蘿卜水通道蛋白基因RsAQP1b的表達(dá)模式及功能分析

周志國 馮 雪

（廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北廊坊 065000）

蘿卜水通道蛋白基因RsAQP1b的表達(dá)模式及功能分析

周志國 馮 雪

（廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北廊坊 065000）

以蘿卜品種白玉春為材料，利用同源克隆的方法獲得蘿卜水通道蛋白基因RsAQP1b的編碼序列全長，在蘿卜苗期干旱脅迫下分析RsAQP1b基因及蛋白的表達(dá)模式；在煙草中表達(dá)該基因，研究干旱脅迫下煙草中MDA含量及保護(hù)酶的活性變化。結(jié)果表明：蘿卜水通道蛋白基因RsAQP1b的編碼序列全長861 bp，編碼286個(gè)氨基酸。制備了RsAQP1b多克隆抗體，效價(jià)在1∶512 000以上。Real time PCR與Western blot檢測(cè)表明，干旱脅迫導(dǎo)致RsAQP1b基因與蛋白的表達(dá)水平整體下降。PEG6000干旱處理下的轉(zhuǎn)基因與野生型煙草MDA含量都增加，但是轉(zhuǎn)基因煙草的增加幅度??；隨著干旱程度加重，轉(zhuǎn)RsAQP1b基因煙草中SOD含量呈上升趨勢(shì)，CAT含量呈先上升后下降趨勢(shì)，POD含量呈上升趨勢(shì)，酶活性均高于相應(yīng)野生型對(duì)照。

蘿卜；水通道蛋白；表達(dá)模式；過表達(dá)

蘿卜（Raphanus sativusL.）是我國重要的根菜類蔬菜作物。水通道蛋白AQP（aquaporin）屬于跨膜通道蛋白MIP（major intrinsic proteins）超家族，是細(xì)胞膜上選擇性高效轉(zhuǎn)運(yùn)分子特異的孔道蛋白，廣泛分布在植物發(fā)育各個(gè)時(shí)期的各種組織與器官中，介導(dǎo)細(xì)胞的水分跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，在水分運(yùn)輸過程中起到非常重要的作用（Verdoucq et al.，2014）。苗期遭受水分脅迫，容易造成蘿卜生理性病害，嚴(yán)重影響生長后期肉質(zhì)根的產(chǎn)量與品質(zhì)。研究蘿卜水通道蛋白，對(duì)選育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)的蘿卜新品種有重要意義。1988年，Agre等在人紅細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)一個(gè)28 kD的跨膜多肽（Denker et al.，1998），直到1992年分離出第一個(gè)水通道蛋白（Preston et al.，1992）。迄今，已在擬南芥（Kaldenhoff et al.，1995）、煙草（Sade et al.，2010）、馬鈴薯（Ibanez et al.，2014）、辣椒（陳儒鋼 等，2010）、番茄（李仁 等，2012）、香蕉（Xu et al.，2014）、水稻（Ahamed et al.，2012）、小麥（Pandey et al.，2013）、多年生黑麥草（周春蕾 等，2013）、蘿卜（Suga et al.，2001）等多種植物中克隆并研究了水通道蛋白的功能。Suga等（2001）從蘿卜cDNA中克隆出了水通道蛋白家族成員PAQ1、PAQ1b、PAQ1c、PAQ2、PAQ2b、PAQ2c，這些蛋白在蘿卜植株、花、種子、下胚軸及主根中都有顯著的積累；研究還發(fā)現(xiàn)水通道蛋白亞型基因表達(dá)有器官與組織特異性，各個(gè)亞型的水通道蛋白在不同器官中的表達(dá)水平不同。研究表明，在干旱、寒冷、鹽等逆境條件下，植株通過調(diào)控水通道蛋白的活性來抵御各種脅迫（Moshelion et al.，2015）。許多學(xué)者通過轉(zhuǎn)基因的方法使AQPs過表達(dá)來提高植株對(duì)非生物脅迫的抗性（Gao et al.，2010；Tsuchihira et al.，2010）。目前有關(guān)干旱脅迫下蘿卜水通道蛋白基因與蛋白表達(dá)模式及功能分析的研究較少。本試驗(yàn)以蘿卜品種白玉春為材料，利用同源克隆的方法得到蘿卜水通道蛋白基因RsAQP1b的編碼序列全長，并研究基因與蛋白在干旱脅迫下的表達(dá)模式，通過在煙草中過表達(dá)，研究其在干旱脅迫下丙二醛（MDA）含量的積累與保護(hù)酶的活性變化，為蘿卜抗逆育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2014年6月至2015年4月在河北省廊坊師范學(xué)院進(jìn)行，選用韓國蘿卜品種白玉春作為試材，該品種屬于水分脅迫敏感材料，干旱脅迫下的蛋白表達(dá)變化較為明顯。選用內(nèi)徑33 cm的塑料盆，分別裝相同的風(fēng)干土，土壤田間最大持水量為26%，pH值7.0，有機(jī)質(zhì)含量2.01%，全氮0.062%。待蘿卜幼苗長到5～6 cm時(shí)采用水分脅迫法對(duì)幼苗進(jìn)行干旱處理。

