組合抗生素抗性選育多殺菌素高產(chǎn)菌株

王海霞，陳 園，王 超，黎 琪，陳 新，張曉琳

(1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院， 湖北 武漢 430023；2.國家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037)

多殺菌素(spinosad)，是由土壤放線菌刺糖多孢菌(saccharopolysporaspinosa)在有氧條件下發(fā)酵生成的胞內(nèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有殺蟲活性高、殺蟲譜廣、對(duì)非靶標(biāo)動(dòng)物安全等優(yōu)點(diǎn)[1-2]，是唯一由美國環(huán)保署(US Environmental Protection Agency)于1999、2008和2010年先后3次被授予“總統(tǒng)綠色化學(xué)品挑戰(zhàn)獎(jiǎng)”(The US-EPA Presidential Green Chemistry Challenge Award)的殺蟲劑[3]。多殺菌素已在20多個(gè)國家的2百多種作物上完成登記注冊(cè)，我國已經(jīng)登記注冊(cè)的多殺菌素產(chǎn)品有Success?(菜喜，多殺菌素含量為2.5%)和Tracer?(催殺，多殺菌素含量為48%)[4-5]。目前多殺菌素的生產(chǎn)被美國陶氏益農(nóng)公司(Dow AgroSciences)獨(dú)家壟斷，國內(nèi)適合多殺菌素生產(chǎn)的工業(yè)化菌種及發(fā)酵生產(chǎn)工藝尚未見報(bào)道。因此，快速有效地提高多殺菌素的產(chǎn)量以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)意義重大。

經(jīng)過近十年的研究，人們對(duì)多殺菌素的結(jié)構(gòu)性質(zhì)、理化性質(zhì)、生物合成途徑等都有了較深入的研究。由于刺糖多孢菌的遺傳背景復(fù)雜，分子生物學(xué)改造困難，常規(guī)選育方法仍然是獲得高產(chǎn)菌株的有效手段[6]。但傳統(tǒng)誘變育種高產(chǎn)頻率極低，產(chǎn)量提高幅度小，篩選過程中的實(shí)驗(yàn)誤差會(huì)抵消變異株產(chǎn)量提高的幅度，另外篩選工作量大，周期長，如果篩選方法不合理、不科學(xué)，篩選工作成效將很小[7]。抗生素抗性篩選是基于微生物對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性發(fā)展起來的菌株選育改良技術(shù)，它具有易操作、無需特殊設(shè)備、不需要菌株遺傳背景知識(shí)且效果顯著等特點(diǎn)[8]。國內(nèi)外研究者圍繞著抗生素抗性篩選技術(shù)選育抗生素高產(chǎn)菌株進(jìn)行了大量相關(guān)研究，如HU H F和OCHI K[9]向天藍(lán)色鏈霉菌A3中引入鏈霉素、慶大霉素和利福平的3種抗性，獲得的抗性突變株放線紫紅素的產(chǎn)量是野生株的48倍；HU H F[10]等人向變鉛青鏈霉菌66的rpoB基因中引入利福平抗性突變，結(jié)果變鉛青鏈霉菌66放線紫紅素(Act)、十一烷基靈紅菌素(Red)和鈣依賴性抗生素(CDA)的生物合成被大幅激活，這些抗生素在變鉛青鏈霉菌66引入抗性突變前是不產(chǎn)生或者產(chǎn)生極少的。本研究采用抗生素抗性篩選技術(shù)選育多殺菌素高產(chǎn)菌，通過在不同濃度梯度的鏈霉素(streptomycin，Str)、慶大霉素(gentamicin，Gen)、利福平(rifampicin，Rif)和氯霉素(chlorampenicol，Chl)平板上對(duì)刺糖多孢菌進(jìn)行逐級(jí)抗性篩選，比較多殺菌素的發(fā)酵產(chǎn)量，以確認(rèn)組合抗性篩選技術(shù)在選育多殺菌素高產(chǎn)菌株上的可行性。

