十二味菝葜顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

胡春曉，龐建云，汪小涵，沈成英，袁海龍#

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137； 2.空軍總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100142)

十二味菝葜顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

胡春曉1，2*，龐建云1，2，汪小涵1，2，沈成英2，袁海龍2#

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137； 2.空軍總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100142)

目的：建立十二味菝葜顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法對(duì)十二味菝葜顆粒中的菝葜、槐花、丹參、苦參進(jìn)行定性鑒別；采用高相液相色譜法對(duì)菝契和土茯苓的共同有效成分落新婦苷進(jìn)行含量測(cè)定，色譜柱為Inertsil?ODS-3色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，乙腈-0.1%磷酸(V∶V=16 ∶84)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為291 nm。結(jié)果：薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離度好。落新婦苷進(jìn)樣量在0.015 3～0.306 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2=0.999 9)。精密度、穩(wěn)定性與重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均<2%。平均回收率為100.22%(RSD為0.53%，n=6)。結(jié)論：薄層色譜法及高效液相色譜法易于操作、重復(fù)性好，可有效控制十二味菝葜顆粒的質(zhì)量。

十二味菝葜顆粒； 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 薄層色譜法； 高效液相色譜法

十二味菝葜顆粒是由菝契、土茯苓、槐花、丹參、苦參等12味中藥組成，是空軍總醫(yī)院的醫(yī)院制劑(批準(zhǔn)文號(hào)：總L2017001)，具有清熱解毒、涼血散血的功能，用于血熱型尋常型銀屑病的治療，亦可治療血虛、血燥型銀屑病兼有血熱者。為更好地控制該制劑的質(zhì)量、保證其臨床療效，本研究對(duì)方中菝葜、槐花、丹參、苦參進(jìn)行薄層色譜鑒別，并采用高相液相色譜法對(duì)制劑中君藥菝契和土茯苓的共同有效成分落新婦苷進(jìn)行定量研究。

1 材料

1.1 儀器

AgiLent 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)AgiLent公司)。

1.2 藥品與試劑

菝葜對(duì)照藥材(批號(hào)：121466-201403)、丹參對(duì)照藥材(批號(hào)：120923-201414)、蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：100080-201409)、苦參堿對(duì)照品(批號(hào)：110805-200508)、落新婦苷對(duì)照品(純度：93.9%，批號(hào)：111798-201504)，上述對(duì)照物質(zhì)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；十二味菝葜顆粒(規(guī)格：10 g/袋，自制，批號(hào)：20150504、20150505、20150506)；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 菝葜的色譜鑒別：參考相關(guān)文獻(xiàn)的方法[1-2]，取本品內(nèi)容物3 g，加乙醇50 ml，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液加鹽酸5 ml，加熱回流2 h，放冷，用40%氫氧化鈉溶液調(diào)至中性，蒸至無(wú)醇味，殘?jiān)脽崴?0 ml溶解，用二氯甲烷振搖提取2次(40、30 ml)，合并二氯甲烷提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。另取菝葜對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。按處方比例制備缺菝葜樣品，同法制得陰性對(duì)照溶液。參照《中華人民共和國(guó)藥典：2015年版》“通則0502”薄層色譜法，吸取上述3種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)已烷-乙酸乙酯(V∶V=4∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

1.菝葜對(duì)照藥材；2-4.供試品；5.陰性對(duì)照1.reference herb of Chinaroot Greenbier Rhizome；2-4.samples；5.negative sample圖1 菝葜TLC圖Fig 1 TLC chromatogram of Chinaroot greenbier rhizome

2.1.2 槐花的色譜鑒別：參考相關(guān)文獻(xiàn)的方法[3-4]，取本品內(nèi)容物1 g，加甲醇10 ml，密塞，振搖10 min，濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液。另取蘆丁對(duì)照品，加甲醇制成每1 ml含4 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按處方比例制備缺槐花樣品，同法制得陰性對(duì)照溶液。參照《中華人民共和國(guó)藥典：2015年版》“通則0502”薄層色譜法，吸取上述3種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(V∶V∶V=8 ∶1 ∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇試液顯色。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

1.蘆丁對(duì)照品；2-4.供試品；5.陰性對(duì)照1.reference substance of rutin；2-4.samples；5.negative sample圖2 槐花TLC圖Fig 2 TLC chromatogram of Sophorae flos

2.1.3 丹參的色譜鑒別：參考相關(guān)文獻(xiàn)的方法[5-6]，取本品內(nèi)容物2 g，加乙醚10 ml，振搖，放置1 h，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴? ml使溶解，作為供試品溶液。另取丹參對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。按處方比例制備缺丹參樣品，同法制得陰性對(duì)照溶液。參照《中華人民共和國(guó)藥典：2015年版》“通則0502”薄層色譜法，吸取上述3種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(V∶V∶V=6 ∶5 ∶0.8)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鐵溶液顯色。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

1.丹參對(duì)照藥材；2-4.供試品；5.陰性對(duì)照1.reference herb of Salviae miltiorrhizae radix et rhizoma；2-4.samples；5.negative sample圖3 丹參TLC圖Fig 3 TLC chromatogram of Salviae miltiorrhizae radix et rhizoma

2.1.4 苦參的色譜鑒別：參考相關(guān)文獻(xiàn)的方法[7-8]，取本品內(nèi)容物2 g，加水25 ml，超聲處理30 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液5 ml，置于分液漏斗中，加濃氨試液調(diào)節(jié)pH至11，用三氯甲烷振搖提取3次，每次20 ml，合并三氯甲烷液，置水浴后上蒸干，殘?jiān)尤燃淄? ml使溶解，作為供試品溶液。另取苦參堿對(duì)照品，加三氯甲烷制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按處方比例制備缺苦參樣品，同法制得陰性對(duì)照溶液。參照《中華人民共和國(guó)藥典：2015年版》“通則0502”薄層色譜法，吸取上述3種溶液各4 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二甲苯-乙酸乙酯-丙酮-濃氨試液(V∶V∶V∶V=2 ∶4 ∶3 ∶0.2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀試液。結(jié)果顯示，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖4。

