基于形態(tài)特征和線粒體12S、Cyt b和ND4基因片段的橫斑錦蛇和玉斑錦蛇的關(guān)系研究

安小燕，黃 燕，丁 利，干少雄，毛曉陶，李書彬

(1.四川省林業(yè)科學研究院，四川 成都 610081； 2.西華師范大學生命科學學院珍稀動植物研究所，四川 南充 637009； 3.中科院成都生物研究所，四川 成都 610041；4.天全縣林業(yè)局，四川 雅安 625500)

基于形態(tài)特征和線粒體12S、Cyt b和ND4基因片段的橫斑錦蛇和玉斑錦蛇的關(guān)系研究

安小燕1，2，黃 燕2*，丁 利3，干少雄1，毛曉陶4，李書彬4

(1.四川省林業(yè)科學研究院，四川 成都 610081； 2.西華師范大學生命科學學院珍稀動植物研究所，四川 南充 637009； 3.中科院成都生物研究所，四川 成都 610041；4.天全縣林業(yè)局，四川 雅安 625500)

本文通過對橫斑錦蛇(Elapheperlacea)肌肉線粒體DNA的提取，對其中的3個基因—12SRNA、ND4和細胞色素b進行擴增、測序，與玉斑錦蛇(Elaphemandarinus)及錦蛇屬(Elaphe)17個物種的相同基因片段重建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果表明橫斑錦蛇與玉斑錦蛇系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近，但是兩者不是同一個物種。最后將橫斑錦蛇和玉斑錦蛇的外部特點進行對比，發(fā)現(xiàn)橫斑錦蛇與玉斑錦蛇在形態(tài)特征上存在穩(wěn)定性差異。

橫斑錦蛇(Elapheperlacea)；線粒體DNA；玉斑錦蛇(Elaphemandarinus)；系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；形態(tài)特征

橫斑錦蛇(Elapheperlacea)隸屬游蛇科(Colubrldae)錦蛇屬(Elaphe)，是我國四川省西部的特產(chǎn)動物。由美國學者stejneger.L于1929年依據(jù)采于雅安的一號雄蛇標本發(fā)表的新種。模式標本保存在美國博物館。近50年未見再有報道，有人認為可能絕滅。1980、1987、1988年先后在汶川縣臥龍自然保護區(qū)及瀘定縣海螺溝森林冰川公園獲得錦蛇屬標本3號。經(jīng)鑒定為該種，分別保存在四川師范學院(現(xiàn)西華師范大學)生物系和中國科學院成都生物研究所(鄧其祥，江耀明，1989)。橫斑錦蛇蛇體全長1 m左右，頭呈橢圓形，與頸區(qū)分不明顯，頭背具對稱排列的大鱗。吻鱗寬大于高,從背面可見部分較多，鼻孔較大，位于前后兩枚鼻鱗之間。頰鱗1，眼前鱗1。眼后鱗2，上唇鱗7，2-2-3式，下唇鱗8，前3或4枚切前頦片。背鱗19-19-17行，平滑或中段部分鱗行起棱。肛鱗二分，尾下鱗雙行。全長865+194、1055+189、884+146毫米。背面灰色，具有幾乎等距排列的黑色橫斑．每一橫斑占2鱗行，邊緣鑲有不甚清晰的白色。每兩個相鄰的橫斑在腹面連接成卵圓形環(huán)，環(huán)內(nèi)橫斑間相隔1-2鱗行，前后兩環(huán)間相隔3-4鱗行。體背卵圓形環(huán)36-37個，尾部9個。頭背前部有2黑色橫斑，其后為兩個前后彼此相連的倒“V”形黑色斑。第一黑橫斑位于吻鱗與鼻鱗之間，前鼻鱗至第一上唇鱗而與下唇緣黑點相吻合，第二黑橫斑位于前額鱗，經(jīng)眼上鱗至眼。分為前后2支，前支從眼前鱗到第三、四上唇鱗之間。后支從眼后鱗經(jīng)前顳鱗斜向第五、六上唇鱗之間。第一倒"V"形黑斑自額鱗，經(jīng)頂鱗后顧鱗后方向前彎至下唇鱗內(nèi)側(cè)，第二倒“V”形斑自頂鱗向外斜至頸側(cè)腹面與頸部倒“V”形黑斑連接成第一卵圓形環(huán)(胡杰，李艷紅等，2002)。至今對橫斑錦蛇的研究少之又少，NCBI上還未收錄關(guān)于橫斑錦蛇的任何基因序列。

