激光捕獲顯微切割技術(shù)結(jié)合iTRAQ標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組在結(jié)腸癌篩查中的應(yīng)用研究

穆儀冰+張桂英

[摘要] 目的 采用激光捕獲顯微切割技術(shù)（LCM）結(jié)合iTRAQ標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組技術(shù)，篩查結(jié)腸癌間質(zhì)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)。 方法 ①選擇12對(duì)結(jié)腸腺癌標(biāo)本為觀察組，其配對(duì)正常結(jié)腸黏膜（與結(jié)腸癌標(biāo)本至少相距10 cm以上）為對(duì)照組，采用LCM技術(shù)分別純化其間質(zhì)作為生物樣本；② iTRAQ標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組技術(shù)鑒定兩組間的差異表達(dá)蛋白質(zhì)；③采用Geneontology生物信息學(xué)軟件（http：//pantherdb.org/）對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞成分、生物學(xué)途徑和分子功能分析。 結(jié)果 ①鑒定了70個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中37個(gè)蛋白在結(jié)腸癌間質(zhì)中高表達(dá)，33個(gè)蛋白在結(jié)腸癌間質(zhì)中表達(dá)降低；②從生物學(xué)途徑、細(xì)胞成分、分子功能三個(gè)方面對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。 結(jié)論 ①首次采用iTRAQ標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)和LCM結(jié)合的方法篩查結(jié)腸癌間質(zhì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)；②GO功能分析顯示了差異表達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)胞成分、分子功能以及生物學(xué)功能。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)腸癌；間質(zhì)；激光捕獲顯微切割；iTRAQ標(biāo)記定量蛋白組學(xué)；生物信息學(xué)

[中圖分類號(hào)] R735 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）03（c）-0026-05

The application of LCM combined with iTRAQ quantitative proteomic technology in colon cancer

MU Yibing1 ZHANG Guiying2

1. Department of Gastroenterology， the fourth hospital of Changsha， Hunan Province， Changsha 410008， China； 2. Department of Gastroenterology， Xiangya Hospital Central South University， Hunan Province， Changsha 410008， China

[Abstract] Objective To search differentially expressed proteins in colon cancer stroma （CS） by laser capture microdissection （LCM） combined with iTRAQ marker quantitative proteomic technique. Methods ①12 CS and adenocarcinoma tissues were selected as observation group， and normal mucosa （>10 cm away from adenocarcinoma） was selected as control group， the tissues were separated by LCM. ②iTRAQ quantitative proteomic technology was used to identified differentially expressed proteins（DEPs）.③ GENEONTOLOGY functional annotation（GO） was used for bioinformatics analysis （Cellular components， biological pathways and molecular functional analysis）. Results ①70 DEPs were identified in CS （37 upregulated and 33 downregulated）. ②The differentially expressed proteins were analyzed from three aspects： biological pathway， cell composition and molecular functio. Conclusion ① For the first time， 70 DEPs in CS by LCM and iTRAQ quantitative proteomic technology are identified. ② GO can be used to analysis the biology function of the 70 DEPs and provided important values to the pathology of colon cancer.

[Key words] Colon cancer； Stromal； Laser capturemicrodissection； iTRAQ-based quantitative proteomics； Bioinformatics analysis

腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到重視，現(xiàn)已成為當(dāng)今腫瘤研究的一個(gè)熱門話題。結(jié)腸癌是世界常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率位居歐美發(fā)達(dá)國家的第三位[1-2]。近年來，由于環(huán)境的惡化和飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整，我國結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升，嚴(yán)重危害了人民的生命和健康。目前，國內(nèi)外對(duì)于結(jié)腸癌的研究多集中在結(jié)腸癌的癌細(xì)胞本身，但對(duì)于結(jié)腸癌微環(huán)境的研究較少。

本研究從腫瘤微環(huán)境的角度出發(fā)，對(duì)比研究結(jié)腸癌間質(zhì)和正常結(jié)腸黏膜間質(zhì)蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異，首次采用激光捕獲顯微切割技術(shù)（laser capturemicrodissection，LCM）聯(lián)合iTRAQ標(biāo)記定量蛋白組學(xué)技術(shù)篩選結(jié)腸癌間質(zhì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)。從蛋白質(zhì)水平探討結(jié)腸癌間質(zhì)在腫瘤惡性化進(jìn)程中的作用，初步探索結(jié)腸癌微環(huán)境所獨(dú)有的特征，為尋找結(jié)腸癌診斷及治療標(biāo)志物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器 試劑：甲基綠、蛋白酶抑制劑、OCT組織包埋劑、十二烷基磺酸鈉（SDS）、二硫蘇糖醇（DTT）、苯三氟乙酸（TFA）、胰蛋白酶、iTRAQ試劑（118，121），SCX強(qiáng)陽離子交換柱（Luna SCX 100A）、strata-X C18除鹽柱。

儀器：Beckman L765超速離心機(jī)、徠卡CM1900冰凍切割機(jī)、激光捕獲顯微切割系統(tǒng)、CTR6000激光捕獲顯微切割儀、高效液相色譜儀（日本島津公司）、microTOF-Q II質(zhì)譜、UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜。