設(shè)正常供水（CK）、輕度干旱（LS）、中度干旱（MS）和重度干旱（SS）4個(gè)處理，其土壤相對(duì)含水量分別為土壤田間最大持水量的70～80%、60～70%、50～60%和35～45%，每個(gè)處理3次重復(fù)。每天8：00～12：00采用稱重法補(bǔ)水控水，土壤相對(duì)含水量持續(xù)達(dá)到上述干旱脅迫條件7 d后取樣，液氮速凍，置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RsAQP1b基因編碼序列的獲得

采用Trizol法分別提取4個(gè)處理苗期葉片總RNA，采用cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)已公布的蘿卜水通道蛋白的編碼序列，設(shè)計(jì)引物〔引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成〕（表1）。采用RT-PCR技術(shù)以第一鏈cDNA為模板，以RsAQP1bF1與RsAQP1bR1為引物擴(kuò)增該基因的編碼序列。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收，連接到pMD19-T（TaKaRa）克隆載體上測(cè)序。通過NCBI的blastn與blastp對(duì)基因與蛋白序列進(jìn)行分析，把鑒定正確的質(zhì)粒命名為p19T-RsAQP1b。

1.3 RsAQP1b原核表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白純化

PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體經(jīng)酶切后由T4 DNA ligase連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，鑒定后挑取陽性克隆測(cè)序，經(jīng)序列比對(duì)確定為RsAQP1b基因，說明該基因的表達(dá)載體已構(gòu)建成功。

植物AQPs的功能主要有促進(jìn)水分吸收和遠(yuǎn)距離運(yùn)輸；在逆境應(yīng)答等過程中促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)外的跨膜水分運(yùn)輸，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外水分平衡；調(diào)節(jié)細(xì)胞的脹縮及運(yùn)輸其他小分子物質(zhì)。植物AQPs在響應(yīng)外界環(huán)境刺激如干旱、鹽堿和低溫中起著重要的作用（Moshelion et al.，2015）。

將帶有p28a-RsAQP1b質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3）接種于LB液體培養(yǎng)基中，以含空載體質(zhì)粒的大腸桿菌BL21為陰性對(duì)照，于37 ℃震蕩培養(yǎng)3 h，用終濃度為1 mmol·L-1的IPTG對(duì)蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，18 ℃誘導(dǎo)12 h后收集菌體，用1/10體積的PBS溶解菌體，同時(shí)加蛋白酶抑制劑PMSF至終濃度為1 mmol·L-1，4 ℃、 10 000 r·min-1離心15 min，棄上清液，沉淀進(jìn)行超聲波破碎，檢測(cè)包涵體內(nèi)是否有蛋白存在。將獲得的蛋白質(zhì)溶液用Ni親和（GE公司）柱進(jìn)行純化，SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白提取及純化。將純度在95%（電泳純）以上的目的蛋白用PBS透析，用PEG20000對(duì)透析后的蛋白進(jìn)行濃縮，并用BCA法進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定。

劉少奇同志是偉大的馬克思主義者，偉大的無產(chǎn)階級(jí)革命家、政治家、理論家，黨和國家主要領(lǐng)導(dǎo)人之一，中華人民共和國開國元?jiǎng)?，是黨的第一代中央領(lǐng)導(dǎo)集體的重要成員。劉少奇同志的英名，同中國人民、中國共產(chǎn)黨、中華人民共和國波瀾壯闊的奮斗歷史緊密相連。他為中國革命和建設(shè)事業(yè)殫精竭慮、嘔心瀝血，在經(jīng)濟(jì)、政治、軍事、文化、教育、外交和黨的建設(shè)等領(lǐng)域都建立了卓著功勛，受到全黨全軍全國各族人民衷心愛戴。

