糖尿病心肌PTEN蛋白表達(dá)變化及其在糖尿病心肌IPo中的影響

梁德賢　李慶軍　陳康榮

[摘要]目的：分析糖尿病心肌PTEN蛋白表達(dá)變化及其在糖尿病心肌IPo中的作用。方法：選取健康成年SD大鼠，腹腔注射1%鏈脲佐菌素（STZ）（60mg/kg）誘導(dǎo)糖尿病模型。對(duì)照組給予等量的生理鹽水。將糖尿病大鼠和非糖尿病大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組（Sham）；缺血/再灌注組（IR）；缺血后處理組（IP0）。部分亞組糖尿病大鼠在缺血前1h用trFEN抑制劑BPV（HOpic）干預(yù)后再進(jìn)行缺血/再灌注損傷實(shí)驗(yàn)。免疫組化方法分析心肌PTEN、PI-3K、p-Akt的表達(dá)；TYC法檢測(cè)心肌梗死面積；TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。比較非糖尿病與糖尿病組及BPV干預(yù)前后糖尿病各組相應(yīng)指標(biāo)的變化。結(jié)果：IPo明顯降低了非糖尿病鼠心肌細(xì)胞中PTEN的表達(dá)，增加了H-3K和p-Akt的表達(dá)，但未能減少PTEN在糖尿病鼠心肌中的表達(dá)，相應(yīng)的Pl-3K和p-Akt的表達(dá)也無明顯改變。與N+S組相比，N+IR及N+IPo組的凋亡指數(shù)增高（P<0.05）。但是經(jīng)后處理干預(yù)后N+IPo組的凋亡指數(shù)低于N+IR組（P<0.05）。與DM+S組相比，DM+IR及DM+IPo組的凋亡指數(shù)增高（P<0.05），但后處理并沒有減少糖尿病心肌的凋亡指數(shù)。與N+IR相比，N+IPo的梗死面積減少（P<0.05）。然而，DM+IR組與DM+IPo組的梗死面積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.06）。BPV干預(yù)各組的心肌PI-3K及P-Akt的表達(dá)高于未干預(yù)各組（P<0.05）。與未經(jīng)BPV干預(yù)的各組相比，被干預(yù)各組的心肌凋亡細(xì)胞減少。心肌梗死面積比較BPV干預(yù)的各組心肌梗死減少。結(jié)論：高血糖導(dǎo)致心肌PTEN高表達(dá)使PI-3K/Akt信號(hào)通路失活，是導(dǎo)致IPo對(duì)心肌IRI保護(hù)作用喪失的一個(gè)重要原因。

[關(guān)鍵詞]糖尿??；缺血再灌注損傷；缺血后處理；PTEN；BPV

有研究發(fā)現(xiàn)PTEN（Phosohatase and tensin honologdeleted on chromosometen，PTEN）是PI-3K/Akt信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)控因子。它起初被發(fā)現(xiàn)是一種腫瘤抑制基因。后來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)它在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長和凋亡中也起到重要作用。有研究顯示，與非糖尿病大鼠相比，糖尿病大鼠體內(nèi)PTEN的表達(dá)明顯增多，并會(huì)隨著病程的延長增加其表達(dá)的程度。增加PTEN的活性會(huì)使胰島素的敏感性下降，并且會(huì)增加2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。Mensah等人實(shí)驗(yàn)證明，通過阿托伐他汀進(jìn)行IPC，可通過激活PT-3K/Akt信號(hào)通路，對(duì)非糖尿病大鼠心肌IRI產(chǎn)生保護(hù)作用，但對(duì)糖尿病大鼠心肌IRI的療效顯著降低，其主要原因是由于PTEN的拮抗作用。Crackower等人通過對(duì)mN半量表達(dá)的PTEN+/-小鼠離體心臟的研究表明，在P1EN+/-的小鼠體內(nèi)，Akt的活性明顯增加，經(jīng)4周期的預(yù)處理PTEN+/-組的心肌梗死面積明顯小于6周期預(yù)處理的PTEN+/+對(duì)照組。因此可以看出P1EN在糖尿病心肌IRI中也扮演著重要的角色。然而關(guān)于PTEN在缺血后處理（Ischemic postconditioning，IPo）的作用機(jī)制中發(fā)揮著怎樣的作用，以及IPo對(duì)糖尿病心肌IRI保護(hù)作用的消失是否與糖尿病心肌中PTEN高表達(dá)有關(guān)，現(xiàn)在還不十分清楚。因此，本研究擬探討糖尿病心肌PTEN蛋白表達(dá)變化及其在糖尿病心肌IPo中的作用。對(duì)比IPo對(duì)糖尿病和非糖尿病心肌PTEN/PI-3K/Akt信號(hào)通路的影響情況，及其對(duì)心肌IRI的改善情況；觀察抑制PTEN的表達(dá)是否能改善糖尿病心肌的損傷程度；證明糖尿病心肌PTEN的高表達(dá)是導(dǎo)致心肌IRI耐受力降低和IPo保護(hù)作用消失的重要原因。