1.1.2 標(biāo)本采集及處理 12對(duì)結(jié)腸腺癌標(biāo)本均來自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院普外科手術(shù)切除標(biāo)本；其中男7例，女5例，患者平均年齡為（48±8）歲，臨床分期按照DUKES分期分為A-D期。所有病例術(shù)前未接受放療和化療，并經(jīng)病理學(xué)專家確診。手術(shù)切除的新鮮結(jié)腸癌組織與配對(duì)結(jié)腸黏膜組織相距至少10 cm。每塊組織取材1.0 cm×1.0 cm大小。取材后，迅速將標(biāo)本置于液氮速凍30 min，然后超低溫冰箱（-80℃）保存[3]。本研究經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且經(jīng)過患者知情同意后進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 樣本制備以及1D SPS-PAGE（一向聚丙烯酰胺凝膠電泳） 冰凍組織O.C.T包埋劑包埋，在Leica CM 1900冰凍切割機(jī)下切成8 μm厚連續(xù)冰凍切片后[4]。加入組織裂解液（7 mol/L Urea，4% chaps，5 mmol/L PMSF，0.5 mmol/L EDTA，100 mmol/L DTT），充分混合，4℃裂解1 h，Ultrasound 5 min（冰上），離心（20 000 g， 25 min），取上清。上清加入DTT至終濃度10 mmol/L。56℃水浴1 h，取出后，迅速加入1 AM至終濃度55 mmol/L，暗室靜置1 h。然后加入預(yù)冷丙酮（體積為4×樣本溶液體積），沉淀3 h（-20℃），離心（20 000 g，4℃）20 min，取沉淀。然后加入復(fù)溶緩沖液300 μL，終濃度為50%TEAB，0.1%SDS。20 000 g，4℃，超聲3 min助溶，用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度，-80℃保存?zhèn)溆?，并進(jìn)行一向聚丙烯酰胺凝膠電泳[4]。

1.2.2 iTRAQ標(biāo)記蛋白質(zhì) 118，121各標(biāo)記試劑中分別加入異丙醇70 μL，充分混合均勻。在結(jié)腸癌間質(zhì)或正常結(jié)腸間質(zhì)中分別加入iTRAQ試劑（結(jié)腸癌間質(zhì)：iTRAQTM reagent 118；正常結(jié)腸間質(zhì)：iTRAQTM reagent 121），混勻，室溫下孵育2 h，每管加入100 μL超純水，終止iTRAQ標(biāo)記反應(yīng)，室溫下孵育30 min，將被標(biāo)記的所有樣品混合混勻，冷凍干燥。然后，將各樣本進(jìn)行強(qiáng)氧離子交換色譜（HPLC）分離、C18反相色譜除鹽。

1.2.3 質(zhì)譜檢測(cè) 用microTOF-QII（Bruker.Daltonics，Germany）檢測(cè)肽段信號(hào)。質(zhì)譜分析采用信息依賴性獲取模式（information dependent acquisition mode，IDA）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。差異表達(dá)蛋白質(zhì)篩選需同時(shí)滿足下列條件[5]：①蛋白的鑒定有兩個(gè)或兩個(gè)以上獨(dú)特肽段；②兩組間比值≥1.3或≤0.667。

1.2.4 Geneontology在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析 為了對(duì)差異蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)有一個(gè)全面的認(rèn)識(shí)，進(jìn)行蛋白質(zhì)GO分析。采用GO分析軟件GENEONTOLOGY生物信息學(xué)軟件（http：//pantherdb.org/）分別從生物學(xué)途徑（GO_BP）、細(xì)胞成分（GO_CC）和分子功能（GO_MP）3個(gè)方面注釋。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)譜鑒定及分析

篩選到70個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)（表1），其中37個(gè)蛋白在結(jié)腸癌間質(zhì)中高表達(dá)，33個(gè)蛋白在腫瘤間質(zhì)中表達(dá)降低。這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)所涉及的功能分類主要有細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞骨架蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、代謝、炎性反應(yīng)等。

2.1.2 生物信息學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)中鑒定間質(zhì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)共70個(gè)，從生物學(xué)途徑、細(xì)胞成分、分子功能3個(gè)方面對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。

按照分子功能注釋，47.2%的差異蛋白屬于binding蛋白，包括DNA binding、RNA binding、核酸binding、GTP binding等；30.6%具有催化活性，17.0%的蛋白具有分子結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)活性，轉(zhuǎn)運(yùn)活性蛋白占2.8%，受體活性蛋白占2.8%，可能與這些蛋白的豐度較低有關(guān)。見圖1。

按照生物學(xué)途徑分類，參與生理調(diào)節(jié)的蛋白占25.0%，參與細(xì)胞代謝的蛋白占19.7%，參與細(xì)胞合成的蛋白占17.1%，與其他細(xì)胞及組織發(fā)生相互作用的的蛋白占10.5%，參與免疫調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)等蛋白所占比例較少。見圖2。

按照細(xì)胞成分注釋，這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)中的大多數(shù)屬于細(xì)胞內(nèi)蛋白，其中細(xì)胞器蛋白占27.3%，細(xì)胞膜蛋白占2.3%，細(xì)胞連接蛋白占2.3%，細(xì)胞外基質(zhì)占2.3%，細(xì)胞外蛋白占11.4%。見圖3。

3 討論

腫瘤微環(huán)境，即腫瘤細(xì)胞生長和生活的內(nèi)環(huán)境，它由許多間質(zhì)細(xì)胞組成，包括成纖維細(xì)胞、免疫和炎性細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及一些血管細(xì)胞等[6]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，間質(zhì)細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程中起著重要的促進(jìn)作用，間質(zhì)細(xì)胞可以通過產(chǎn)生細(xì)胞趨化因子、生長因子和基質(zhì)降解酶從而促進(jìn)血管生成和基底膜破壞，使腫瘤的侵襲能力增強(qiáng)[7-8]。對(duì)比研究腫瘤間質(zhì)細(xì)胞與正常組織間質(zhì)細(xì)胞的差別，將有助于發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境所獨(dú)有的特征。

因此，本研究首次采用LCM技術(shù)從新鮮的手術(shù)[J]. Expert Rev Anticancer Ther，2013，13（4）：439-450..

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（收稿日期：2016-11-15 本文編輯：李岳澤）