玉斑錦蛇(Elaphemandarinus)隸屬游蛇科錦蛇屬(Elaphe)，1882年首先被Cantor發(fā)現(xiàn)并命名為ColuberMandarinu，玉斑錦蛇全長1 m左右，尾長約為全長的五分之一。背面紫灰或灰褐色，正背有一行18～31+6～11個約等距排列的黑色大菱斑，菱斑中心黃色；腹面灰白色，散有長短不一，交互排列的黑斑。頭背黃色，有典型的黑色倒“V”字型套疊斑紋。眶前鱗1，眶后鱗2；顳鱗2(1)+3(2)；上唇鱗7，2-2-3式，或8，3-2-3或2-2-4式；下唇鱗9，前4枚切前頷片。背鱗23-23-19行，平滑；腹鱗181～238；肛鱗二分；尾下鱗53～75對。

通過外表形態(tài)可以看出橫斑錦蛇和玉斑錦蛇的頭部和尾部斑紋較為相似，Schulz在1989提出橫斑錦蛇是玉斑錦蛇的變異體，并且有許多人認為橫斑錦蛇和玉斑錦蛇是同一個物種?？墒莾H從外表形態(tài)判斷橫斑錦蛇和玉斑錦蛇的關(guān)系是不夠的，也是不足以說服他們之間的關(guān)系。在過去的20年中，分析線粒體作為一個多功能的DNA基因已被成功和有效的工具，調(diào)查的親緣關(guān)系。蛇最常見的使用的片段是線粒體細胞色素b(細胞色素b)和/或NADH脫氫酶亞單位4(ND4基因)基因(例如克勞斯和布朗，1998年Kelly等人，2003年。Malhotra和索普，2004年，勞森等人，2005年;Burbrink和Lawson，2007)。本文擬從線粒體DNA及形態(tài)特征上對橫斑錦蛇及玉斑錦蛇的關(guān)系進行研究。

12SRNA在序列中是較保守的序列?，F(xiàn)在通過提取橫斑錦蛇線粒體DNA，并對其中的3個基因12SRNA、ND4、細胞色素b進行擴增、測序，最后與玉斑錦蛇的相應的線粒體DNA片段進行比較，建立分子系統(tǒng)樹，計算遺傳距離的方法來證明橫班錦蛇和玉斑錦蛇是兩個不同的物種。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

供試實驗材料為2010年在雅安市蜂桶寨自然保護區(qū)采集的橫斑錦蛇標本的肌肉組織。玉斑錦蛇及錦蛇屬其余物種的基因序列來自于NCBI(表1)。

1.2 實驗方法

1.2.1 總DNA的提取

本研究中采用常規(guī)的苯酚-氯仿法提取總DNA，步驟如下：

(1)取材：取用95%乙醇保存的蛇肌肉30 mg～50 mg 于1.5 ml 的EP管中。取樣是要注意清潔，避免交叉污染。將EP 管中的酒精倒干，用dd H2O清洗一遍，或?qū)悠分糜?5℃的烘箱中至無酒精味即可。

表1 17個物種的GenBank 登陸號

Tab.1 17 species’s genBank numbers

(2)消化：將EP 管中加入450 μL Tris-HCl 裂解緩沖液，再加50 μL 10%SDS。最后加蛋白酶K(PK)10 μL。50℃水浴20 h 左右，至樣品全部裂解至溶液澄清(期間要多次振蕩)。