1 材料與方法

1.1 菌種

出發(fā)菌株S.spinosaASAGF W2由國家糧食局科學(xué)研究院發(fā)酵生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室篩選和保藏。

1.2 培養(yǎng)基

斜面和平板培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，酪蛋白胨0.25 g/L，瓊脂15.0 g/L，pH 7.2。

搖瓶種子培養(yǎng)基：葡萄糖15.0 g/L，可溶性淀粉10.0 g/L，豆餅粉3.0 g/L，棉籽蛋白3.0 g/L，大豆蛋白胨25.0 g/L，MgSO4·7H2O 2.0 g/L，pH 7.2。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖60.0 g/L，棉籽蛋白20.0 g/L，NaCl 3.0 g/L，K2HPO4·3H2O 0.2 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g/L，CaCO31.0 g/L，pH 7.2。

上述培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌25 min。

1.3 主要試劑和儀器設(shè)備

CH3CN和CH3OH(色譜純)：德國Merck公司；spinosad標(biāo)準(zhǔn)品(純度為98%)：美國Sigma公司；鏈霉素、慶大霉素、氯霉素和利福平：生工生物工程(上海)股份有限公司。

SEM-X瑞士科耐搖床：瑞士阿道夫科耐公司；HPS-400生化培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；Eppendorf AG 22331 Hamburg型離心機(jī)：德國Eppendorf公司；Waters 515/2487型高效液相色譜儀：美國Waters公司。

1.4 S.spinosa的抗性篩選

1.4.1 孢子懸液的制備

取一支培養(yǎng)成熟的刺糖多孢菌新鮮斜面，用無菌水洗下孢子，濾除菌絲體，調(diào)整孢子濃度為108個(gè)/mL，孢子萌發(fā)備用。

1.4.2 最小抑制濃度(MIC)的測定

將高產(chǎn)菌株的孢子懸液涂布于不同濃度的抗生素平板，置于29 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～10 d，抗生素平板設(shè)計(jì)如表1所示。以不含抗生素平板上的菌落生長情況為對(duì)照，顯著抑制菌落生長的抗生素最低濃度為最小抑制濃度(MIC)。

表1 抗生素濃度梯度 μg/mL

1.4.3 抗生素抗性篩選濃度的確定

郭衛(wèi)寰[11]等人在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在自發(fā)突變情況下抗生素濃度大于最小抑制濃度很難有單菌落生長，即使處于最小抑制濃度下也鮮有單菌落生長。且在本次研究中發(fā)現(xiàn)，利福平和氯霉素對(duì)刺糖多孢菌的菌落形態(tài)改變較大，當(dāng)分別達(dá)到最小抑制濃度時(shí)，菌落小、形態(tài)不規(guī)則且孢子不豐富，因此，本研究以不含抗生素平板上的菌落形態(tài)和數(shù)量為對(duì)照，抗生素的篩選濃度設(shè)計(jì)為有顯著抑制作用且菌落形態(tài)良好的劑量濃度，抗生素濃度梯度如表2所示。

表2 抗生素抗性篩選濃度 μg/mL

1.4.4 抗生素抗性篩選方法

采用2種途徑向出發(fā)菌株ASAGF W2引入低濃度鏈霉素、慶大霉素、利福平和氯霉素4種抗生素的抗性，流程如圖1所示。途徑一是將4種抗生素的抗性通過含有抗生素的平板逐級(jí)引入，標(biāo)記為非GYM組；由于純培養(yǎng)和純種是決定突變效果的關(guān)鍵[12]，因而途徑二是將分離的抗性突變株經(jīng)純培養(yǎng)之后通過抗生素平板引入下一種抗性，標(biāo)記為GYM組，利用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行多殺菌素高產(chǎn)菌株的選育。