1.4 多克隆抗體制備

Aroca R，Porcel R，Ruiz-Lozano J M．2012．Regulation of root water uptake under abiotic stress conditions．J Exp Bot，63（1）：43-57．

1.5 RsAQP1b基因的表達(dá)分析

采用德國西門子PLC公司生產(chǎn)的S7200 CPU22X系列產(chǎn)品，其可靠性、擴(kuò)展性、維護(hù)性等功能良好[10]，實(shí)現(xiàn)了樣機(jī)電磁閥的控制及各設(shè)備操作程序要求功能。系統(tǒng)由接近開關(guān)傳感器、電磁閥、調(diào)壓電源、電器控制柜等組成了硬件控制電路，軟件設(shè)計(jì)包括輸入/輸出分配表、程序流程圖的編寫等，最后結(jié)合硬件進(jìn)行調(diào)試。PLC程控電路見圖10。

1.6 Western blot檢測(cè)干旱脅迫下RsAQP1b蛋白表達(dá)

采用RIPA裂解液（碧云天生物技術(shù)有限公司）提取各干旱處理及對(duì)照的蘿卜葉片蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，并將蛋白調(diào)整成統(tǒng)一的濃度進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的anti-RsAQP1b抗體，4 ℃雜交過夜。將PBST清洗后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔（1∶4 000稀釋）二抗，室溫放置2 h，PBST清洗后進(jìn)行曝光。內(nèi)參選用plant β-actin（1∶2 000稀釋，天德悅生物科技有限公司）。用Quantity One圖像分析軟件分析目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶的光密度值。用β-actin對(duì)RsAQP1b的表達(dá)進(jìn)行半定量分析。

1.7 RsAQP1b過表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因煙草的獲得

由圖7可以看出，野生型煙草植株SOD活性呈先升后降趨勢(shì)，而轉(zhuǎn)基因植株SOD活性則逐漸上升；CAT活性在2種植株中均呈先上升后下降趨勢(shì)，只是活性達(dá)最大時(shí)的脅迫濃度不同；而POD活性均呈上升趨勢(shì)，但轉(zhuǎn)基因植株的增加幅度高于野生型。

1.8 轉(zhuǎn)基因煙草葉片在干旱條件下脂質(zhì)過氧化及保護(hù)酶活性測(cè)定

垃圾經(jīng)柴油機(jī)煙氣干燥后可以全部焚燒，參照城市生活垃圾焚燒成本，因工藝不同處理費(fèi)用為 60～250 元 /t［20］不等，取平均值為 155 元 /t，垃圾干燥器運(yùn)營成本（主要為工人工資）取32.5萬元（5人計(jì)，工資5萬元/人，社保30%計(jì)），折舊費(fèi)取14.3萬元，每年焚燒成本為：

當(dāng)轉(zhuǎn)基因與野生型煙草幼苗長到3～4片真葉時(shí)，選擇整齊均一的幼苗，移到Hoagland營養(yǎng)液中緩苗2 d。在相同的溫度、光照等條件下，用濃度梯度分別為0、10%、20%和30%（m∶V）的PEG 6000溶液進(jìn)行人工模擬干旱處理，對(duì)應(yīng)的水勢(shì)分別為-0.05×106、-0.25×106、-0.65×106、-1.25×106Pa。每個(gè)處理3次重復(fù)，24 h后取樣檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

葉片中丙二醛（MDA）含量采用TBA法測(cè)定，分別用羥胺法、可見光法與比色法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）與過氧化物酶（POD）活性（南京建成生物工程研究所），具體方法按說明書操作。

感謝這次英國之旅，讓我比起其他同樣來英國游學(xué)的孩子多了一份特別的體驗(yàn)，相比走馬觀花的游玩，這樣深入體驗(yàn)的學(xué)習(xí)讓我更加歡喜！希望還能再來英國，體驗(yàn)更多他們的校園生活！

