乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺誘導IN2-2啟動子在芥菜中的表達

周 雯 孫芳芳 杜楊梅 馬存發(fā) 朱陳曾 鄭 敏 任雪松 司 軍 宋洪元

（西南大學園藝園林學院，南方山地園藝學教育部重點實驗室，重慶市蔬菜學重點實驗室，重慶 400715）

乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺誘導IN2-2啟動子在芥菜中的表達

周 雯 孫芳芳 杜楊梅 馬存發(fā) 朱陳曾 鄭 敏 任雪松 司 軍 宋洪元*

（西南大學園藝園林學院，南方山地園藝學教育部重點實驗室，重慶市蔬菜學重點實驗室，重慶 400715）

分別用不同濃度（50、100、200 mg·L-1）的除草劑安全劑類似化合物乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺處理IN2-2：：GUS轉(zhuǎn)基因芥菜。結(jié)果顯示：乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺處理后，IN2-2啟動子在芥菜根、葉、花器官的花萼、花瓣、雄蕊及花粉中表達，但不在胚珠中表達。100 mg·L-1乙酰苯胺以及50 mg·L-12-氯苯磺酰胺適合用于在芥菜中調(diào)控IN2-2啟動子的表達，乙酰苯胺較2-氯苯磺酰胺誘導表達所需時間更短。高濃度的2-氯苯磺酰胺影響芥菜種子發(fā)芽及生長發(fā)育，并且明顯抑制IN2-2啟動子的表達活性。4 ℃低溫脅迫誘導IN2-2啟動子在幼苗葉片中表達，IN2-2啟動子輕微受150 mmol·L-1NaCl脅迫表達，但不受重金屬Gu2+離子的誘導表達。

IN2-2啟動子；乙酰苯胺；2-氯苯磺酰胺；芥菜；GUS表達

化學誘導基因表達系統(tǒng)是一種重要的人工調(diào)控表達系統(tǒng)，通過化學誘導表達系統(tǒng)可以實現(xiàn)對目標基因轉(zhuǎn)錄的去抑制、激活和失活，被用于育性調(diào)控、基因功能分析、無標記植物轉(zhuǎn)化、DNA定點刪除和基因沉默等多方面的研究（Gatz，1997）。植物中較為常見的化學誘導表達系統(tǒng)包括四環(huán)素、糖皮質(zhì)激素、乙醇和銅離子等誘導系統(tǒng)（Picard et al.，1988；Gossen & Bujard，1992），通過特定轉(zhuǎn)錄因子/蛋白誘導基因表達，調(diào)控相對復雜（Zuo & Chua，2000）。鑒于部分誘導物可能會對植物產(chǎn)生毒害作用、對環(huán)境具有安全隱患以及性質(zhì)不穩(wěn)定而不適合在大田應用。如四環(huán)素誘導系統(tǒng)需要tet操縱子（Gossen & Bujard，1992），因四環(huán)素本身是蛋白合成抑制劑，可能會影響植物蛋白合成（Zuo & Chua，2000）。Cu2+本身是植株生長所必需的微量元素，但施用濃度超出一定范圍時會對植株產(chǎn)生毒害作用（Mett et al．，1993）。