圖1 抗生素抗性篩選流程圖

1.5 多殺菌素的HPLC檢測

取一定體積發(fā)酵液，加入2倍體積的甲醇，振蕩30 s后靜置30 min，5 600×g離心20 min，取上清液進(jìn)行HPLC分析，分析條件為C18反相柱(ZORBAX EcllipeXDB-C18，4.6 mm×100 mm，3.5 μm)，流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=45∶45∶10(含0.05%乙酸銨)，進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min，檢測波長244 nm。多殺菌素的主要活性成分是A組分 spinosyn A(85%～90%)和 D組分 spinosynD(10%～15%)[13]，根據(jù)多殺菌素A和D組分的積分面積，參照標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算其質(zhì)量濃度，A和D組分之和即為多殺菌素發(fā)酵產(chǎn)量。

1.6 突變株遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證

將初篩選出的高產(chǎn)突變菌進(jìn)行搖瓶產(chǎn)量驗(yàn)證，連續(xù)轉(zhuǎn)接5次，驗(yàn)證突變菌的遺傳穩(wěn)定性。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.6和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行比較處理和顯著性分析。在系統(tǒng)誤差存在的條件下，初篩突變菌發(fā)酵產(chǎn)量是出發(fā)菌株110%以上的菌株統(tǒng)計(jì)為正突變菌；發(fā)酵產(chǎn)量是出發(fā)菌株產(chǎn)量90%以下的菌株統(tǒng)計(jì)為負(fù)突變菌。計(jì)算公式為：

正(負(fù))突變率=正(負(fù))突變菌株數(shù)/初篩總菌株數(shù)×100%

(1)

RVP=P/CP×100%

(2)

公式(2)中RVP為初篩發(fā)酵產(chǎn)量相對(duì)值，P為初篩抗性突變菌的發(fā)酵產(chǎn)量，CP為出發(fā)菌株ASAGF W2發(fā)酵產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 最小抑制濃度的確定

取一定量的ASAGF W2孢子懸液，涂布于不同濃度的抗性平板，獲得鏈霉素、慶大霉素、利福平、氯霉素對(duì)ASAGF W2的最小抑制濃度分別為0.5、10、500、2.5 μg/mL，如表3～表6所示。

表3 不同濃度鏈霉素對(duì)ASAGF W2菌落生長的抑制作用

注：“+”代表菌落數(shù)目的多少；“-”代表菌落數(shù)量非常稀少，約0～5個(gè)/平板。下同。

表4 不同濃度的慶大霉素對(duì)ASAGF W2的抑制作用

表5 不同濃度的利福平對(duì)ASAGF W2的抑制作用

表6 不同濃度氯霉素對(duì)ASAGF W2菌落生長的抑制作用

2.2 不同抗生素組合對(duì)S.spinosa合成多殺菌素的影響

本研究以4種抗生素最小抑制濃度為依據(jù)，每種抗生素設(shè)立2個(gè)篩選濃度，通過構(gòu)建抗生素種類、濃度以及抗性引入順序多樣性的篩選組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，探索其對(duì)S.spinosa的多重抗性篩選效果?？剐酝蛔兙姆蛛x以抗生素平板上菌落的數(shù)目(10～20個(gè))和菌落形態(tài)多樣化為選擇依據(jù)，實(shí)驗(yàn)中在非GYM組和GYM組各獲得3條抗生素組合鏈，分別為A1、A2、A3和B1、B2、B3，共分離得到突變菌714株，結(jié)果如表7和圖2所示。

表7 抗生素篩選組合結(jié)果統(tǒng)計(jì)

注：抗生素組合Aa中A表示抗生素種類，a表示抗生素的篩選濃度，單位為μg/mL，如Str0.5Gen10Rif200Chl1表示通過0.5 μg/mL鏈霉素平板、10 μg/mL慶大霉素平板、200 μg/mL利福平平板、1 μg/mL氯霉素平板逐級(jí)向出發(fā)菌株ASAGF W2引入對(duì)應(yīng)的抗生素抗性。

