常壓等離子體降解黃曲霉毒素B1的效果研究

任翠榮，熊旭波，王世清，王振斌，張 巖，姜文利

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島澳維康生物科技工程有限公司，山東 青島 266109；3.江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)是由黃曲霉和寄生曲霉所產(chǎn)生的一種次生代謝物，具有急慢性毒性、致突變性、致癌性和致畸性[1]。常見的有黃曲霉毒素B1(Aflatoxin Bl，AFBl)、B2(AflatoxinB2， AFB2)、G1(Aflatoxin Gl，AFG2)、G2(Aflatoxin G2，AFG2)、Ml(Aflatoxin M1，AFM1)5種[2]，其中AFB1毒性最強(qiáng)，其毒性是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為一級(jí)致癌物[3-5]。AFT是迄今為止發(fā)現(xiàn)最穩(wěn)定的一類真菌毒素，耐受高溫，一般的加熱過程對(duì)AFT的結(jié)構(gòu)沒有影響。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)AFT的脫除方法進(jìn)行了大量研究，目前主要有化學(xué)法、生物法和物理法[6]，但大部分方法存在著處理時(shí)間長(zhǎng)、損害農(nóng)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、降解效率低、成本高、不易操作、實(shí)踐應(yīng)用受到限制等問題[7-9]。物理法是目前應(yīng)用較多的一類AFT脫除方法，其中紫外線和γ-射線輻照是目前研究比較多的物理方法，它們具有操作容易、性能穩(wěn)定、勞動(dòng)強(qiáng)度小等優(yōu)點(diǎn)，在AFT的脫除中受到了廣泛關(guān)注[10]。

等離子體被稱為物質(zhì)的“第四態(tài)”，指部分或完全電離的氣體，且自由電子和離子所帶正、負(fù)電荷的總和完全抵消，宏觀上呈現(xiàn)中性電[11-13]。本課題組自2007年以來，嘗試采用減壓等離子體處理AFB1，并取得了初步的成效。張巖等研究發(fā)現(xiàn)，200 W常壓等離子體處理水中AFB1，時(shí)間為80 s時(shí)，其降解率達(dá)到51.67 %[14]；120 W的減壓等離子體處理乙腈中AFB1，時(shí)間為250 s時(shí)，其降解率達(dá)99.8%[15]，且降解率均隨等離子體處理功率的增大而增加。李玉鵬等利用低壓等離子體技術(shù)也能有效降解農(nóng)產(chǎn)品中的AFB1，但比純水或純乙腈中的AFB1的降解率低，當(dāng)增大處理功率或延長(zhǎng)處理時(shí)間時(shí)能增加AFB1降解率[16]。說明減壓等離子體用于降解農(nóng)產(chǎn)品中AFB1具有一定的可能性。

近些年出現(xiàn)的常壓等離子體技術(shù)發(fā)展勢(shì)頭逐漸勝過了傳統(tǒng)的減壓等離子體技術(shù)，因?yàn)榍罢邿o需使用真空設(shè)備能夠處理大面積物件，所以更適合在生產(chǎn)線上應(yīng)用[18-19]。本實(shí)驗(yàn)利用常壓等離子體處理AFB1，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，以期獲得AFB1降解最優(yōu)的工藝條件，為實(shí)際應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AFB1：美國(guó)Sigma公司；乙腈(色譜純) ： 德國(guó)默克公司。

1.2 儀器與設(shè)備

常壓等離子體：中國(guó)科學(xué)院等離子體物理研究所；針筒式濾膜過濾器：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；一次性無菌注射器：侯馬市康福萊醫(yī)療器械有限公司；HPLC液相色譜儀：德國(guó)默克公司；智能超聲波清洗器：德國(guó)艾爾瑪公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)裝置

常壓等離子體裝置見圖1。

1-氬氣瓶；2-超凈工作臺(tái)；3-樣品；4-等離子體電極；5-TDGC2-2型接觸調(diào)壓器；6-LZB-10浮子流量計(jì)；7-高度調(diào)節(jié)器；8-等離子體火焰；9-高頻電壓交流電源圖1 常壓等離子體裝置圖

1.4 測(cè)試方法

1.4.1色譜條件

Agilent液相系統(tǒng)。色譜柱：Waters Symmetry-C18，4.6 mm×250 mm；粒度5μm；柱溫：30 ℃;流動(dòng)相∶V(乙腈)∶V(水)=30∶70，流速：1 mL/ min，進(jìn)樣量：20 μL，熒光檢測(cè)器:激發(fā)波長(zhǎng)：365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：440 nm。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取濃度分別0、5、10、15、20、30、40、50 mg/L的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液各5 mL，采用HPLC分析，每個(gè)濃度重復(fù)3次，以AFB1的峰面積對(duì)AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度進(jìn)行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，線性方程為y=33.71x-20.634，R2=0.999 5。