除草劑安全劑（safener）又稱為解毒劑（antidote）或保護劑（protectant），是一類選擇性保護作物免受除草劑傷害而改進雜草防除效果的化合物，通過誘導諸如GSTs和P450s類基因表達，增強植物防御和去毒能力（畢洪梅 等，2007）。谷胱甘肽軛合論認為安全劑的基因活化作用誘導谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）或其他代謝酶活性的產(chǎn)生而達到保護的效果（Lay & Casida，1976）。玉米GST-27基因表達受除草劑安全劑的誘導但不受激素、環(huán)境、生理變化的影響（Jepson et al．，1994）。玉米IN2-2基因受除草劑安全劑2-CBSU〔N-（aminocarbonyl）-2-chlorobenzenesulfonamide〕誘導表達，在各種脅迫處理下基本不表達（Hershey & Stoner，1991）。IN2-2：：GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥分別用4種不同的除草劑安全劑誘導處理后發(fā)現(xiàn)，2-CBSU能誘導IN2-2啟動子在根、莖尖分生組織和排水孔中表達（de Veylder et al．，1997）。由于基于除草劑安全劑的誘導系統(tǒng)不需要特定轉(zhuǎn)錄因子的參與，相對其他化學誘導系統(tǒng)更為簡單；且除草劑安全劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應用廣泛（高家東 等，2013），開發(fā)基于除草劑安全劑誘導的基因調(diào)控系統(tǒng)應用前景廣闊。先后有來自玉米的GST-27、IN2-1、IN2-2、IN2-5等除草劑安全劑誘導啟動子分別在馬鈴薯、煙草、擬南芥、水稻、玉米中被用于基因表達調(diào)控（Robertson et al．，2000；袁媛 等，2004；Behringer et al．，2011）。在模式植物擬南芥中，4種不同的除草劑安全劑中僅2-CBSU能誘導IN2-2啟動子在根、莖尖分生組織和排水孔中表達，其他除草劑安全劑只能在根中誘導表達（de Veylder et al．，1997）；除草劑安全劑2-CBSU缺少市售標準品，多為實驗室專門合成（袁媛 等，2004）；另外，受習慣上認為單子葉植物和雙子葉植物具有啟動子表達偏好性的影響，導致IN2-2啟動子除了在模式植物擬南芥中的表達特點被報道外，缺少在其他雙子葉植物中的表達分析研究。

目前，IN2-2啟動子已被成功用于單子葉植物玉米、水稻、小麥、甘蔗的基因表達調(diào)控（Choi et al．，2003；Cho et al．，2014），顯現(xiàn)其在植物基因表達調(diào)控中的巨大應用價值。而早先在擬南芥中的IN2-2啟動子表達信息（缺少雌雄蕊、花粉、胚珠中的表達特性）尚不足以顯示該啟動子在雙子葉植物中的可能應用前景（de Veylder et al．，1997）。另外，在煙草中發(fā)現(xiàn)乙酰苯胺化合物可以誘導玉米類似啟動子IN5-2的表達（馬亮 等，2010）；而2-氯苯磺酰胺在分子結(jié)構(gòu)上與除草劑安全劑2-CBSU相似。因此，本試驗利用IN2-2：：GUS轉(zhuǎn)基因芥菜植株，以35S：：GUS轉(zhuǎn)基因芥菜為對照，在轉(zhuǎn)基因植株不同時期分別用不同濃度的乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺進行誘導處理，比較IN2-2啟動子對上述不同化學物質(zhì)誘導響應以及在芥菜各組織、器官中的表達特點；同時，對轉(zhuǎn)基因植株分別進行4 ℃低溫、鹽脅迫以及Cu2+脅迫處理，觀察IN2-2啟動子在不同脅迫條件下的表達穩(wěn)定性。以期為今后在十字花科雙子葉植物中利用IN2-2啟動子進行基因表達化學調(diào)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2016年4～8月在西南大學園藝園林學院蔬菜實驗室進行。利用常規(guī)品種渝豐榨菜獲得的IN2-2：：GUS轉(zhuǎn)基因種子及35S：：GUS轉(zhuǎn)基因芥菜種子均由本院蔬菜實驗室保存。誘導劑乙酰苯胺（Acetylaniline）和2-氯苯磺酰胺（2-Chlorobenzenesulfonamide）分別購自生工生物工程（上海）股份有限公司和重慶鼎國生物科技有限責任公司。

1.2 轉(zhuǎn)基因芥菜處理

分別將乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺配制成濃度為50、100、200 mg·L-1的溶液，以野生型芥菜和35S：：GUS轉(zhuǎn)基因芥菜清水處理為對照。① 將IN2-2：：GUS芥菜種子分別置于添加不同濃度乙酰苯胺溶液、2-氯苯磺酰胺溶液的培養(yǎng)皿中萌發(fā)，每處理10～12粒，3次重復，分別調(diào)查統(tǒng)計各處理的種子發(fā)芽情況；25 ℃處理3 d后將萌發(fā)以及未萌發(fā)的種子進行GUS組織化學染色。② 分別用不同濃度乙酰苯胺、2-氯苯磺酰胺灌根處理苗齡45 d的IN2-2：：GUS幼苗，每處理3株，3次重復；分別在處理后0、2、5、7 d取部分側(cè)根和新生葉片進行GUS組織化學染色。③IN2-2：：GUS植株開花后，分別用不同濃度乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺溶液進行灌根處理，每處理3株，3次重復；分別在處理后0、2、5、7 d取新開放的3～5朵花進行GUS組織化學染色。

