HPLC法測定鮮天麻中多指標成分的含量

李云，王志偉，劉大會，周洪雷，王曉*

(1. 山東省中藥質(zhì)量控制技術重點實驗室， 山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250014；3. 云南省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所，云南 昆明 650231)

【中藥與天然活性產(chǎn)物】

HPLC法測定鮮天麻中多指標成分的含量

李云1, 2，王志偉1，劉大會3，周洪雷2，王曉1, 2*

(1. 山東省中藥質(zhì)量控制技術重點實驗室， 山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250014；3. 云南省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所，云南 昆明 650231)

建立了高效液相色譜測定鮮天麻中天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、腺苷、巴利森苷A、4, 4′-二羥基二芐基醚6種成分含量的方法。采用Agilent 1120高效液相系統(tǒng)，YMC-PEAK ODS-A column (250 mm × 4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇溶液(B)，梯度洗脫：0～5 min，5% B；5～65 min，5%～40% B；65～80 min，40%～100% B；分析時間80 mins；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量50 μL。其中天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、腺苷、巴利森苷A、4, 4′-二羥基二芐基醚6種成分在線性范圍內(nèi)均具有良好的線性關系(R≥0.999 2)；平均回收率在94.20%～99.68%，相對標準偏差小于1.96%。在不同品種的鮮天麻中，6種成分的量存在差異，紅天麻各成分含量稍高于烏天麻。同一品種天麻中，巴利森苷類成分含量較高，腺苷和4, 4′-二羥基二芐基醚含量均較低，且鮮天麻中提取的天麻素等6種成分在8 h內(nèi)穩(wěn)定。該方法分離效果與重復性好、快速、簡便，能夠為客觀、全面地研究天麻藥材提供參考。

天麻；天麻素；對羥基苯甲醇；巴利森苷A；含量測定

天麻(GastrodiaelataBlume)為蘭科天麻屬多年生草本植物，主產(chǎn)于云南、內(nèi)蒙古、四川、湖南、貴州及臺灣等地，是我國的貴重中藥材，藥用部位為天麻的干燥塊莖。我國著名天麻專家、中科院昆明植物所周鉉先生將我國天麻分為如下5個變型[1]：原變型-紅天麻、綠天麻、烏天麻、松天麻和黃天麻。天麻性甘、平,歸肝經(jīng),有息風止痙、平抑肝陽和祛風通絡的功效，用于小兒驚風、癲癇抽搐、破傷風、頭痛眩暈、手足不遂、肢體麻木以及風濕痹痛等[2]癥的治療。現(xiàn)代藥理及臨床研究表明，天麻對于失眠、高血壓、偏頭痛、糖尿病神經(jīng)病變及心腦血管疾病等有較好的治療效果[3-6]。天麻的化學成分主要包括酚類、有機酸類、多糖類及甾體類等[7]，近年來，對天麻化學成分的研究主要是針對天麻蒸制處理后的干天麻，而專門針對鮮天麻化學成分的研究較少。因此，本文對紅天麻和烏天麻鮮品中的6種成分進行含量測定，以期為客觀、全面地研究天麻藥材提供參考。

1 儀器與材料

Agilent 1120型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；MS205DU型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，精確到0.01 mg；SB-3200DT超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)； BUCHI旋轉蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)。

天麻素、腺苷、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、巴利森苷A、4,4′-二羥基二芐基醚均為本實驗室自制純品，上述對照品經(jīng)HPLC法檢測，質(zhì)量分數(shù)均大于 98.0%。

乙腈(色譜純，美國Fisher Scientific)；甲醇(色譜純，山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司)；甲酸(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；實驗用水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

本實驗所用天麻均來自于云南省邵通市彝良縣小草壩天麻種植基地，2016年3月份采收，收集兩個品種的鮮天麻塊莖，每個品種3份(編號為 S1～S6)，其中S1～S3為烏天麻，S4～S6為紅天麻，經(jīng)云南省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所劉大會副研究員鑒定為蘭科天麻屬植物天麻 (GastrodiaelataBl.)的新鮮塊莖。

2 方法與結果

2.1 含水量的測定

取烏天麻和紅天麻鮮品，洗凈，切薄片(1～2 mm)，采用烘干法[2]測定含水量，結果見表1。

2.2 色譜條件

色譜柱為YMC-PEAK ODS-A column(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為0.2%甲酸水溶液(A)-甲醇溶液(B)；梯度洗脫(0～5 min，5% B；5～65 min，5%～40% B；65～80 min，40%～100% B)；分析時間80 min；體積流量1 mL/min；進樣量50 μL；柱溫25 ℃。

在上述色譜條件下,天麻素等6種成分理論塔板數(shù)均不低于1萬，分離度與拖尾因子均符合含量測定要求。對照品和天麻樣品(S1)色譜圖見圖1。

表1 烏天麻與紅天麻含水量的測定

時間/min 1 天麻素； 2 腺苷；化合物3 對羥基苯甲醇； 4 對羥基苯甲醛；5 巴利森苷A ； 6 4,4′-二羥基二芐基醚。圖1 對照品及樣品的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and samples