圖2 AFB1標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 單因素實(shí)驗(yàn)

1.5.1.1 常壓等離子體放電距離的降解實(shí)驗(yàn)

用乙腈配制初始濃度為10 mg/L的AFB1溶液，置于等離子體上進(jìn)行處理，放電距離設(shè)定為1、2、3、4、5 cm，電壓設(shè)定為170 V，處理時(shí)間為100 s。

1.5.1.2 常壓等離子體處理電壓的降解實(shí)驗(yàn)

用乙腈配制初始濃度為10 mg/L的AFB1溶液，置于等離子體上進(jìn)行處理，電壓設(shè)定為150、155、160、165、170 V，放電間距設(shè)為2 cm，處理時(shí)間100 s。

1.5.1.3 常壓等離子體處理時(shí)間的降解實(shí)驗(yàn)

用乙腈配制初始濃度為10 mg/L的AFB1溶液，置于等離子體上進(jìn)行處理，處理時(shí)間設(shè)定為50、100、150、200、250 s，放電間距設(shè)為2 cm，電壓設(shè)定為170 V，處理時(shí)間100 s。

1.5.1.4 AFB1初始濃度的脫毒實(shí)驗(yàn)

用乙腈配制初始濃度為10、20、30、40、50 mg/L的AFB1溶液，置于等離子體上進(jìn)行處理，放電間距設(shè)為2 cm，電壓設(shè)定為170 V，處理時(shí)間為100 s。

1.5.2 Box- Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由于放電間距對(duì)常壓等離子降解AFB1的降解效果已經(jīng)非常明確，即放電間距越大，AFB1的降解率越小，放電間距不作為響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的主要因素。因此，選取處理電壓、AFB1初始濃度、處理時(shí)間作為主要因子，以AFB1的降解率為響應(yīng)值，采取3因素3水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以獲得最優(yōu)實(shí)驗(yàn)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因子和水平見表1。

表1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因子和水平

1.6 AFB1降解率的計(jì)算

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)AFB1降解率的影響

2.1.1 常壓等離子體放電間距對(duì)AFB1降解率的影響

由圖3可知，毒素在170 V的等離子體條件下，放電間距設(shè)為1 cm時(shí)，AFB1的降解率高達(dá)79.76%。放電間距設(shè)為5 cm時(shí)，AFB1的降解率達(dá)22.10%?？梢?，隨著放電間距的增加，AFB1的降解率明顯降低。這是由于常壓等離子體的放電間距越大，帶電粒子與AFB1之間的相互作用越小，毒素的降解率越低。

圖3 常壓等離子體放電間距對(duì)AFB1降解率的影響

2.1.2 常壓等離子體處理電壓對(duì)AFB1降解率的影響

由圖4可知，在常壓等離子體處理電壓為150～170 V范圍內(nèi)，隨著電壓的升高，AFB1的降解率呈不斷增大的趨勢(shì)。原因是常壓等離子體處理電壓變大，帶電粒子運(yùn)動(dòng)速度會(huì)加快，所以積累電子的速度就快，噴出的等離子體能量、密度均會(huì)升高，使得毒素的降解率增大[20]。綜合考慮，選取處理電壓160、165、170 V作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平。

圖4 常壓等離子體處理電壓對(duì)AFB1降解率的影響

2.1.3 常壓等離子體放電時(shí)間對(duì)AFB1降解率的影響

由圖5可知，毒素在170 V的等離子體條件下處理250 s時(shí)，AFB1的降解率達(dá)92.03%?？梢?，運(yùn)用常壓等離子體可有效降解AFB1。且在放電時(shí)間50～250 s范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，AFB1的降解率不斷增大，但增大幅度有所下降。綜合考慮，選取放電時(shí)間150、200、250 s作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平。

圖5 常壓等離子放電時(shí)間對(duì)AFB1降解率的影響

2.1.4 黃曲霉毒素初始濃度對(duì)AFB1降解率的影響

由圖6可知，AFB1的降解率隨著AFB1初始濃度的增大而減少。原因可能是當(dāng)常壓等離子體處理電壓相同時(shí)，帶電粒子的運(yùn)動(dòng)速度不變，噴出的等離子體能量一定，溶液的初始濃度越低，每個(gè)溶質(zhì)分子接觸到的等離子體能量越大，毒素的降解率越高。即AFB1初始濃度升高不僅使得AFB1的降解效果變差，而且增加成本。綜合考慮，選取AFB1初始濃度5、10、15 mg/L作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平。