1.9 數(shù)據(jù)處理

隨著國家食品安全監(jiān)管的不斷加強(qiáng)，加上農(nóng)業(yè)部推行的“動(dòng)物用抗菌素減量化使用”行動(dòng)，抗生素的使用趨于規(guī)范化，藥物飼料添加劑也逐漸地退出，以往的蛋雞疾病防控措施已經(jīng)不再適用，由于抗生素的不規(guī)范使用造成的雞蛋藥物殘留超標(biāo)問題已經(jīng)成了許多蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)的噩夢(mèng)，許多養(yǎng)殖場(chǎng)因此受到了處罰，甚至還有的面臨著牢獄之災(zāi)。那么面對(duì)臨床疾病該如何控制藥物殘留就值得每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)去認(rèn)真思考——

組間比較采用單因素方差分析（ANONA）法，使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RsAQP1b基因的擴(kuò)增及序列分析

通過RT-PCR法從蘿卜cDNA中擴(kuò)增出約860 bp的片段，將目的片段3′ 端加尾，經(jīng)回收后連接到克隆載體上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，RsAQP1b的CDS全長861 bp，編碼286個(gè)氨基酸。Blast分析表明，該基因與已發(fā)表的蘿卜AQP1b（AB030695.1）序列同源性達(dá)99%，蛋白保守區(qū)與已知基因的氨基酸序列的MIP蛋白保守區(qū)序列一致，證明擴(kuò)增結(jié)果即為目的基因。

2.2 RsAQP1b原核表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白表達(dá)與純化

以質(zhì)粒p19T-RsAQP1b為模板，以RsAQP1bF2與RsAQP1bR2為引物擴(kuò)增RsAQP1b基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與pET28a（+）載體分別用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ與XhoⅠ（Biolabs）于37 ℃下酶切3 h，回收目的片段與載體，通過T4 DNA ligase（Biolabs）連接后測(cè)序，將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為p28a-RsAQP1b。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)鑒定后挑取陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。

表達(dá)菌株經(jīng)37 ℃震蕩培養(yǎng)3 h后，18 ℃經(jīng)IPTG誘導(dǎo)12 h，提取蛋白質(zhì)，并對(duì)誘導(dǎo)后的菌體進(jìn)行超聲波破碎，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，得到分子量約為30 kD的蛋白條帶（圖1），通過對(duì)超聲后上清與沉淀進(jìn)行電泳，結(jié)果表明RsAQP1b蛋白是可溶性表達(dá)。

重組蛋白用Ni柱進(jìn)行親和純化，用咪唑進(jìn)行梯度洗脫（圖1）。當(dāng)咪唑濃度達(dá)到300 mmol·L-1時(shí)，得到30 kD的單一條帶，電泳純度在95%左右。因此選擇300 mmol·L-1咪唑洗脫的產(chǎn)物進(jìn)行透析、濃縮與濃度測(cè)定。

圖1 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與純化結(jié)果

2.3 多克隆抗體制備

利用Real time PCR檢測(cè)干旱脅迫下RsAQP1b基因的表達(dá)模式。以不同干旱脅迫處理樣本的cDNA為模板，以RsAQP1bF3與RsAQP1bR3（表1）為引物，以蘿卜的看家基因β-actin F/R為內(nèi)參，采用ABI 7500熒光定量PCR儀對(duì)該基因在不同干旱脅迫下的表達(dá)進(jìn)行分析。按照SYBR premix Ex TaqTM（TaKaRa）試劑盒說明書操作，每個(gè)樣品3次重復(fù)，采用2-ΔΔCT法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。

以重組蛋白為抗原，免疫新西蘭家兔得到該蛋白的多克隆抗體，經(jīng)Elisa檢測(cè)多抗的效價(jià)，結(jié)果顯示該蛋白多克隆抗體的效價(jià)達(dá)1∶512 000以上。由圖2可以看出，抗體純度在95%以上。BCA法定量的濃度為0.51 mg·mL-1。

圖2 純化的抗體SDS-PAGE電泳結(jié)果

2.4 干旱脅迫下RsAQP1b基因的表達(dá)分析

由圖3可以看出，隨著干旱脅迫的加重，蘿卜幼苗RsAQP1b基因表達(dá)量逐漸降低，其中中度干旱與重度干旱處理下，RsAQP1b基因表達(dá)量顯著低于對(duì)照，分別比對(duì)照降低了26.32%與33.81%。

