(xì)胞毒藥物已廣泛應(yīng)用于治療中，并被公認(rèn)為是經(jīng)典的治療方案，但持續(xù)使用免疫抑制劑帶來的不良后果一直是治療中難以避免的問題。因此，針對LN的發(fā)病機(jī)制尋找具有多靶點(diǎn)作用、療效機(jī)制明確的新型藥物，從而減少對免疫抑制劑的依賴，一直是國內(nèi)外腎臟病學(xué)者最為關(guān)注的熱點(diǎn)問題。

現(xiàn)有的研究表明，LN的發(fā)病機(jī)制中除了免疫調(diào)節(jié)的紊亂外，其腎臟局部細(xì)胞的功能失調(diào)也是造成疾病進(jìn)展的重要原因之一，細(xì)胞凋亡的異常與LN的發(fā)病密切相關(guān)已有相關(guān)報道[20]。足細(xì)胞是腎小球固有細(xì)胞的重要組成部分，和內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球基底膜共同組成腎小球濾過屏障。足細(xì)胞損傷在LN發(fā)病過程中有重要作用，可引起足細(xì)胞源性的蛋白尿的發(fā)生[1]。nephrin蛋白是足細(xì)胞裂隙膜關(guān)鍵分子之一，參與構(gòu)成腎小球濾過屏障，已有研究顯示nephrin分子與蛋白尿及濾過屏障密切相關(guān)[21-22]，nephrin的合成或分布異常是腎小球疾病蛋白尿形成機(jī)制中關(guān)鍵的因素之一。在不同腎臟疾病中，nephrin蛋白分布均有異常，除了在阿霉素腎病模型中有報道nephrin蛋白表達(dá)是上升的，在常見腎病及模型中表達(dá)下降，關(guān)于nephrin在LN腎組織中的表達(dá)結(jié)果不一。Huh等[23]報道顯示LN患者腎活檢組織中nephrin表達(dá)減少。nephrin可通過Src家族激酶起到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，NKA在腎臟除了富集于近端腎小管上皮細(xì)胞、集合小管細(xì)胞外，在足細(xì)胞亦表達(dá)NKA。目前關(guān)于哇巴因在LN中對人足細(xì)胞及nephrin表達(dá)的作用尚不清楚?；谝陨系难芯炕A(chǔ)，我們設(shè)計了此課題，在本結(jié)果中采用免疫組織化學(xué)法檢測到nephrin在正常對照腎組織中沿腎小球基底膜外側(cè)呈均勻、線狀分布，在LN腎組織中分布不均，甚至出現(xiàn)線性消失，且LN腎活檢組織中nephrin表達(dá)較正常對照組明顯減弱，這與Huh等[23]的報道是一致的；體外實驗研究發(fā)現(xiàn)哇巴因可以誘導(dǎo)HPC凋亡，不同濃度的哇巴因刺激HPC不同時間后可觀察到哇巴因以時間和劑量依賴的形式誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡發(fā)生，其中，10 nmol/L哇巴因刺激HPC 24 h后可以觀察到細(xì)胞中有核固縮現(xiàn)象發(fā)生，意味著HPC發(fā)生凋亡；蛋白免疫印跡法可以檢測到隨著哇巴因濃度的增加，NKA α1、p-Src的表達(dá)先增加后減少，同時我們也檢測到了nephrin的表達(dá)逐漸減少，采用Src家族激酶抑制劑PP2預(yù)處理HPC，阻斷哇巴因?qū)rc的活化，可逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)，逐漸恢復(fù)nephrin的表達(dá)，使nephrin表達(dá)增加。我們的研究證實了哇巴因可以通過NKA/Src信號通路下調(diào)nephrin表達(dá)，誘導(dǎo)LN患者足細(xì)胞凋亡，參與LN發(fā)病，可能是LN發(fā)生足細(xì)胞源性的蛋白尿的原因之一。