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取天麻素等6種對照品適量，置同一1 mL容量瓶中，加10%乙腈適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為300、30、150、30、600、30 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備

取供試品均按干燥品約為2 g稱重，依含水量換算成鮮品質(zhì)量，烏天麻約為7 g，紅天麻約為10 g，精密稱定，加入一定量80%乙醇，用流體機械設備粉碎，轉移置具塞錐形瓶中，再加入80%乙醇至50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取(功率180 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定，用80%乙醇補足減失的質(zhì)量，抽濾，精密量取續(xù)濾液20 mL，濃縮至近干無醇味，殘渣加乙腈-水(1∶9，V/V)混合溶液溶解，轉移至10 mL量瓶中，用乙腈-水(1∶9，V∶V)混合溶液稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm有機濾膜，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系

將混合對照品溶液梯度稀釋，得到一系列不同濃度的混合對照品溶液，按2.2項下色譜條件進行分析，分別進樣50 μL，每個濃度平行進3針，測定峰面積平均值。以峰面積Y對質(zhì)量濃度ρ(μg/mL)繪制標準曲線，得天麻素等6種成分的回歸方程，結果見表2。從表2可以看出，各標準曲線的相關系數(shù)良好，方法靈敏度較高，可以滿足天麻提取物中各活性成分的含量測定。

表2 天麻素等6種成分的回歸方程

2.4.2 精密度實驗

取混合對照品溶液，按上述色譜條件進樣50 μL，連續(xù)進樣6次，記錄各自峰面積,計算天麻素等6種成分峰面積的相對標準偏差分別為1.58%、1.65%、1.02%、1.40%、1.53%、2.31%，表明本方法精密度良好。

2.4.3 重復性實驗

稱取編號為 S1 的鮮天麻約7 g，精密稱定，按2.3.2項下方法平行制備6份供試品溶液，測定并計算其中6種成分的平均含量和 相對標準偏差。結果表明，天麻素等6種成分的平均含量分別為0.802 1、0.120 3、1.201 3、0.040 9、4.710 5、0.140 3 mg/g，相對標準偏差分別為1.65%、1.42%、2.06%、1.70%、1.53%、2.37%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性實驗

取編號為S1的鮮天麻制備的供試品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、6、8 h進樣50 μL進行液相分析，記錄各自峰面積并計算相對標準偏差，結果，天麻素等6種成分峰面積的相對標準偏差分別為4.83%、2.48%、4.97%、2.23%、4.28%、3.39%，表明供試品溶液中天麻素等6種成分在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率實驗

稱取編號為S1的鮮天麻6份，每份7 g，精密稱定。分別加入適量對照品，按2.3.2項下方法制成高、中、低3個濃度的供試品溶液，測定并計算 6 份供試品溶液中天麻素等6 種成分的平均加樣回收率和相對標準偏差，詳見表3。

表3 6種成分加樣回收率(n=3)

續(xù)表3

化合物樣品中量/μg加入量/μg測得量/μg回收率/%平均值/%相對標準偏差/%巴利森苷A4656.737208251.498.5046509276.599.6898.970.63558010105.398.724,4'-二羥基二芐基醚144.8110241.694.82140273.195.8996.061.38170306.897.46

2.5 樣品含量測定

取烏、紅兩個品種的天麻鮮品，每個品種3份，按2.3.2項下方法分別制備供試品溶液，各進樣50 μL，以各成分峰面積按外標法對其中的天麻素等6種成分進行測定，并計算每個品種3份的平均含量，結果見表4。

表4 6份鮮天麻中6種成分的平均含量

3 討論

3.1 鮮天麻的保鮮

將烏、紅兩個品種的天麻鮮品去除表面土壤，不清洗，裝入透明塑料袋內(nèi)，將空氣排出，并淋入少量水，封口，放入冰箱4～5 ℃保存?zhèn)溆肹8]。

3.2 檢測波長的選擇

對天麻素、腺苷、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、巴利森苷A、4, 4′-二羥基二芐基醚6 種成分均進行紫外200 nm～400 nm波長掃描，結果顯示最大吸收波長分別為220 、260 、225 、270 、220 、225 nm，所以本實驗選取兩個檢測波長對鮮天麻中6種成分進行含量測定，天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、4, 4′-二羥基二芐基醚檢測波長為220 nm，腺苷、對羥基苯甲醛檢測波長為270 nm。