圖6 AFB1初始濃度對(duì)AFB1降解率的影響

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以常壓等離子體處理電壓、放電時(shí)間、AFB1初始濃度為自變量，進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表2 。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

由表3可知，回歸模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，R2=0.989 6>0.960 0，說明模型的擬合度較好。在所選的各因素水平范圍內(nèi)，對(duì)AFB1降解率影響的排序?yàn)椋禾幚黼妷?A)>放電時(shí)間(B)>AFB1初始濃度(C)。

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

續(xù)表3

方差來源平方和自由度均方F值P值顯著性C24．5314．531．940．2067?殘差16．3872．34失擬項(xiàng)13．1934．405．510．0664?純誤差3．1940．8073．71總差1568．6516R21552．27

注：*為差異不顯著(P>0.05)；**為差異顯著(P<0.05)；***為差異極顯著(P<0.01)。

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行回歸分析擬合，可得各因素與AFB1降解率之間的回歸方程：

Y=74.36+11.37A+6.18B-2.27C-1.17AB+1.88AC-0.30BC+4.85A2-3.63B2+1.04C2。

圖7顯示，在AFB1初始濃度為10 mg/L時(shí)，處理電壓和放電時(shí)間對(duì)AFB1降解率的交互作用。可知，處理電壓一定時(shí)，隨著放電時(shí)間的增大，AFB1的降解率增大。當(dāng)放電時(shí)間一定，處理電壓增大時(shí)，AFB1的降解率呈上升趨勢(shì)，而且響應(yīng)面顯示坡度較陡，表明放電時(shí)間和處理電壓的交互作用顯著。

圖7 處理電壓與放電時(shí)間交互影響AFB1降解率的響應(yīng)面圖

圖8顯示，在放電時(shí)間為200 s時(shí)，處理電壓和AFB1初始濃度對(duì)AFB1降解率的交互作用。處理電壓一定時(shí)，隨著AFB1初始濃度的增加，AFB1的降解率減少，但變化幅度不大。當(dāng)AFB1初始濃度一定時(shí)，隨著處理電壓的增大，AFB1的降解率不斷增大。因此，在AFB1初始濃度和處理電壓兩個(gè)因素相互影響下，處理電壓對(duì)響應(yīng)值的影響大。

圖8 處理電壓與AFB1初始濃度交互影響AFB1降解率的響應(yīng)面圖

圖9 放電時(shí)間與AFB1初始濃度交互影響AFB1降解率的響應(yīng)面圖

圖9顯示，在處理電壓165 V時(shí)，放電時(shí)間和AFB1初始濃度對(duì)AFB1降解率的交互作用。當(dāng)放電時(shí)間一定時(shí)，AFB1的降解率隨著AFB1初始濃度的增大而減少。當(dāng)AFB1初始濃度一定時(shí)，隨著放電時(shí)間的增加，AFB1的降解率不斷增大。

2.4 最佳實(shí)驗(yàn)條件的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證

通過回歸模型的預(yù)測(cè)，得到常壓等離子體降解AFB1的最佳實(shí)驗(yàn)條件：處理電壓170 V、放電時(shí)間236 s、AFB1初始濃度5 mg/L、放電間距2 cm,此時(shí)AFB1理論降解率的最大值為93.94%。在此最佳實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，AFB1的降解效果達(dá)到92.45%，與模型預(yù)測(cè)值相接近，偏差為1.49%，得到AFB1降解前后的高效液相色譜圖見圖10。

圖10顯示，乙腈中AFB1經(jīng)常壓等離子體處理后有明顯的降解效果。

圖10 常壓等離子體降解前后乙腈中AFB1的高效液相色譜圖

3 結(jié)論

常壓等離子體對(duì)乙腈中的AFB1具有很好的降解作用。AFB1的降解率與處理電壓、放電時(shí)間呈正相關(guān)；與放電間距、AFB1初始濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

常壓等離子降解乙腈中的AFB1的最佳工藝條件為處理電壓170 V、放電時(shí)間236 s、AFB1初始濃度5 mg/L、放電間距2 cm。AFB1的降解率高達(dá)92.45%，與模型預(yù)測(cè)值93.94%相接近，偏差為1.49%。說明該模型可用于常壓等離子體對(duì)乙腈中黃曲霉毒素B1降解效果的預(yù)測(cè)。

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