(3)抽提1：加等體積苯酚(約510 μL)，翻轉(zhuǎn)振蕩10 min。12 000 r·min-1離心10 min，取上清液。

(4)抽提2：將上清液取入另一個干凈的EP 管，針對上清液的量加一半的苯酚和一半的氯仿，翻轉(zhuǎn)振蕩8 min～10 min。12 000 r·min-1離心10 min。

(5)抽提3：取上清液于干凈EP 管中，加入等體積的氯仿，可加至1 000μL，振蕩8 min～10 min。12 000 r·min-1離心10 min。

(6)沉淀：取上清液于一個干凈的EP 管中，加入上清液體積的10%的3 Mol/L 的NaAC。再加入總量2～2.5 倍體積的-20℃冰凍的無水乙醇。一個一個輕輕混勻。冰箱-20℃冷凍30 min(也可冷藏時間稍長或過夜)。13 000 r·min-1離心25 min，輕輕傾倒完液體(此步需要小心操作避免DNA 塊被倒出)。

(7)漂洗：取70%的酒精120 μL 于EP 管內(nèi)，輕旋后把酒精倒掉，斜于衛(wèi)生紙上，除去剩余的乙醇。

(8)溶解：在每個樣品管中加入適量的dd H2O，一般加40 μL ～50 μL溶解DNA。在離心機內(nèi)輕甩一下，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(9)電泳檢測：用1%的的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA，根據(jù)點樣的含量和條帶的亮度，估計DNA 的濃度，方便以后的實驗。

1.2.2 PCR的擴增

細胞色素b的引物：L14910/H16064 (Burbrink et al.,2000)

ND4的引物：ND4/Leu(Arévalo et al.,1994)

12S的引物：L1091mod/H1557mod (Zaher et al.,2009)

反應體積為25 μL，包括配備的反應緩沖液2.5 uL，2.5 mmol·L-1的dNTP 2 μL，10 pmol ·μL-1上下游引物各0.5 μL，2.5 U·μL-1Taq聚合酶0.25 μL，總DNA 1 μL (含10 ng～100 ng DNA)，dd H2O 補足到25 μL。12S擴增條件如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性40 s，57℃退火50 s，72 ℃延伸60 s，最后一個循環(huán)72 ℃再延伸5 min，循環(huán)次數(shù)為35 次；最后4℃保存。ND4和細胞色素b擴增條件如下：95 ℃預變性5 min；95℃變性1min，58℃退火1min，72 ℃延伸1 min 20s，循環(huán)次數(shù)為35 次；最后一個循環(huán)72 ℃再延伸5 min，最后4℃保存。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的純化

PCR產(chǎn)物的純化均采用柱式PCR 產(chǎn)物回收試劑盒純化?；厥詹襟E按照試劑盒使用說明書進行。純化后用瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶。

1.2.4 測序

將純化的PCR 產(chǎn)物委托生物技術(shù)公司測定。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

DNA 序列用Bioedit 軟件(Hall，1999)的Clustal W Multiple alignment進行比對，并輔以人工校正和編輯，同時拼接12S rRNA、細胞色素b和ND4。由于細胞色素b和ND4是雙向測序，在拼接ND4時，要仔細核查峰圖文件。同時與近緣種如玉斑錦蛇等的序列進行比對。在GenBank 下載玉斑錦蛇的同段基因序列作為參照模板進行編輯。

分別在GenBank上下載親緣關(guān)系較近的17個物種的12S rRNA、細胞色素b和ND4序列，同時拼接12S rRNA、細胞色素b和ND4序列。

采用MEGA 4.0 軟件(Tamura,Dudley,Nei,and Kumar 2006)計算核苷酸的組成、變異位點數(shù)目等序列特征，用 Kimura 2-parameter 模型，計算不同種群間的遺傳距離。

采用鄰接法(neighbor-joining,or NJ)，分別對12S rRNA、細胞色素b、ND4以及它們的拼接序列構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹。NJ法計算進化樹時去除序列間的成對缺失，并對進化樹進行自舉檢驗(bootstrap)，重復抽樣1 000次，此法在MEGA4.0中執(zhí)行。