1.苦參堿對(duì)照品；2-4.供試品；5.陰性對(duì)照1.reference substance of matrine；2-4.samples；5.negative sample圖4 苦參TLC圖Fig 4 TLC chromatogram of Sophorae flavescentis radix

2.2 高效液相色譜法測(cè)定落新婦苷的含量

參考相關(guān)文獻(xiàn)[9-10]，采用高效液相色譜法測(cè)定落新婦苷的含量。

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：色譜柱為Inertsil?ODS-3色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸(V∶V=16 ∶84)；流速為1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為291 nm；進(jìn)樣量為10 μl。理論板數(shù)按落新婦苷峰計(jì)算應(yīng)≥5 000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備：取落新婦苷對(duì)照品適量，精密稱定，加60%甲醇制成每l ml含15.3 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備：取本品約10 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入60%甲醇25 ml，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液5 ml，稀釋至10 ml，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備：按處方比例稱取除菝葜和土茯苓的其余藥味，按照制備工藝制成缺菝葜與土茯苓的陰性樣品，按照“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法操作，制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 專屬性考察：精密吸取供試品、對(duì)照品和陰性對(duì)照溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照色譜圖中，在與供試品及對(duì)照品色譜圖中相應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖5。

A.落新婦苷對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照樣品A.reference substance of astilbin；B.sample；C.negative sample圖5 菝葜HPLC圖Fig 5 HPLC chromatogram of Chinaroot greenbier rhizome

2.2.6 線性關(guān)系考察：分別精密吸取對(duì)照品溶液1、5、10、15、20 μl進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以峰面積(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X，μg)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y=337.49X+1.542 8，r2=0.999 9。結(jié)果表明，落新婦苷進(jìn)樣量在0.015 3～0.306 0 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液10 μl重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積值RSD=0.84%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，落新婦苷峰面積值的RSD=1.37%(n=6)，表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取同一批次樣品6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定含量。結(jié)果顯示，RSD=1.29%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn)：稱取十二味菝葜顆粒約5 g，精密稱定，精密加入一定量的落新婦苷對(duì)照品，按“2.2.1”項(xiàng)同法操作，測(cè)定落新婦苷的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.11 樣品的含量測(cè)定：分別稱取不同批號(hào)的十二味菝葜顆粒約10 g，精密稱定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 落新婦苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 落新婦苷含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立的十二味菝葜顆粒中菝葜、槐花、丹參、苦參的薄層色譜鑒別法以及落新婦苷的高效液相含量測(cè)定方法，簡(jiǎn)便可行，方法學(xué)考察結(jié)果表明該方法專屬性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于十二味菝葜顆粒的質(zhì)量監(jiān)控。本實(shí)驗(yàn)對(duì)三種不同類型的色譜柱進(jìn)行了考察，包括Kromasil 100-5C18色譜柱、Inertsil?ODS-3色譜柱、Arcus EP-C18色譜柱，發(fā)現(xiàn)Inertsil?ODS-3色譜柱的分離效果及峰形最好；考察了3種流動(dòng)相系統(tǒng)，包括乙腈-0.1%磷酸、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)基線平穩(wěn)，峰形較好，落新婦苷與其他組分達(dá)到基線分離，而乙腈-水系統(tǒng)峰形差，甲醇-0.1%磷酸系統(tǒng)各峰分離度較差，故選擇乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)為流動(dòng)相。

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Quality Standard for Shi’erwei Baqia ParticlesΔ

HU Chunxiao1，2, PANG Jianyun1，2, WANG Xiaohan1，2, SHEN Chengying2, YUAN Hailong2

(1.College of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan Chengdu 611137, China; 2.Dept.of Pharmacy, Air Force General Hospital of PLA, Beijing 100142, China)

OBJECTIVE：To establish the quality standard for Shi’erwei Baqia particles. METHDS: TLC was implemented to identify Chinaroot greenbier rhizome, Sophorae flos, Salviae miltiorrhizae radix et rhizoma and Sophorae flavescentis radix; and the common active ingredients in Chinaroot greenbier rhizome and Rhizoma smilacis glabrae was determined by HPLC method. The chromatographic column was Inertsil?ODS-3 column(250 mm×4.6 mm，5 μm), the mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid(V∶V=16 ∶84), with detection wavelength of 291 nm. RESULTS: Diagnostic and clear spots were showed in TLC chromatogram. Astilbin showed a good linear relationship in the range of 0.015 3-0.306 0 μg(r2=0.999 9). The relative standard deviation values of precision，stability and repeatability were less than 2%. The average recovery was 100.22%(RSD=0.53%，n=6). CONCLUSIONS: The method iseasy to carry out with a good reproducibilty, and could be used to control the quality of Shierwei Baqia particles.

Shierwei Baqia particles; Quality standard; Thin layer chromatography; High performance liquid chromatography

軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專項(xiàng)(No.13ZJZ12-5)

R927.2

A

1672-2124(2017)04-0438-04

2017-02-20)

*碩士研究生。研究方向：中藥新制劑、新劑型及新技術(shù)研究。E-mail：1940596849@qq.com

#通信作者：研究員，博士生導(dǎo)師。研究方向：中藥新型給藥系統(tǒng)。E-mail：yhlpharm@126.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.04.003