1～12為非GYM組篩選組合，13～24為GYM組篩選組合。圖2 不同抗生素組合的正負(fù)突變率

結(jié)果如圖2所示，抗性篩選產(chǎn)生正突變率的抗生素組合共有16個(gè)，其中來源于編號(hào)17(Chl1Gen10Rif200Str0.5，GYM組)的4重抗性篩選正突變率最高，為50%；經(jīng)過5輪復(fù)篩獲得的1株遺傳性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)突變株來源于編號(hào)4(Str0.5Gen10，非GYM組)，產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了23.87%；由表7和圖2可看出編號(hào)為5、7、8、16、19、20、22和24的抗生素組合正突變率為0，編號(hào)20(Str0.5Gen10Rif200Chl1，GYM組)出現(xiàn)了11.11%的負(fù)突變率，且經(jīng)過搖瓶發(fā)酵檢測出的RVP最高值是108.82%，考慮實(shí)驗(yàn)誤差因素，說明這8個(gè)抗生素組合對(duì)S.spinosa的產(chǎn)多殺菌素能力無明顯的促進(jìn)作用。

2.3 比較GYM組和非GYM組對(duì)S.spinosa發(fā)酵性能的影響

將GYM組和非GYM組中對(duì)應(yīng)相同的抗生素組合進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以每個(gè)組合分離出的突變菌的RVP值作為比較對(duì)象，以發(fā)酵的菌株數(shù)為樣本量，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果如表8所示。只有Str0.5Gen10Rif200的最高RVP值差異顯著(P<0.05)，Str0.5Rif200Chl1Gen10的RVP值處于差異性不顯著的臨界(P=0.063>0.05)，其余5個(gè)組合的RVP值差異性不顯著(P>0.05)。

表8 GYM組和非GYM組抗性突變株發(fā)酵性能的比較

注：用比較均值中的獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)法進(jìn)行兩組數(shù)據(jù)比較。每行標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)。

以抗生素組合對(duì)S.spinosa產(chǎn)多殺菌素的作用效果為依據(jù)，由表7和圖2可知，有顯著性差異的抗生素組合Str0.5Gen10Rif200在非GYM組和GYM組兩種方法中的RVP最高值分別為120.86%和105.35%，正突變率分別為27.27%和0，可見非GYM組方法中的抗生素組合Str0.5Gen10Rif200對(duì)S.spinosa產(chǎn)多殺菌素的作用效果更顯著。

從育種速率上進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，以抗生素組合Str0.5Gen10Rif200為例，GYM組和非GYM組2種方法完成3重抗性篩選，前者所需時(shí)間是后者的1.7倍。因此，非GYM組是較適的抗生素抗性篩選方法。

2.4 高產(chǎn)突變株的篩選及穩(wěn)定性驗(yàn)證

將出發(fā)菌株ASAGF W2進(jìn)行抗生素抗性篩選，初篩共獲得發(fā)生正突變的35株突變菌，結(jié)果如表9所示，由于突變體在傳代中可能出現(xiàn)表型延遲現(xiàn)象，導(dǎo)致篩選到的高產(chǎn)菌株轉(zhuǎn)接后發(fā)酵產(chǎn)量降低，因此，對(duì)初篩獲得的35株高產(chǎn)突變菌連續(xù)轉(zhuǎn)接5次進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證，結(jié)果如圖3所示，獲得4株多殺菌素發(fā)酵產(chǎn)量較出發(fā)菌株平均提高13%以上的突變菌，其中突變株13-8-1來源于非GYM組Str0.5Gen10的雙重抗性篩選，多殺菌素平均發(fā)酵產(chǎn)量較出發(fā)菌株ASAGF W2提高了23.87%。連續(xù)轉(zhuǎn)接5次，菌株13-8-1、I-8-1、I-8-3、F-24-1發(fā)酵產(chǎn)量提升值的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.22%、0.83%、1.44%、1.57%，組內(nèi)個(gè)體間的離散程度總體在2%以內(nèi)。結(jié)果表明，篩選獲得4株遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)突變菌。