2 結(jié)果和分析

2.1 橫斑錦蛇和玉斑錦蛇的外形特點比較

從橫斑錦蛇和玉斑錦蛇的外形特征上比較，橫斑錦蛇全長1m以上，尾長占全長的1/5左右。背鱗19～19～17行，腹鱗224～231，肛鱗二分，尾下鱗57～69對?？羟镑[1，眶后鱗2；顳鱗1+2；上唇鱗7，2-2-3式；下唇鱗8或9，前4(3)枚切前頜片。軀尾背面呈不規(guī)則的窄橫紋；頭背斑紋的典型特征是：前端有兩條黑橫紋，一橫跨吻背，一橫跨兩眼間，在眼下伸達唇緣，眼后另有一短黑紋斜達口角；頭頂部有2～3個尖端向前，彼此套迭的倒“V”字形黑紋。玉斑錦蛇全長1 m左右，尾長約為全長的1/5。背面紫灰或灰褐色，正背有一行18～31+6～11個約等距排列的黑色大菱斑，菱斑中心黃色；腹面灰白色，散有長短不一，交互排列的黑斑。頭背黃色，有典型的黑色倒“V”字型套疊斑紋?？羟镑[1，眶后鱗2；顳鱗2(1)+3(2)；上唇鱗7，2-2-3式，或8，3-2-3或2-2-4式；下唇鱗9，前4枚切前頷片。背鱗23-23-19行，平滑；腹鱗181～238；肛鱗二分；尾下鱗53～75對(表2)。

表2 橫斑錦蛇和玉斑錦蛇的鱗被特征比較

Tab.2 Comparison ofElapheperlaceaandElaphemandarinus’ssquama

類別橫斑錦蛇玉斑錦蛇背鱗19～19～17行23-23-19行腹鱗224～231181～238肛鱗二分二分尾下鱗57～69對53～75對眶前鱗11眶后鱗22顳鱗1+22(1)+3(2)上唇鱗7，2-2-3式7，2-2-3式或8，3-2-3或2-2-4式下唇鱗8或99前頷片4(3)枚前4枚

通過外形比較，橫斑錦蛇和玉斑錦蛇的外部特點確實相似。雖然在任何地區(qū)理解蛇的多樣性歷來依靠形態(tài)分析數(shù)據(jù)，但是形態(tài)數(shù)據(jù)已被證明難以揭開神秘的多樣性理解物種間的關(guān)系。最終要通過分子水平進行驗證。

2.2 序列特征

12S+cytb+ND4合并后的序列：將樣本的3個基因片段連接后，得到2 417 bp。其中變異位點951個，簡約信息位點707個，平均轉(zhuǎn)換與顛換之比R=2.014，平均T、C、A、G的百分含量分別為26.3%，27%，34.5%，12.2%，G+C含量為39.2%。

2.3 使用鄰接法(NJ)構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)生樹

根據(jù)所測序列，采用鄰接法構(gòu)建16種蛇系統(tǒng)發(fā)生樹，所研究的16種蛇分成4個支系(圖1)。第1個支系包括劍蛇屬(Sibynophis)的兩種蛇，自舉檢驗置信度為100；第2個支系為雅蛇屬(Rhadinophis)，自舉檢驗置信度為39；德州鼠蛇(Elapheobsolete)，鮑氏蛇屬(Bogertophisrosaliae)，光滑蛇(Arizonaelegans)構(gòu)成第3支系。自舉檢驗置信度為45。其他幾種蛇構(gòu)成第4支系。第1支系劍蛇屬在系統(tǒng)樹的最基部，為16種中較原始的類群。

圖1 NJ 法構(gòu)建立系統(tǒng)發(fā)育樹(N-J tree of 16 species)

2.4 遺傳距離(如圖3.2所示)

