鹽酸蘭地洛爾原料藥中3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸的檢測方法學(xué)研究

王珊珊，王麗娟，李卓瓦，寧凡盛，王曉利，陳躍，陳相峰*

(1.山東省分析測試中心，山東 濟南250014；2.棗莊學(xué)院，山東 棗莊277000)

鹽酸蘭地洛爾原料藥中3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸的檢測方法學(xué)研究

王珊珊1，王麗娟1，李卓瓦2，寧凡盛1，王曉利1，陳躍1，陳相峰1*

(1.山東省分析測試中心，山東 濟南250014；2.棗莊學(xué)院，山東 棗莊277000)

為了檢測并控制合成鹽酸蘭地洛爾原料藥物的質(zhì)量，依托高效液相色譜-三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜建立了一種測定其中痕量基因毒性雜質(zhì)3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸的方法。方法采用多級反應(yīng)監(jiān)測模式，檢測靈敏度可達到0.50 mg/kg，加標回收率在91.9% ～ 97.8%之間，且精密度的相對標準偏差為3.28%(n=6)，均能滿足雜質(zhì)檢測的需要。該研究方法操作簡單、結(jié)果可靠，可實現(xiàn)快速、低成本檢測。

鹽酸蘭地洛爾；液相色譜-三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜；3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸；痕量檢測

Study on detecting method of 3-[4-(3-nitrobenzene sulfonyl oxygen radicals)

鹽酸蘭地洛爾是在艾司洛爾的基礎(chǔ)上進行結(jié)構(gòu)改進而獲得的化合物[1-3]，是一種選擇性的β1-腎上腺素能受體阻斷劑，主要拮抗存在于心臟的β1受體，通過抑制兒茶酚胺引起的心搏增加而改善心動過速性心律失常，具有超短效、高選擇性的優(yōu)點。臨床應(yīng)用于手術(shù)時和手術(shù)后心動過速性心律失常的緊急治療[4-6]，具有起效快，半衰期短，不良反應(yīng)較其他同類產(chǎn)品少，療效可靠的特點[7]。此外，蘭地洛爾在改善心肌缺血以及血液動力學(xué)方面表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢[8-12]。目前，該藥在國內(nèi)還處于研究階段，主要針對國外過期專利進行工藝改造，匹配相應(yīng)的藥物分析手段，以達到降低用藥成本的目的。

3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸(圖1)是合成鹽酸蘭地洛爾的必備原料，如果采用常規(guī)的液相色譜方法檢測，不僅檢測靈敏度達不到要求，其中的主成分鹽酸蘭地洛爾還對檢測有比較大的干擾。因此，為了檢測并控制合成鹽酸蘭地洛爾原料藥物中3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸的含量，保證該原料藥的質(zhì)量，本研究依托液相色譜-三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜建立了一種可對其進行定量檢測的方法[13-14]。該研究的樣品前處理方法簡便，檢測快速、準確且靈敏度高，可實現(xiàn)對鹽酸蘭地洛爾原料藥物中痕量3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸的檢測。

圖1 3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸的分子式Fig.1 The molecular structure of 3-[4-(3-nitrobenzene sulfonyl oxygen radicals) phenyl] propionic acid

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent-1200型快速分離高效液相色譜儀，6410型三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀(QQQ)(美國安捷倫科技有限公司)；Vortex-5型渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；Heraeus Multifuge X1R型高速冷凍離心機(美國賽默飛世爾科技公司)；AL104型天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)； 0.5～10 μL移液器(德國艾本德公司)；20～200 μL移液器(德國艾本德公司)；100～1 000 μL移液器(德國艾本德公司)。

1.2 試劑

色譜級甲酸(美國ROE科技公司)；色譜級甲醇(瑞典OceanPak公司)；色譜級乙腈(瑞典OceanPak公司)；娃哈哈飲用純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸(批號20140917，辰欣藥業(yè)股份有限公司)。