1.3 轉(zhuǎn)基因芥菜脅迫處理

將野生型和IN2-2：：GUS芥菜種子播于溫度為25 ℃/15 ℃（晝/夜，下同）的人工氣候室內(nèi)，30 d后幼苗生長至5片真葉左右，分別作如下處理：① 4 ℃恒溫培養(yǎng)箱處理；② 150 mmol·L-1的NaCl溶液灌根；③ 250 μmol·L-1的CuSO4溶液灌根。每處理3株，3次重復；脅迫處理0、3 d后取幼苗新生葉片進行GUS組織化學染色。

1.4 GUS組織化學染色

將樣品浸泡在染色液｛50 mmol·L-1的Na2HPO4和NaH2PO4混合液1 mL，0.1%的Triton X-100溶液0.1 mL，2 mmol·L-1的K3Fe（CN）6溶液0.2 mL，2 mmol·L-1的K4〔Fe（CN）6〕·3H2O溶液0.2 mL，10 mmol·L-1的EDTA溶液0.2 mL，2 mmol·L-1的X-Gluc溶液8.3 mL｝中，于37 ℃恒溫箱處理6 h；取出樣品先后用50%、70%、100%的乙醇漂洗，再加入100%乙醇浸泡直至完全脫色。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺誘導IN2-2啟動子在芥菜種子萌發(fā)期的表達

由圖1可知，不同濃度乙酰苯胺處理和清水處理IN2-2：：GUS芥菜種子發(fā)芽情況與野生型種子清水處理無明顯差異；而2-氯苯磺酰胺處理明顯抑制IN2-2：：GUS芥菜種子發(fā)芽，50 mg·L-1濃度處理的下胚軸長度遠不及對照，100 mg·L-1和200 mg·L-1濃度處理的芥菜種子幾乎不能正常發(fā)芽，且發(fā)芽時間延長至7 d后胚軸仍未伸長（圖片未展示）。

圖1 乙酰苯胺、2-氯苯磺酰胺處理對IN2-2：：GUS芥菜種子發(fā)芽的影響

處理3 d后的種子進行GUS組織化學染色，結(jié)果如圖2所示，清水處理的IN2-2：：GUS種子發(fā)芽后無明顯GUS活性；乙酰苯胺處理的子葉、下胚軸及根中均有明顯的GUS活性，且根中GUS活性隨處理濃度的增加表現(xiàn)明顯的增強趨勢；50 mg·L-1的2-氯苯磺酰胺處理可誘導IN2-2啟動子在子葉、下胚軸以及根中表達，100、200 mg·L-1濃度處理未伸長的胚根中有微量的GUS活性。不同濃度乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺處理后，IN2-2：：GUS子葉和下胚軸中GUS活性均稍微弱于35S：：GUS轉(zhuǎn)基因芥菜，但100 mg·L-1和200 mg·L-1乙酰苯胺處理以及50 mg·L-12-氯苯磺酰胺處理的根中GUS活性明顯強于35S：：GUS轉(zhuǎn)基因芥菜。