1.材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：220～280g成年SD大鼠130只，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。主要試劑及儀器：SureStep血糖儀、血糖試紙（美國強(qiáng)生公司）；Bene View T5型監(jiān)護(hù)儀（西安巨田醫(yī)療設(shè)備有限公司）；DW-2000型動(dòng)物呼吸機(jī)（上海嘉鵬科技有限公司）；高精度電子天平（精度0.0001g，上海越平科學(xué)儀器有限公司）；SHHW21Gr600恒溫水浴箱（北京長安科學(xué)儀器廠）；Olympus顯微鏡（日本Olympus公司）；Olympus BXS0顯微攝影系統(tǒng)（日本Olympus公司）；EPSON-V30掃描儀（日本Epson公司）；ImageProPlus6.0計(jì)算機(jī)圖像分析軟件（美國Media Cyberneties）；鏈脲佐菌素（Streptozoein，STZ），美國Sigma公司；戊巴比妥鈉（Pentobarbital），美國Sigma公司；伊文氏藍(lán)（Evans blue），美國Sigma公司；三苯基氯化四氮唑（TTC），美國Sigma公司；Bpv（HOpic），瑞士Alexis公司；PTEN單克隆抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；P13K（P85cL亞型）單克隆抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；P-Akt（ser-473）單克隆抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；免疫組化試劑盒，武漢博士德生物制品有限公司；TUNEL試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2方法 糖尿病大鼠及非糖尿病大鼠模型的建立：220～280g成年SD大鼠130只，喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為糖尿病組（n=90）和非糖尿病組（n=40），所有大鼠禁食12小時(shí)。腹腔注射1%STZ60mg/kg誘導(dǎo)糖尿病模型，非糖尿病組的大鼠腹腔注射等量的生理鹽水，其余操作同糖尿病組大鼠。72h后禁食4h，斷尾取血測(cè)空腹血糖。當(dāng)血糖濃度≥16.7mmol/L，并且出現(xiàn)多飲、多食、多尿的癥狀表示糖尿病鼠模型誘導(dǎo)成功。模型成功后監(jiān)測(cè)大鼠血糖和體重，每2周一次。所有大鼠普食喂養(yǎng)8周。8周后進(jìn)行手術(shù)。淘汰標(biāo)準(zhǔn)：①血糖濃度<16.7mmol/L的大鼠，②飼養(yǎng)過程中死亡的大鼠。

實(shí)驗(yàn)分組：造模成功的糖尿病和非糖尿病大鼠隨機(jī)分為9組，實(shí)驗(yàn)過程中剔除造模未成功和手術(shù)過程中死亡的模型，具體實(shí)驗(yàn)分組如下：非糖尿病+假手術(shù)組（N+s組）：n=9；糖尿病+假手術(shù)組（DM+S組）：n=9；非糖尿病+缺血再灌注組（N+IR組）：n=15；糖尿病+缺血再灌注組（DM+IR組）：n=15；非糖尿病+缺血后處理組（N+IPo組）：n=15；糖尿病+缺血后處理組（DM+IPo組）：n=15；糖尿病+假手術(shù)組+抑制劑組（B+DM+S組）：n=9；糖尿病+缺血再灌注+抑制劑組（B+DM+IR組）：n=15；糖尿病+缺血后處理+抑制劑組（B+DM+IPo組）：n=15。以上標(biāo)有“*”的各組中6個(gè)心臟標(biāo)本用于TFC，另外9個(gè)和非“*”的各組標(biāo)本全部用于組織包埋。