2 實驗方法

2.1 液相色譜-質(zhì)譜的檢測條件優(yōu)化

2.1.1 液相色譜檢測條件

本研究首先對3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸的液相檢測條件進行優(yōu)化，包括色譜柱型號、流動相選擇(甲醇、乙腈)、梯度洗脫條件等，以保證其在色譜柱上有較好的保留時間及良好的峰型，最終優(yōu)化后的條件為：XDB-C18色譜柱(4.6×50 mm，1.8 μm)；進樣量：5 μL；柱溫：30 ℃ ；流速：0.4 mL/min；流動相A：含0.1%(體積分數(shù))甲酸的水溶液；流動相B：乙腈溶液；柱后平衡3 min。流動相梯度條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件

2.1.2 質(zhì)譜檢測條件

利用濃度為500 ng/mL 的3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸的標準品，對其質(zhì)譜檢測的母離子質(zhì)荷比、子離子質(zhì)荷比、碎裂電壓(Fragmentor)、碰撞能量(CE)等條件及參數(shù)進行優(yōu)化，優(yōu)化后的檢測條件為：電噴霧離子源(ESI源)，負離子模式檢測，毛細管電壓4 000 V，四極桿溫度100 ℃，霧化壓力241 kPa，干燥氣溫度330 ℃，干燥氣流量12 L/min。具體MRM參數(shù)設(shè)置為：母離子質(zhì)荷比350；定量離子質(zhì)荷比為185.5，碎裂電壓100 V，碰撞能量15 eV；定性離子質(zhì)荷比為121.4，碎裂電壓100 V，碰撞能量25 eV。

2.2 樣品前處理方法

準確稱取鹽酸蘭地洛爾原料約40.0 mg，置10 mL容量瓶中，加入色譜甲醇10 mL，搖勻后超聲10 min，冷卻至室溫，加入色譜甲醇定容至刻度，作為鹽酸蘭地洛爾供試品溶液，濃度為4.00 mg/mL，取5.0 μL進入液相色譜-質(zhì)譜檢測。

2.3 專屬性實驗

精密稱定鹽酸蘭地洛爾樣品40.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加色譜甲醇定容至刻度，搖勻后超聲10 min，冷卻至室溫，加色譜甲醇定容至刻度，作為鹽酸蘭地洛爾空白樣品溶液(4.0 mg/mL)。

準確量取2.0 mL 10.0 mg/mL的3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸標準儲備液，置于100 mL量瓶中加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準溶液。

準確稱取鹽酸蘭地洛爾樣品40.0 mg，置于10 mL量瓶中，準確加入濃度為4.0 mg/mL的3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸標準溶液1.0 mL，加甲醇至刻度。搖勻后超聲10 min，作為鹽酸蘭地洛爾空白樣品加標溶液。

取上述溶液各5.0 μL進入液相色譜質(zhì)譜檢測，記錄總離子流圖。

2.4 系統(tǒng)適用性實驗

準確配制濃度為100 ng/mL的3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸標準溶液，重復(fù)進樣6次，每次5.0 μL，記錄目標化合物質(zhì)譜檢測峰面積，考察檢測方法的精密度。

2.5 標準曲線的測定

3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸標準儲備液的配制：準確稱取3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸標準品0.010 0 g，利用校準后的移液器準確加入1 000 μL的色譜級甲醇溶液溶解，配成濃度為10.0 mg/mL的標準溶液。將1 000 μL的10.0 mg/mL的標準溶液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加入色譜級甲醇溶液稀釋并定容至刻度，配成濃度為1.00 mg/mL的標準溶液儲備液I。準確移取1 000 μL濃度為1.00 mg/mL的標準溶液儲備液至100 mL容量瓶中，加入色譜級甲醇至刻度，配成濃度為10.0 μg/mL的標準儲備液II，備用。

精密量取標準儲備液II 1.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配成濃度為1.00 μg/mL的對照品溶液，然后用甲醇逐級稀釋配置成濃度分別為300、200、160、100、80、40、20 ng/mL的3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸標準曲線溶液。精密量取上述溶液各5.0 μL注入液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，記錄峰面積。以目標物濃度為橫坐標，以相應(yīng)目標物峰面積為縱坐標做回歸曲線，計算回歸方程及相應(yīng)的線性回歸系數(shù)。