圖2 乙酰苯胺、2-氯苯磺酰胺處理3 d后的轉(zhuǎn)基因芥菜種子GUS組織化學染色

2.2 乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺誘導IN2-2啟動子在芥菜根中的表達

由圖3可知，野生型幼苗根部無GUS活性，而35S：：GUS幼苗根部可見明顯的GUS活性，IN2-2：：GUS幼苗部分根部誘導劑處理前有輕微表達；3個濃度的乙酰苯胺處理2 d后的根部均有明顯的GUS活性，5 d后活性增強，至第7天時活性下降；50 mg·L-1的2-氯苯磺酰胺處理2 d后根部有輕微的GUS活性，而100 mg·L-1和200 mg·L-1濃度處理2 d后與處理前無明顯差異，但3個濃度的2-氯苯磺酰胺處理5 d后均可見明顯的GUS活性，7 d后活性進一步增強，且50 mg·L-1與100 mg·L-1濃度處理根部GUS表達活性明顯強于200 mg·L-1處理。上述結(jié)果表明，乙酰苯胺能更快啟動IN2-2啟動子在根中的表達，但處理5 d后表達水平下降；而2-氯苯磺酰胺誘導IN2-2啟動子在根中的表達較慢，處理7 d后達到表達高峰，但過高濃度處理明顯抑制IN2-2啟動子在根中的表達。

2.3 乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺誘導IN2-2啟動子在芥菜葉片中的表達

圖3 乙酰苯胺、2-氯苯磺酰胺處理后芥菜幼苗根部GUS組織化學染色

圖4 乙酰苯胺、2-氯苯磺酰胺處理后芥菜幼苗葉片GUS組織化學染色

由圖4可知，35S：：GUS植株葉片中GUS活性強，而野生型植株葉片未檢測到任何GUS活性；部分IN2-2：：GUS植株處理前可在葉緣檢測到少量GUS活性；不同濃度乙酰苯胺處理2 d后的葉片可見較為明顯的GUS表達，5 d后表達進一步增強，7 d后GUS表達水平出現(xiàn)明顯降低，其中100 mg·L-1乙酰苯胺誘導效果較好；2-氯苯磺酰胺處理2 d后葉片中GUS表達與處理前相比無明顯差異，50 mg·L-1和100 mg·L-1濃度處理5 d后葉片中可見明顯的GUS表達，且50 mg·L-1濃度處理誘導表達效果強于100 mg·L-1處理，而200 mg·L-1濃度處理在葉片未見GUS活性；50 mg·L-1和100 mg·L-1的2-氯苯磺酰胺處理7 d后，GUS表達活性進一步增強，但仍低于35S：：GUS。上述結(jié)果表明，盡管2-氯苯磺酰胺誘導IN2-2啟動子在葉片中表達反應速度弱于乙酰苯胺，但在一定濃度下其誘導表達效果明顯優(yōu)于乙酰苯胺。

2.4 乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺誘導IN2-2啟動子在芥菜花器官中的表達

由圖5可知，野生型植株花器官未見GUS表達，35S：：GUS植株花器官各部分均有GUS表達，雄蕊和花萼中表達尤其強烈。IN2-2：：GUS植株處理前均未見明顯的GUS表達。100 mg·L-1的乙酰苯胺處理2 d后，在花萼及雄蕊中見到明顯的GUS表達活性；5 d后不同濃度處理的花器官（花萼、花瓣、雄蕊）中均可見GUS表達，但仍以100 mg·L-1濃度處理的表達活性最強；第7天，3個濃度處理的花器官中基本檢測不到GUS活性。100 mg·L-1的2-氯苯磺酰胺處理2 d后，在花萼中可見微量的GUS表達，其余兩個濃度處理未見GUS表達；50 mg·L-1和100 mg·L-1濃度處理5 d后，花器官各組織均可見GUS表達，但200 mg·L-1濃度處理僅在花萼中有微量表達活性；50 mg·L-1和100 mg·L-1濃度處理7 d后，花器官中的GUS表達均有不同程度的下降，而200 mg·L-1濃度處理也基本檢測不到GUS表達活性。

圖5 乙酰苯胺、2-氯苯磺酰胺處理后芥菜植株花器官GUS組織化學染色

由圖6可知，在野生型植株的花藥以及花粉中均無GUS活性，35S：：GUS植株花藥和花粉中均有明顯的GUS活性。經(jīng)不同濃度誘導劑處理5 d后，100 mg·L-1的乙酰苯胺和50 mg·L-1的2-氯苯磺酰胺處理花藥和花粉中的GUS活性表達最強。35S：：GUS植株在柱頭和花柱中可檢測到較為明顯的GUS活性，但子房胚珠中未有任何GUS表達，而該現(xiàn)象在擬南芥中也被發(fā)現(xiàn)（Skinner et al.，2016）。100 mg·L-1和200 mg·L-1的乙酰苯胺處理5 d后，可在柱頭以及花柱表面檢測到少量GUS活性；50 mg·L-1和100 mg·L-1的2-氯苯磺酰胺處理5 d后，柱頭以及花柱表面的GUS活性強于乙酰苯胺處理，但兩種誘導劑各濃度處理均未發(fā)現(xiàn)子房中的胚珠表達GUS活性。