本研究集中在體外實驗對部分機(jī)制的探討，雖涉及組織標(biāo)本，但是仍缺乏狼瘡動物模型對該機(jī)制的進(jìn)一步證實，不過這也是我們接下來需要深入研究的部分。另外，該研究對LN中哇巴因誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的機(jī)制探討尚不完全，需要進(jìn)一步深入研究，為LN的治療提供更多的治療靶點(diǎn)。產(chǎn)生蛋白尿機(jī)制的研究表明nephrin表達(dá)減少會造成足細(xì)胞凋亡、脫落和融合，采取有效的措施保護(hù)足細(xì)胞，阻斷nephrin的減少，將為治療LN患者足細(xì)胞源性的蛋白尿提供新的可能靶點(diǎn)，有助于延緩LN患者病情進(jìn)展。

[1] Rezende GM, Viana VS, Malheiros DM, et al. Podocyte injury in pure membranous and proliferative lupus nephritis: distinct underlying mechanisms of proteinuria?[J]. Lupus, 2014, 23(3): 255-262.

[2] Gutierrez S, Petiti JP, De Paul AL, et al. Lupus-related podocytopathy. Could it be a new entity within the spectrum of lupus nephritis?[J]. Nefrologia, 2012, 32(2): 245-246.

[3] Wang HY, O’doherty GA. Modulators of Na/K-ATPase: a patent review[J]. Expert Opin Ther Pat, 2012, 22(6): 587-605.

[4] Lingre JB. The physiological significance of the cardiotonic steroid/ouabain-binding site of the Na,K-ATPase[J]. Annu Rev Physiol, 2010, 72:395-412.

[5] Tian J, Cai T, Yuan Z, et al. Binding of Src to Na+/K+-ATPase forms a functional signaling complex[J]. Mol Biol Cell, 2006, 17(1): 317-326.

[6] Tian J, Li X, Liang M, et al. Changes in sodium pump expression dictate the effects of ouabain on cell growth[J]. J Biol Chem, 2009, 284(22): 14921-14929.

[7] Chen Y, Li M, Li Z, et al. Bufalin induces apoptosis in the U2OS human osteosarcoma cell line via triggering the mitochondrial pathway[J]. Mol Med Rep, 2016, 13(1): 817-822.

[8] Allen JC, Abramowitz J, Koksoy A. Low concentrations of ouabain activate vascular smooth muscle cell proliferation[J]. Ann N Y Acad Sci, 2003, 986: 504-508.

[9] Ren YP, Zhang MJ, Zhang T, et al. Dual effects of ouabain on the regulation of proliferation and apoptosis in human umbilical vein endothelial cells: involvement of Na+-K+-ATPase alpha-subunits and NF-kappaB[J]. Int J Clin Exp Med, 2014, 7(5): 1214-1222.

[10]Winnicka K, Bielawski K, Bielawska A, et al. Dual effects of ouabain, digoxin and proscillaridin A on the regulation of apoptosis in human fibroblasts[J]. Nat Prod Res, 2010, 24(3): 274-285.

[11]Tian J, Shidyak A, Periyasamy SM, et al. Spironolactone attenuates experimental uremic cardiomyopathy by antagonizing marinobufagenin[J]. Hypertension, 2009, 54(6): 1313-1320.

[12]Kolmakova EV, Haller ST, KennedyDJ, et al. Endogenous cardiotonic steroids in chronic renal failure [J]. Nephrol Dial Transplant, 2011, 26(9): 2912-2919.

[13]LiuC, Bai Y, Chen Y, et al. Reduction of Na/K-ATPase potentiates marinobufagenin-induced cardiac dysfunction and myocyte apoptosis[J]. J Biol Chem, 2012, 287(20): 16390-16398.

[14]Haller ST, Drummond CA, Yan Y, et al. Passive immunization against marinobufagenin attenuates renal fibrosis and improves renal function in experimental renal disease[J]. Am J Hypertens, 2014, 27(4): 603-609.

[15]Haller ST, Kennedy DJ, Shidyak A, et al. Monoclonal antibody against marinobufagenin reverses cardiac fibrosis in rats with chronic renal failure [J]. Am J Hypertens, 2012, 25(6): 690-696.