表9 高產(chǎn)突變菌搖瓶初篩發(fā)酵產(chǎn)量

圖3 搖瓶復(fù)篩驗(yàn)證遺傳穩(wěn)定性

2.5 高產(chǎn)突變菌和出發(fā)菌株發(fā)酵性能的比較

為了進(jìn)一步研究高產(chǎn)突變菌的特性，本實(shí)驗(yàn)將突變菌13-8-1和出發(fā)菌株ASAGF W2在同一發(fā)酵時(shí)間內(nèi)生物量、葡萄糖消耗以及多殺菌素產(chǎn)量做比值，并以此為縱坐標(biāo)進(jìn)行曲線分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 突變菌13-8-1和出發(fā)菌株ASAGF W2發(fā)酵性能的比較曲線

根據(jù)圖4分析發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵初期(第1～2 d)和發(fā)酵后期(第5～7 d)，突變菌13-8-1生長速度優(yōu)于出發(fā)菌株ASAGF W2，生物量增加至出發(fā)菌株的110%以上。

從2株菌的代謝曲線可知，生物量增長與多殺菌素的合成為半偶聯(lián)型。具體表現(xiàn)在：從發(fā)酵中期開始(發(fā)酵第3 d)，突變株13-8-1的多殺菌素發(fā)酵產(chǎn)量迅速增加并在發(fā)酵第4 d超越出發(fā)菌株ASAGF W2；在發(fā)酵后期，發(fā)酵產(chǎn)量相對(duì)值從104%上升至123%，突變株13-8-1表現(xiàn)出更加優(yōu)越的產(chǎn)多殺菌素的能力。由以上推斷突變株13-8-1的生長整體呈現(xiàn)出二次生長的現(xiàn)象，在發(fā)酵初期調(diào)整期較短，較快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，生物量迅速增加，進(jìn)入穩(wěn)定期后開始大量產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物多殺菌素。據(jù)此推測，在菌株二次生長過程中，提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)，增加菌體的生物量，并延長菌體生長穩(wěn)定期，可能會(huì)進(jìn)一步提高多殺菌素的產(chǎn)量。

此外，pH的變化和葡萄糖的消耗也反映出發(fā)酵液中菌絲體的生長和多殺菌素的生產(chǎn)周期。影響發(fā)酵液pH有2個(gè)因素：一是葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)快速被消耗，發(fā)酵液pH降低；二是氮源物質(zhì)的利用及營養(yǎng)物質(zhì)匱乏時(shí)菌體發(fā)生自溶會(huì)導(dǎo)致溶液中氨離子釋放，發(fā)酵液pH升高。在整個(gè)發(fā)酵過程中，突變株13-8-1較出發(fā)菌株ASAGF W2耗糖速率慢，且前者的發(fā)酵液pH相較后者高。由此可推斷突變菌 13-8-1對(duì)于碳源和氮源營養(yǎng)物質(zhì)的利用較均衡，有利于菌體生物量的增加和多殺菌素的合成。

3 結(jié)論

本研究考察了組合抗生素抗性篩選對(duì)S.spinosa產(chǎn)多殺菌素的作用效果，結(jié)果顯示抗性篩選技術(shù)能夠使菌株的遺傳性狀發(fā)生改變，抗生素篩選組合的正突變率與高產(chǎn)性狀及其穩(wěn)定性無明顯的相關(guān)性。本研究對(duì)初篩獲得的35株高產(chǎn)突變菌經(jīng)過復(fù)篩驗(yàn)證，最終獲取4株遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)突變菌。將抗生素抗性篩選應(yīng)用于刺糖多孢菌的選育是一種簡單易行且效果顯著的方法。

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