圖6 乙酰苯胺、2-氯苯磺酰胺處理5 d后芥菜花藥、花粉、花柱及胚珠GUS組織化學染色

上述結(jié)果表明，2-氯苯磺酰胺誘導IN2-2啟動子在花器官中的表達特性與在葉片中的表達相似，200 mg·L-1濃度抑制IN2-2啟動子表達。相對乙酰苯胺，2-氯苯磺酰胺誘導IN2-2啟動子表達滯后，但誘導表達水平高于乙酰苯胺，持續(xù)誘導時間長于乙酰苯胺。另外，兩種化學誘導劑均能在適當?shù)臐舛认抡T導IN2-2啟動子在花粉及花柱中表達，但不能誘導IN2-2啟動子在子房胚珠中表達。

2.5 環(huán)境脅迫誘導IN2-2啟動子在芥菜葉片中的表達

圖7 低溫、高鹽、重金屬離子誘導后芥菜葉片GUS組織化學染色

野生型幼苗在4 ℃低溫、150 mmol·L-1NaCl溶液以及250 μmol·L-1CuSO4溶液脅迫處理下均未檢測到任何GUS活性，IN2-2：：GUS幼苗僅個別葉片邊緣有極輕微的GUS活性呈現(xiàn)（圖7-A、B、C）。IN2-2：：GUS幼苗在4 ℃低溫脅迫3 d后，葉片可見明顯的GUS活性表達，顯示IN2-2啟動子可被低溫逆境誘導表達（圖7-D）。150 mmol·L-1NaCl溶液處理3 d后，IN2-2：：GUS幼苗葉片有輕微GUS活性，顯示IN2-2啟動子在高鹽脅迫下輕微誘導表達（圖7-E）。IN2-2：：GUS幼苗經(jīng)250 μmol·L-1CuSO4溶液脅迫3 d后，未在葉片中檢測到GUS活性（圖7-F），表明在芥菜中IN2-2啟動子不受重金屬Cu2+的誘導表達。

3 結(jié)論與討論

目前，基于激素、物理、化學誘導的植物啟動子不斷被發(fā)現(xiàn)（Dutt et al．，2014）。除草劑安全劑誘導啟動子屬于化學直接誘導型啟動子，其中以來自于玉米的IN2-1、IN2-2（Hershey & Stoner，1991）、IN5-2（袁媛 等，2004）與GST27啟動子（Jepson et al．，1994）研究及應用較多。除草劑安全劑AD-67（苯叉酰胺）處理水稻幼苗后通過mRNA差異顯示法篩選到1個誘導后表達顯著增強的Yippee基因序列，但未見啟動子表達特性的報道（殷得所 等，2007）。利用IN5-2啟動子構(gòu)建了1套受2-氯-N-苯磺酰胺誘導調(diào)控的Cre/lox刪除系統(tǒng)，實現(xiàn)了煙草選擇標記基因的刪除（Yuan et al．，2004；Ma et al．，2011）。Choi等（2003）將IN2-2啟動子與擴展蛋白基因OsEXP4融合轉(zhuǎn)化水稻，通過2-CBSU誘導研究OsEXP4擴展蛋白基因在水稻生長發(fā)育中的功能。除草劑安全劑誘導響應元件一般位于ATG上游500 bp以內(nèi)，IN2-1啟動子誘導元件（as-1a和as-1b）位于ATG上游-416～-315 bp之間，且-505～-416 bp之間可能有1個抑制誘導表達元件的存在（Behringer et al．，2011）。而IN5-2啟動子中受2-chloro-N-（methylaminocarbonyl）benzenesulfonamide誘導的化學誘導元件可能位于ATG上游-388～-86 bp之間（袁媛 等，2004）；洋蔥表皮細胞瞬時表達結(jié)果進一步顯示，該響應元件位于-220～-143 bp之間（馬亮 等，2010）。結(jié)合IN2-2啟動子在擬南芥以及水稻中的應用（de Veylder et al．，1997；Choi et al．，2003），本試驗中IN2-2啟動子使用ATG上游463 bp長度的序列。