2.6 定量限及檢出限的測定

用甲醇逐級稀釋濃度為10.0 μg/mL的3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸標準儲備液，配制濃度為20 ng/mL的標準溶液，作為3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸的定量限濃度，平行做3組，各進樣5.0 μL檢測。

用甲醇逐級稀釋濃度為10.0 μg/mL的3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸標準儲備液，配制濃度為2.0 ng/mL的標準溶液，作為3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸的檢出限濃度，平行做3組，各進樣5.0 μL檢測。

2.7 加標回收率的考察

精密稱取鹽酸蘭地洛爾樣品40.0 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻后超聲10 min，冷卻至室溫，加色譜甲醇至刻度，作為空白樣品溶液。平行制備3份。

稱取3份鹽酸蘭地洛爾樣品40.0 mg，置于10 mL量瓶中，分別加入1.00 μg/mL的 3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸標準溶液2.0、1.0、0.4 mL，再加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后超聲10 min，作為加標濃度200、100、40 ng/mL的加樣回收率試驗溶液。每個濃度平行制備3份。

精密量取上述供試品溶液5.0 μL注入液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，記錄樣品峰面積，并計算回收率。

2.8 方法精密度

由于樣品中無目標物檢出，取鹽酸蘭地洛爾樣品40.0 mg，置10 mL量瓶中，精確加入1.0 mL濃度為1.00 μg/mL的3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸標準溶液，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后超聲10 min，作為供試品溶液，平行測定3次，計算相對標準偏差。

2.9 溶液穩(wěn)定性

2.9.1 對照品溶液穩(wěn)定性

制備濃度為10 ng/mL的3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸的標準對照品溶液，分別于室溫放置0、2、4、8、12、24 h，精密量取5.0 μL注入液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測，記錄各目標化合物的質(zhì)譜檢測峰面積。

2.9.2 供試品溶液穩(wěn)定性

由于樣品溶液中無目標物檢出，參照樣品加標溶液的制備方法制備一份濃度為10 ng/mL的加標溶液，分別于室溫放置0、2、4、8、12、24 h，精密量取5.0 μL注入液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測，記錄各目標化合物的質(zhì)譜檢測峰面積。

2.10 實際樣品檢測

按照標準曲線配制方法制備標準曲線，并檢測鹽酸蘭地洛爾樣品3批。3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸的線性回歸方程為：Y=1 305.140 9X+79 700.654 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.993。

準確稱取樣品各40.0 mg(每批各2份)，置10 mL容量瓶中，精密加入甲醇至刻度，搖勻后超聲10 min，進樣5.0 μL，依法測定，代入標準曲線計算樣品中目標化合物的含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 專屬性實驗

利用建立的方法分別進樣檢測空白溶劑(甲醇)、鹽酸蘭地洛爾樣品及加標后的樣品，空白溶劑及鹽酸蘭地洛爾樣品中目標物均未出峰，加標后的樣品目標物的峰形良好，且空白溶劑、空白樣品對雜質(zhì)測定無干擾，見表2，圖2～3。

表2 專屬性實驗結(jié)果

圖2 鹽酸蘭地洛爾空白樣品檢測質(zhì)譜圖Fig.2 The mass spectrogram of landiolol blank sample

圖3 鹽酸蘭地洛爾空白樣品加標3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸的檢測質(zhì)譜圖Fig.3 The mass spectrogram of landiolol sample spiked with target analyte

3.2 系統(tǒng)適用性實驗

3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸標準品溶液重復(fù)進樣6次的檢測峰面積如表3所示，結(jié)果重復(fù)性良好，相對標準偏差為3.20%，符合精密度實驗要求。

表3 3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸精密度實驗結(jié)果

3.3 標準曲線

分別進樣濃度為300、200、160、100、80、40、20 ng/mL的3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸標準曲線溶液，以目標物濃度為橫坐標，以目標物峰面積為縱坐標做回歸曲線，得線性回歸方程為y=447.3x+30 018(R2=0.996)，如圖4所示。實驗結(jié)果表明，在20～300 ng/mL范圍內(nèi)，3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。

圖4 3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸標準曲線Fig.4 The calibration curve of target analyte obtained by the developed method