通過遺傳距離表可以看出，橫斑錦蛇(Elapheperlacea)和玉斑錦蛇(Elaphemandarinus)之間的遺傳距離是0.126，其中王錦蛇(Elaphecarinatavoucher)與日本四線錦蛇(Elaphequadrivirgata)之間的遺傳距離0.111，王錦蛇(Elaphecarinatavoucher)與棕黑錦蛇(Elaphecarinatavoucher)的遺傳距離0.121,青大將(Elapheclimacophora)和日本四線錦蛇(Elaphequadrivirgata)的遺傳距離0.114，即：王錦蛇與日本四線錦蛇遺傳距離0.111<青大將和日本四線錦蛇的遺傳距離0.114<王錦蛇與棕黑錦蛇的遺傳距離0.121<橫斑錦蛇和玉斑錦蛇之間的遺傳距離是0.126。這說明橫斑錦蛇確實已經(jīng)達到不同物種間的最小遺傳距離。

表3 16種蛇之間的遺傳距離

Tab.3 Genetic distance of 16 species

4 討論

4.1 實驗技術(shù)的討論

在采用常規(guī)的95℃循環(huán)變性擴增時，最初用了不同的梯度測試12 s的擴增效果，最后檢測出來發(fā)現(xiàn)在51℃～58℃之間不同的溫度梯度下擴增出來的效果都較好，在細胞色素b中，在95℃變性過程中可以適當延長至1 min，退火的溫度也可以增加為58℃。在檢測擴增產(chǎn)物的過程中發(fā)現(xiàn)，如果電泳的時間超過30 min，可能導致檢測結(jié)果出現(xiàn)拖帶的情況，這也許是引物二聚體引起的結(jié)果偏差。

4.2 橫斑錦蛇與玉斑錦蛇的關(guān)系

通過NJ法建立的系統(tǒng)發(fā)生樹中劍蛇屬在系統(tǒng)樹的最底部，表明在這16種蛇中是比較原始的。在最上層的是橫斑錦蛇和玉斑錦蛇，說明這兩種錦蛇在廣義錦蛇屬中的分化時間較晚。支持橫斑錦蛇與玉斑錦蛇為姐妹群的支持率為99，說明這兩個物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系很近，擁有最近共同祖先。從遺傳距離表中也可以看出，橫斑錦蛇和玉斑錦蛇的遺傳距離為0.126，比王錦蛇與日本四線錦蛇之間的遺傳距離0.111，王錦蛇與棕黑錦蛇的遺傳距離0.121,青大將和日本四線錦蛇的遺傳距離0.114，都要更大，因此更加說明了橫斑和玉斑的遺傳距離確實也達到了種的水平。

鱗被特征常常最為爬行動物分類的最重要的鑒別特征。通過查找資料發(fā)現(xiàn)在形態(tài)特征上，橫斑錦蛇與玉斑錦蛇主要在以下方面有較穩(wěn)定的區(qū)別：橫斑錦蛇的背鱗19～19～17行，腹鱗224～231，而玉斑錦蛇的背鱗23-23-19行，腹鱗181～238；橫斑錦蛇的尾下鱗57～69對，而玉斑錦蛇的尾下鱗53～75對；橫斑錦蛇的上唇鱗7，2-2-3式，下唇鱗8或9，而玉斑錦蛇的上唇鱗7，2-2-3式，或8，3-2-3或2-2-4式，下唇鱗是9。這些鱗被之間的穩(wěn)定性差異說明了橫斑錦蛇和玉斑錦蛇是不同的物種。這與趙爾宓(2003)的結(jié)果一致。支持橫斑錦蛇為一有效物種。

4.3 橫斑錦蛇的保護

總的來說,橫斑錦蛇的分布十分狹窄,數(shù)量也相當稀少。據(jù)四川省陸生野生動物調(diào)查估計數(shù)量不足一萬只。同時,橫斑錦蛇的分布是不均衡的,在某些局部區(qū)域數(shù)量相對較豐富。例如,在原分布區(qū)的汶川臥龍保護區(qū)和雅安,某次四川省陸生野生動物調(diào)查中未能見到; 而在石棉縣的田灣河區(qū)域,密度為194 只·km-1。對于橫斑錦蛇現(xiàn)今的數(shù)量并不樂觀，因此希望在相應的分布區(qū)里面加強保護。建議通過以下一些措施加強對橫斑錦蛇的保護(胡錦矗，胡杰，李艷紅，2002 21( 3))。