圖3 干旱脅迫下RsAQP1b基因表達(dá)分析

2.5 Western blot檢測(cè)干旱脅迫下RsAQP1b蛋白的表達(dá)

現(xiàn)階段，我國一些對(duì)于互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)的應(yīng)用不夠重視，對(duì)其運(yùn)用也不熟練，所以很多企業(yè)并沒有設(shè)置管理會(huì)計(jì)這一崗位。因?yàn)樗麄冃畔⒉煌晟?，沒有意識(shí)到這一職位對(duì)企業(yè)的影響力，公司的整理體制不夠完善，導(dǎo)致了企業(yè)數(shù)據(jù)信息不合理與不可靠，不注重先進(jìn)技術(shù)給公司帶來的效益，讓企業(yè)在根本上就失去了核心競(jìng)爭(zhēng)力。所以現(xiàn)下的企業(yè)要想謀求發(fā)展，就必須從根本上進(jìn)行改變，要學(xué)會(huì)應(yīng)用技術(shù)簡(jiǎn)化工作流程。

由圖4、5可以看出，干旱脅迫處理的蘿卜幼苗RsAQP1b蛋白表達(dá)量呈整體下降趨勢(shì)，與Realtime PCR結(jié)果一致。

圖4 Western blot 檢測(cè)干旱處理后RsAQP1b蛋白表達(dá)

圖5 干旱脅迫下RsAQP1b蛋白表達(dá)分析

2.6 PEG6000處理后轉(zhuǎn)基因煙草中的MDA含量

干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草中MDA含量的影響如圖6所示，隨著PEG濃度增加，MDA含量持續(xù)增加，煙草受干旱傷害程度逐漸加重。但是轉(zhuǎn)RsAQP1b基因煙草MDA含量的增加幅度要比野生型小，野生型煙草各處理MDA含量分別比對(duì)照增加了74.54%、132.16和210.51%；轉(zhuǎn)RsAQP1b基因的煙草則分別增加了51.76%、79.81%和126.87%。

2.7 干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草葉片SOD 、POD與CAT活性的變化

以p19T-RsAQP1b質(zhì)粒為模板，用引物RsAQP1bF3與RsAQP1bR4（表1）擴(kuò)增基因片段，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ與EcoRⅠ（Biolabs）對(duì)純化的PCR產(chǎn)物與pCAMBIA1303載體進(jìn)行酶切，凝膠回收后通過T4 DNA ligase（Biolabs）連接，驗(yàn)證后送公司測(cè)序，把測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為p1303-RsAQP1b。將該質(zhì)粒通過凍融法轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105中。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將p1303-RsAQP1b質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至煙草中，轉(zhuǎn)化煙草苗使用潮霉素初篩，再經(jīng)過PCR驗(yàn)證。

圖6 不同濃度PEG處理后煙草葉片MDA含量

圖7 不同濃度PEG處理后煙草葉片SOD、CAT與POD活性變化

3 結(jié)論與討論

當(dāng)然，就目前中國民主政治的實(shí)際運(yùn)行狀況和效果而言，亦即歸結(jié)到黨領(lǐng)導(dǎo)制定憲法、自覺遵守憲法、提議修改憲法、推動(dòng)以釋憲方式提高憲法適應(yīng)性等問題而言，黨的領(lǐng)導(dǎo)體制和領(lǐng)導(dǎo)方式，人民代表大會(huì)制度的政治體制，都存在需要完善和進(jìn)一步改進(jìn)的地方。比如，如何進(jìn)一步發(fā)揮黨的領(lǐng)導(dǎo)和人民代表大會(huì)在法治進(jìn)程中的作用；如何遵照法治進(jìn)化規(guī)律，在黨的領(lǐng)導(dǎo)下和人大體制內(nèi)實(shí)施修憲和釋憲；如何在憲法法律框架內(nèi)規(guī)范黨的領(lǐng)導(dǎo)權(quán)力；如何保障全國人大及其常委會(huì)有序推進(jìn)憲法解釋權(quán)力的有效實(shí)施等，都關(guān)涉到有效增強(qiáng)憲法適應(yīng)性問題，并且需要通過構(gòu)建符合本國民主政治要求的修憲理論、釋憲理論和完善修憲、釋憲制度加以解決。

本試驗(yàn)通過RT-PCR方法獲得了編碼蘿卜質(zhì)膜水通道蛋白的基因RsAQP1b，基因與氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因與已發(fā)表的蘿卜AQP1b（AB030695.1）有99%的同源性，并且與已知蛋白具有相同的保守區(qū)域MIP。