玉米IN2-1和IN2-2啟動子受酰胺類除草劑安全劑誘導表達（Hershey & Stoner，1991）。分別用濃度為50 mg·L-1的4種不同的酰胺類除草劑安全劑處理IN2-2：：GUS擬南芥，僅2-CBSU誘導GUS基因在根、莖尖分生組織以及葉片排水孔中高效表達，其余3種安全劑只能誘導GUS基因在根中表達（de Veylder et al.，1997）。本試驗中，乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺均能誘導IN2-2啟動子的表達，但表達模式存在一定的差異，乙酰苯胺誘導IN2-2啟動子在芥菜根與花器官中（包括花藥和花粉）表達，在葉片中的表達量較少；而2-氯苯磺酰胺誘導IN2-2啟動子在根、花器官（包括花藥和花粉）以及葉片中的表達量都比較高。乙酰苯胺誘導IN2-2啟動子表達水平較2-氯苯磺酰胺低，但誘導啟動子表達量達到峰值所需時間較2-氯苯磺酰胺短。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因被認為與不同化學誘導物結(jié)構(gòu)差異影響其在植物不同組織細胞中的運輸吸收有關(guān)（de Veylder et al.，1997）。相對傳統(tǒng)的四環(huán)素、糖皮質(zhì)激素、乙醇和銅離子等化學誘導系統(tǒng)，盡管除草劑安全劑化學誘導系統(tǒng)更為簡單，但該系統(tǒng)中哪些基因參與到IN2-2啟動子的表達調(diào)控是不清楚的（de Veylder et al．，1997）。因此，本試驗中乙酰苯胺處理濃度范圍內(nèi)，盡管200 mg·L-1處理對植株生長發(fā)育無明顯的影響，但其在根、葉片以及花器官中的表達水平卻低于100 mg·L-1處理，出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因有待于進一步的研究。本試驗中，發(fā)現(xiàn)2-氯苯磺酰胺處理抑制芥菜種子發(fā)芽，100 mg·L-1與200 mg·L-1濃度處理對轉(zhuǎn)基因芥菜植株產(chǎn)生藥害，出現(xiàn)較嚴重的葉片卷曲，且該現(xiàn)象在IN2-2：：GUS轉(zhuǎn)基因番茄上也有表現(xiàn)（結(jié)果未展示）。在擬南芥中，4種除草劑安全劑超過一定濃度也不同程度的影響種子發(fā)芽、根伸長以及葉片形態(tài)（de Veylder et al．，1997）。因此，從本試驗結(jié)果來看，IN2-2啟動子的誘導表達特性在單子葉和雙子葉植物中具有保守性（de Veylder et al．，1997），其作為化學誘導劑直接誘導啟動子應用于雙子葉植物的分子生物學研究是可行的。另外，乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺均可作為2-CBSU的替代誘導物用于調(diào)控IN2-2啟動子的表達，100 mg·L-1乙酰苯胺以及50 mg·L-12-氯苯磺酰胺適合用于在芥菜中調(diào)控IN2-2啟動子的表達，該濃度條件下藥劑對植株的生長發(fā)育無毒害作用且可實現(xiàn)啟動子表達的良好調(diào)控。