3.4 定量限及檢出限

根據(jù)表4中3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸定量限及檢出限的峰面積檢測結(jié)果顯示，定量限濃度為20.0 ng/mL，換算到鹽酸蘭地洛爾樣品中的檢測定量限為5.00 mg/kg；檢測限濃度為2.0 ng/mL，換算到鹽酸蘭地洛爾樣品中的檢測定量限為0.50 mg/kg。

表4 3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸定量限與檢出限檢測質(zhì)譜峰面積及標準偏差

3.5 加標回收率的考察

低、中、高3個濃度的樣品加標回收率結(jié)果見表5，數(shù)據(jù)顯示，樣品的加標回收率在92.47%～99.19%之間，平行3個樣品的相對標準偏差在0.70%～5.59%之間，表明該方法回收率良好，符合方法學(xué)實驗的要求。

表5 3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸加標回收率實驗的檢測結(jié)果

3.6 方法精密度

3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸的方法精密度結(jié)果如表6所示，此方法3次加標的相對標準偏差為3.28%，結(jié)果重現(xiàn)性良好。

表6 方法精密度實驗結(jié)果

3.7 溶液穩(wěn)定性

3.7.1 對照品溶液穩(wěn)定性

對照品溶液穩(wěn)定性實驗結(jié)果如表7所示，對照品溶液在室溫放置下各目標物峰面積無明顯變化，符合穩(wěn)定性要求。

表7 對照品溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果

3.7.2 供試品溶液穩(wěn)定性

加標后的原料藥供試品溶液穩(wěn)定性實驗結(jié)果如表8所示，供試品溶液在室溫放置下目標物峰面積無明顯變化，符合穩(wěn)定性要求。

表8 樣品加標溶液穩(wěn)定性實驗結(jié)果

3.8 樣品檢測結(jié)果

利用本文建立的方法，分別對企業(yè)提供的批號為1、2、3號的鹽酸蘭地洛爾原料藥物中3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸的含量進行檢測，結(jié)果顯示，3批樣品中3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸的含量均低于0.50 mg/kg。

4 結(jié)論

本研究利用高效液相色譜-三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜，建立了鹽酸蘭地洛爾原料藥物中痕量3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸的檢測方法。本方法的檢測靈敏度可達到0.50 mg/kg，且方法的精密度和回收率均能滿足檢測要求。該研究操作簡單、結(jié)果可靠，可實現(xiàn)對鹽酸蘭地洛爾原料藥物中痕量3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸的快速、低成本檢測。

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phenyl] propionic acid in the landiolol hydrochloride crude drug

WANG Shan-shan1,WANG Li-juan1, LI Zhuo-wa2, NING Fan-sheng1, WANG Xiao-li1, CHEN Yue1, CHEN Xiang-feng1*

(1. Shandong Analysis and Test Center, Jinan 250014, China; 2.Zaozhuang College,Zaozhuang 277000, China)

∶To detect and control the content of trace toxic impurity 3-[4-(3-nitrobenzene sulfonyl oxygen radicals) phenyl] propionic acid, which isessential material in the synthesis of landiolol hydrochloride drug, a HPLC with tandem mass spectrometry method was developed to determine the 3-[4-(3-nitrobenzene sulfonyl oxygen radicals) phenyl] propionic acid in the landiolol hydrochloride crude drug. The multiple reaction monitor mode was used to eliminate the matrix effect and increase the sensitivity of the method. The limit of detection of the target analyte was 0.50 mg/kg. The recoveries of spiked samples were between 91.9% and 97.8%. The relative standard diviation value of precision experiment was 3.28%(n=6). The established method was simple, reliable, fast and low cost,which is able to meet the demand of impurities determination in crude drugs.

∶landiolol hydrochloride; high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry; 3-[4-(3-nitrobenzene sulfonyl oxygen radicals)phenyl]propionic acid;trace detection

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.02.017

2017-01-18

山東省自然科學(xué)基金(ZR2012BQ009)

王珊珊(1983—)，女，博士，研究方向為分析化學(xué)。

*通信作者，陳相峰(1981—)，男，博士，副研究員，研究方向為質(zhì)譜分析。E-mail：xiangfchensdas@163.com

O656.31

A

1002-4026(2017)02-0113-08