由于pET28a（+）載體帶有T7強(qiáng)啟動(dòng)子與his標(biāo)簽，故可以利用親和層析的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)純化。本試驗(yàn)將RsAQP1b基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET28a（+）上，為了減少蛋白形成包涵體，采用低溫誘導(dǎo)的方法，用終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，18 ℃誘導(dǎo)12 h，RsAQP1b蛋白表現(xiàn)大量的可溶性表達(dá)。利用Ni柱純化蛋白，得到電泳純度在95%左右的RsAQP1b蛋白，并制備了該蛋白的多克隆抗體，本試驗(yàn)利用抗原親和純化的方法純化該抗體，除去了其他的雜抗體，減少Western blot過程中的非特異性結(jié)合。

研究表明，在逆境條件下，為了維持水分平衡，增加對(duì)外界脅迫的耐受能力，植物體內(nèi)大多數(shù)AQPs的轉(zhuǎn)錄水平降低，同時(shí)其蛋白活性下降甚至消失（Aroca et al.，2012）。然而由于植物種類的不同及其所選擇的水分脅迫方式不同，APQs對(duì)水分脅迫的響應(yīng)機(jī)理也不盡相同。不同的AQPs在相同的脅迫下表達(dá)模式不同，相同的亞群在不同的脅迫下有可能呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式（Alexandersson et al.，2005；Guo et al.，2006）。APQs對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)表達(dá)模式是多層面的。陳儒鋼等（2010）從辣椒材料中克隆了水通道蛋白基因CaAQP，并對(duì)耐寒品系P70進(jìn)行了低溫脅迫處理，結(jié)果表明隨著脅迫時(shí)間的延長，CaAQP表達(dá)量呈急劇下降趨勢(shì)。Mahdieh等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，煙草的NtPIP1；1和NtPIP2；1轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào)，而NtAQP1的轉(zhuǎn)錄水平則有所上調(diào)；周春蕾等（2013）對(duì)多年生黑麥草LpAQP基因在干旱脅迫下表達(dá)模式分析表明，持續(xù)干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致LpAQP基因表達(dá)量先上升后下降，這與李仁等（2012）在番茄上研究AQP表達(dá)模式的結(jié)果一致。Laur和Hacke（2014）的研究表明，毛果楊在水分脅迫過程中引起所有類型的AQPs都下調(diào)表達(dá)。顏培玲等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，抗旱性強(qiáng)的毛葡萄品種花溪-9PIP1基因的表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間的延長先增加后降低，而不抗旱的歐亞種紅地球PIP1的表達(dá)量呈下降的趨勢(shì)。夏宗良等（2013）從煙草中克隆了一個(gè)水通道蛋白基因NtTIP1的編碼區(qū)，在20% PEG6000誘導(dǎo)的干旱脅迫條件下，NtTIP1在耐旱品種中顯著上調(diào)表達(dá)，而在干旱敏感品種中顯著下調(diào)表達(dá)。此外，在幾個(gè)轉(zhuǎn)基因材料中也有類似的研究報(bào)道，過表達(dá)AQPs會(huì)增加或降低轉(zhuǎn)基因植物對(duì)脅迫的耐受性。例如，小麥與水稻轉(zhuǎn)AQPs基因提高了轉(zhuǎn)基因植物對(duì)干旱與鹽堿的耐受能力（Gao et al.，2010；Hu et al.，2012），番茄轉(zhuǎn)S1TIP2；2與人參轉(zhuǎn)PgTIP1基因能提高轉(zhuǎn)基因植物抗鹽與抗干旱能力（Sade et al.，2009）。相反，過表達(dá)一些AQPs降低了轉(zhuǎn)基因植物抗鹽與抗寒能力（Katsuhara et al.，2003；Wang et al.，2011），而且過表達(dá)AQP引起植物對(duì)其中一種脅迫的敏感性，但是增加了對(duì)其他脅迫的耐受力。