化學誘導基因表達系統(tǒng)在大田環(huán)境中的嚴謹性是能否應用于實踐生產(chǎn)的關(guān)鍵要素之一（Padidam，2003）。在沒有誘導劑的情況下，IN2-2啟動子可在日歷苗齡21～28 d的擬南芥植株根表皮細胞中檢測到微量的GUS活性，但在21 d以前的植株中未檢測到GUS表達（de Veylder et al.，1997）。GST-27啟動子即使在缺少誘導劑的情況下，在馬鈴薯莖、根和膨大塊莖中均可檢測到明顯的表達（Robertson et al.，2000）。本試驗中，剛發(fā)芽的芥菜根中未檢測到IN2-2啟動子表達；未添加誘導劑的情況下，在日歷苗齡約30 d的芥菜幼苗葉片中無表達，45 d后的幼苗可在部分根以及葉片中檢測到微量的GUS活性；開花后的花器官未添加誘導物時IN2-2啟動子不表達。因此，IN2-2啟動子表達泄露可能與組織器官以及發(fā)育階段有關(guān)。玉米植株經(jīng)機械損傷、熱擊、高鹽脅迫、GA處理均不能誘導IN2-1、IN2-2啟動子的表達（Hershey & Stoner，1991）。但本試驗中，IN2-2啟動子在芥菜葉片中的表達不受Cu2+的誘導，但輕微受到高鹽的誘導表達，在4 ℃低溫脅迫下可見明顯的表達。如何實現(xiàn)化學誘導型啟動子嚴謹?shù)谋磉_是一個較為復雜的問題。如PR-1a啟動子主要受二叔丁對甲酚（BTH）的誘導（G?rlach et al．，1996），但該啟動子也受環(huán)境條件如紫外照射、SO2、臭氧等脅迫因素的誘導表達（Green & Fluhr，1995；Sharma et al．，1996）。因此，可通過對誘導表達啟動子關(guān)鍵調(diào)控元件的精確分析和突變改造（Kiran et al．，2006；Srivastava et al．，2014），提高表達水平及嚴謹性。目前，包括IN2-2、IN2-5等除草劑安全劑誘導啟動子與其他系統(tǒng)結(jié)合，實現(xiàn)了基因刪除、雄性不育調(diào)控、轉(zhuǎn)基因植株篩選等（Cigan et al．，2001；Yuan et al．，2004；Ma et al．，2011；Cho et al．，2014）。因此，結(jié)合其他分子系統(tǒng)改造IN2-2啟動子表達嚴謹性，將有助于實現(xiàn)植物目標基因的精確及復雜調(diào)控。

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Expression of IN2-2 Promoter Induced by Acetanilide and 2-Chlorobenzenesulfonamide in Mustard

ZHOU Wen，SUN Fang-fang，DU Yang-mei，MA Cun-fa，ZHU Chen-zeng，ZHEN Min，REN Xuesong，SI Jun，SONG Hong-yuan*

（CollegeofHorticultureandLandscapeArchitecture，SouthwestUniversity，KeyLaboratoryofHorticultureSciencefor SouthernMountainsRegions，MinistryofEducation，ChongqingKeyLaboratoryofOlericulture，Chongqing400715，China）

IN2-2：：GUStransgenic mustard was treated with different concentrations（50、100、200 mg·L-1）of acetanilide and 2-chlorobenzenesulfonamide，the herbicide safer analogous chemicals．The results showed thatIN2-2promoter expressed in mustard roots，leaves，flower calyx，petal，stamen and pollen after treated with acetanilide or 2-chlorobenzenesulfonamide，but no GUS expression activity was observed in ovule．100 mg·L-1acetanilide or 50 mg·L-12-chlorobenzenesulfonamide solution were suitable for the expression ofIN2-2promoter in mustard，and the acetanilide induce theIN2-2promoter expression more quickly than 2-chlorobenzenesulfonamide in all tissues and organs．In addition，high concentration 2-chlorobenzenesulfonamide treatment was detrimental to mustard germination and growth，and would obviously inhibit the expression activity ofIN2-2promoter．4 ℃ temperature stress inducedIN2-2promoter expression in seedling leaf blades．This promoter expression was slightly induced by 150 mmol·L-1NaCl，but not by heavy metalions Gu2+．

IN2-2promoter；Acetanilide；2-Chlorobenzenesulfonamide；Mustard；GUS expression

周雯，女，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜育種與生物技術(shù)，E-mail：869217196@qq.com

*通訊作者（Corresponding author）：宋洪元，教授，碩士生導師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種及生物技術(shù)，E-mail：yuahs@163.com

2016-11-07；接受日期：2017-03-03

重慶市社會事業(yè)與民生保障科技創(chuàng)新專項（cstc2015shmsztzx80005，cstc2015shms-ztzx80007，cstc2015shms-ztzx80009）