[16]Stella P, Manunta P, Mallamaci F, et al. Endogenous ouabain and cardiomyopathy in dialysis patients[J]. J Intern Med, 2008, 263(3): 274-280.

[17]Fedorova LV, Raju V, El-okdi N, et al. The cardiotonic steroid hormone marinobufagenin induces renal fibrosis: implication of epithelial-to-mesenchymal transition[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2009, 296(4): F922-F934.

[18]Bignami E, Casamassima N, Frati E, et al. Preoperative endogenous ouabain predicts acute kidney injury in cardiac surgery patients [J]. Crit Care Med, 2013, 41(3): 744-755.

[19]Simonini M, Pozzoli S, Bignami E, et al. Endogenous Ouabain: An Old Cardiotonic Steroid as a New Biomarker of Heart Failure and a Predictor of Mortality after Cardiac Surgery[J]. Biomed Res Int, 2015, 2015:714793.

[20]Makino H, Sugiyama H, Yamasaki Y, et al. Glomerular cell apoptosis in human lupus nephritis[J]. Virchows Arch, 2003, 443(1): 67-77.

[21]Shankland SJ. The podocyte's response to injury: role in proteinuria and glomerulosclerosis[J]. Kidney Int, 2006, 69(12): 2131-2147.

[22]Rajj L, Tian R, Wong JS, et al. Podocyte injury: the role of proteinuria, urinary plasminogen, and oxidative stress[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2016, 311(6): F1308-F1317.

[23]Huh W, Kim DJ, Kim MK, et al. Expression of nephrin in acquired human glomerular disease[J]. Nephrol Dial Transplant, 2002, 17(3): 478-484.

Molecular mechanism of ouabain-induced apoptosis in human podocytes

LOUMei-yu,LIUChang-xuan,CHENWen-li.

DepartmentofNephrology,WuhanCentralHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430014,China

CHENWen-li,E-mail:whwenli@163.com

Objective Podocyte apoptosis is involved in lupus nephritis (LN). Endogenous ouabain (EO), one of cardiotonicsteroids (CTS), is markedly up-regulated in chronic kidney disease (CKD) patients and is associated with epithelial-to-mesenchymal transition during renal fibrosis in the remnant kidney of 5/6 nephrectomy rats. This study is to explore the molecular mechanism of ouabain-induced apoptosis of human podocytes in LN.Methods (1) In the in vivo experiment, the expression of nephrin protein was detected by immunohistochemistry in renal biopsy specimens from patients with active LN whose SLEDAI scores were more than 5 and those as control group from normal renal tissues in patients with renal tumor after resection of the tumor tissues. (2) In the in vitro experiment, cultured podocytes were treated with different doses of ouabain (0, 0.1, 1, 5, 10 and 100 nmol/L) for different durations (24, 48 and 72 h). The MTT method was applied to assay cell proliferation and apoptosis. The apoptosis of podocytes was assessed by Hoechst 33258 staining. Western blotting was used to measure Na+-K+-ATPase α1 (NKAα1), p-Src and nephrin. The PP2 (1 μmol/L) was administered from 1 h before the addition of ouabain and continued throughout the 24 h. Western blotting was then employed to examine the expression of proteins above.Results (1) Ouabain induced human podocyte apoptosis in a dose- and time-dependent manner; (2) Nephrin staining showed an even pattern and the expression of nephrin decreased in LN as compared with controls whose nephrin showed an even and linear pattern; (3) Ouabain reduced the expression of nephrin through changing the expression of NKAα1 and p-Src; (4) Inhibition of Src kinase by PP2 increased the expression of p-Src and restored nephrin-expression.Conclusions Ouabain induced human podocyte apoptosis by NKAα1/Src complex decreasing nephrin.

Ouabain; Podocyte; Apoptosis; Lupus nephritis; Na+-K+-ATPase

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.03.004

國家自然科學(xué)基金(No.81400734)；湖北省自然科學(xué)基金(No.2015CFB241)

430014 武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院腎內(nèi)科

陳文莉，E-mail：whwenli@163.com

2017-01-22

2017-02-28)