本試驗(yàn)通過Real time RT-PCR 與Western blot對(duì)蘿卜品種白玉春干旱脅迫下RsAQP1b基因與蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，隨著脅迫程度的增加，RsAQP1b基因與蛋白表達(dá)整體呈下降趨勢(shì)，與Laur和Hacke（2014）及夏宗良（2013）的研究結(jié)果相似。在煙草中過表達(dá)RsAQP1b基因，PEG6000干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草比野生型的MDA積累慢，SOD、CAT和POD活性均高于野生型。表明抗旱能力不強(qiáng)的植物可能是通過降低相關(guān)基因與蛋白的表達(dá)量來減少植物體內(nèi)水分的流失，從而維持植物體的水分平衡，提高植物對(duì)逆境的耐受力。本試驗(yàn)結(jié)果為探討蘿卜干旱脅迫機(jī)制與抗逆育種提供了重要的理論依據(jù)。

超臨界流體色譜技術(shù)在藥物分析領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展…………………………………………………… 張 元等（2）：283

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將純化的蛋白免疫2 kg雄性新西蘭大白兔，在免疫前取血清，作為陰性對(duì)照。4次免疫，每次間隔15～20 d，心臟取血，收集血清。用ELISA法檢測(cè)血清效價(jià)。用抗原親和的方法純化抗血清，用SDS-PAGE電泳檢測(cè)抗血清的純度，用BCA法測(cè)定濃度。

綜上所述，對(duì)小兒腹瀉采用精細(xì)化護(hù)理可以改善患兒腹瀉癥狀，提升臨床效果，減少并發(fā)癥的發(fā)生，具有一定推廣價(jià)值。

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地鐵使人們出行更加便捷，所以對(duì)房價(jià)影響較大。小區(qū)與地鐵站的間距每增加一千米，房價(jià)下降356元/m2，對(duì)住宅價(jià)格影響較顯著。交通軌道能使居住區(qū)的通達(dá)度得到提高，使沿線住房價(jià)格得到提高，為開辟和建造新居住區(qū)予以潛在的利潤保證，開發(fā)居住區(qū)的最佳位置大多數(shù)選擇在交通干道兩側(cè)和快速路進(jìn)出口周圍區(qū)域。

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（3）化學(xué)成分分析 在剝落塊的低倍試片上從表面、中部、內(nèi)部分別取樣進(jìn)行化學(xué)成分分析，分析結(jié)果及70Cr3Mo鋼的標(biāo)準(zhǔn)成分如表3所示。

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本系統(tǒng)電源模塊主要由12 V蓄電池供電，為整個(gè)系統(tǒng)提供兩種電源5 V和3.3 V，5 V電源主要為二氧化碳、氧氣傳感器供電，采用LM2596芯片，使外接電路的穩(wěn)定性和選擇性增強(qiáng)。3.3 V電源為單片機(jī)[6]系統(tǒng)、溫濕度傳感器、通信模塊供電。5 V電源如圖3所示。

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Expression Pattern and Functional Analysis of Aquaporin（RsAQP1b）in Raphanus sativus L.

ZHOU Zhi-guo，F(xiàn)ENG Xue

（LifeScienceDepartment，LangfangNormalCollege，Langfang065000，Hebei，China）

Taking the radish cultivar‘Baiyuchun’as material，this paper gained coded sequence of aquaporin geneRsAQP1bby homology-based cloning method；and analyzed the expression pattern ofRsAQP1bgene and protein under drought stress during radish seedling period，and studied the expression of this gene in tobacco，changes in MDA content and activity of protective enzyme under drought stress. The results indicated that CDS ofRsAQP1bwas 861 bp，encoding a protein of 286 amino acids. Polyclonal antibody of RsAQP1b was prepared and its titer was over 1∶512 000. Real time PCR and western blot detection showed that the expression level ofRsAQP1bgene and protein was down-regulated by drought stress. Under PEG6000 drought stress treatment，the MDA content in transgenic and wild type（WT）tobacco was all increased，but the increasing rage of transgenic tobacco was small. The content of SOD in transgenicRsAQP1btobacco showed an increasing tendency，while the CAT content showed a tendency of first rising then declining. The POD content showed an increasing tendency. The enzymatic activity was all exceeded that of the relevant CK of wide type.

Radish；Aquaporin；Expression pattern；Overexpression

周志國，男，講師，專業(yè)方向：蔬菜作物生物技術(shù)育種，E-mail：zhiguo__zhou@163.com

2016-04-19；接受日期：2017-02-21

河北省教育廳青年基金項(xiàng)目（QN2017351），廊坊師范學(xué)院校級(jí)項(xiàng)目（LSLQ201407），廊坊師范學(xué)院教改項(xiàng)目（K2015-13）