(1)加強科學研究：雖然橫斑錦蛇已被列為四川省重點保護野生動物,但我們對于這一物種的了解尚很缺乏,有關(guān)其保護生物學方面的研究也有待于深入。通過調(diào)查,可選擇數(shù)量相對較豐富的石棉縣田灣河區(qū)域,對其個體生物學、生態(tài)學等開展專題研究。

(2)加強宣傳、嚴格執(zhí)法：過去在橫斑錦蛇產(chǎn)區(qū)的一些收購站中,曾有報道收購到本種蛇的標本。現(xiàn)在,雖然收購站已被取締,但非法收購、捕捉的現(xiàn)象卻時有發(fā)生。因此,在有橫斑錦蛇分布的縣、市,各級林業(yè)主管部門及基層單位一方面要加強對公眾的保護宣傳,另一方面對于非法捕捉、收售該種蛇類的不法分子要嚴厲打擊(胡杰，李艷紅等，2002)

現(xiàn)今對于橫斑錦蛇的研究也比較欠缺，NCBI上還沒有收錄關(guān)于橫斑錦蛇的任何基因序列，這對于橫斑錦蛇的保護是不利的。因此希望能通過各方面的關(guān)注，提高大家對橫斑錦蛇的保護意識。

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Relationships BetweenElapheperlaceaandElaphemandarinusBased on Morphological Characters and Mitochondrial 12S, Cyt b and ND4 Gene Sequences

AN Xiao-yan1,2HUANG Yan2*DING Li3GAN Shao-xiong1MAO Xiao-tao4LI Shu-bin4

(1．Sichuan Academy of Forestry,Chengdu 610081,China； 2.Institute of Rare Animals and Plants,West China Normal University,Nanchong 637009,China； 3.Chengdu Institute of Biology,Chinese Academy of Sciences,Chengdu 610041,China； 4.Tianquan County Forestry Bureau,Ya’an 625500,China)

Elapheperlaceabelongs toElaphe,Megapodiidae.Stejneger collected a male specimen in Ya’an and named itElapheperlaceain 1929.The number ofElapheperlaceais rare,and its distribution areas are limited.Elapheperlaceais the least studied species ofElaphe.Elaphemandarinusalso belongs toElaphe,and it was named in 1882.Due to the similarities in heads and tails of both species and the limited information,it is difficult to differentiate the two species.In 2010,a specimen ofElapheperlaceawas collected in Fengtongzhai Nature Reserve of Ya’an.We obtained DNA sequence data ofElapheperlacea(complete sequences of the mitochondrial NADH dehydrogenase subunit 4 [ND4] gene,cytochrome b gene and 12S rRNA partial sequences) and established phylogeny trees to examine the relationship ofElaphespecies.The phylogenetic tree showed thatElapheperlaceaandElaphemandarinuswere sister species,but also two valid species.And we also examined the morphological characters ofElapheperlaceaandElaphemandarinus,and found that there were stable differences between them.

Elapheperlacea，Mitochondrial DNA，Elaphemandarinus，phylogeny relationship; morphological characters

2016-12-13

天全縣潤楠、香果樹和橫斑錦蛇極小種群拯救保護項目調(diào)查監(jiān)測、生境營造及技術(shù)培訓部分(項目編號：天政采招[2014] 26號)。

安小燕(1987-)，女，四川宜賓，中學二級教師。

*通訊作者：黃燕(1982-)，女，博士，講師，主要研究方向：動物學。

10.16779/j.cnki.1003-5508.2017.02.015

Q959.3

A

1003-5508(2017)02-0085-06