3.3 流動相的選擇

本實驗鮮天麻中6種成分極性差異較大，為使各成分基線分離，采用梯度洗脫，流動相比較了乙腈-0.05%磷酸系統(tǒng)[9]和甲醇-0.1%甲酸水系統(tǒng)，結果乙腈系統(tǒng)初始梯度調(diào)到2%，天麻素與其前面雜質(zhì)峰仍不能基線分離，難以再調(diào)整；選擇甲醇系統(tǒng)進行梯度洗脫程序優(yōu)化后，各峰可以達到基線分離，故而確定本實驗的洗脫系統(tǒng)為甲醇-0.1%甲酸水梯度洗脫，且分離效果良好，重現(xiàn)性好。

3.4 小結

本實驗測定了新鮮烏天麻和紅天麻中6種成分的含量，就不同品種的新鮮天麻而言，紅天麻中天麻素、對羥基苯甲醇、腺苷、對羥基苯甲醛、巴利森苷A、4, 4′-二羥基二芐基醚6種成分含量稍高于烏天麻(本實驗烏天麻為二級烏天麻)；同一品種天麻中，巴利森苷A成分含量較高，腺苷和4, 4′-二羥基二芐基醚含量均較低。近年來，對天麻化學成分的研究主要是針對炮制后的天麻，且大量研究報道了不同炮制方法對天麻化學成分含量的影響[10]，而專門針對鮮天麻的化學成分研究較少，本實驗建立了 HPLC 法同時測定鮮天麻藥材中天麻素、對羥基苯甲醇、腺苷、對羥基苯甲醛、巴利森苷A、4, 4′-二羥基二芐基醚6種成分的含量，該方法簡便、可行、重現(xiàn)性好，能夠為客觀、全面地評價天麻藥材的質(zhì)量提供參考。另外，在實驗中還存在一些結構尚未確定的化合物，總樣圖中亦可見其有較高含量，因此，需進一步探索這些化合物的結構及其對天麻藥理藥效作用的貢獻。

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會. 中國植物志第十八卷[M]. 北京:科學出版社, 1999: 31.

[2]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典2015年版一部 [M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2015: 58-59.

[3]張勤, 楊云梅, 余國友. 天麻素注射液對老年難治性高血壓患者血壓和血管活性物質(zhì)影響的隨機對照研究 [J]. 中西醫(yī)結合學報, 2008, 6(7): 695-699.

[4]郭駒, 馬曉俞, 于朝霞, 等. 養(yǎng)血清腦顆粒、天麻素聯(lián)合尼莫地平治療偏頭痛60例 [J]. 中國藥業(yè), 2014, 23(6): 70-71.

[5]苗凱, 王美, 謝祎. 天麻素治療冠心病心絞痛臨床效果的觀察 [J]. 天津藥學, 2009, 21(6): 26-27.

[6] SUN W, MIAO B, WANG X C, et al. Gastrodin inhibits allodynia and hyperalgesia in painful diabetic neuropathy rats by decreasing excitability of nociceptive primary sensory neurons [J]. PLoS One，2012，7(6)：e39647.

[7] 朱會朋. 三種邵通產(chǎn)藥用植物的化學成分研究 [D]. 昆明：云南中醫(yī)學院，2013.

[8] 楊順強，武婷，吳珊珊.不同包裝方式對鮮天麻保鮮效果的比較 [J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學, 2015, 54(13): 3221-3224.

[9] 單鳴秋, 張麗, 于生, 等. HPLC-MS法同時測定天麻飲片中8種活性成分 [J]. 中草藥, 2015, 46(14): 2087-2091.

[10] 畢榮璐，倪兆武，李德勛，等.不同炮制方法對天麻素及天麻苷元含量的影響[J].云南中醫(yī)學院學報，2015,38(1)：34-37.

HPLC determination of multi index components in rawGastrodiaelataBlume

LI Yun1,2, WANG Zhi-wei2, LIU Da-hui3, ZHOU Hong-lei1, WANG Xiao1,2*

(1.Shandong Provincial Key Laboratory of TCM Quality Control Technology, Shandong Analysis and Test Center, Jinan 250014, China; 2.College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, China; 3.Medicinal Plant Research Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming 650231,China)

∶A HPLC method for determination of the contents of six components in rawGastrodiaelata, such as gastrodin, p-hydroxybenzyl alcohol, p-hydroxybenz aldehyde, adenosine, parishin A and 4, 4′-dihydroxydibenzyl ether, was presented. The analysis was performed on an Agilent 1120 HPLC system with YMC-PEAK ODS-A column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm). The six components were separated in 80 mins with gradient elution using mobile phase composed of 0.1% CH3COOH—H2O (A) and CH3OH (B): 0～5 min, 5% B; 5～65 min, 5%～40% B; 65～80 min, 40%～100% B. The flow rate of carrier gas was set at 1 mL/min, the column temperature was set at 25 ℃, and the injected sample volume was 50 μL. Six ingredients showed a good linear relationship (R≥0.999 2) within the linear range, and the average recovery rates were in the range of 94.20%～99.68%，and the relative standard deviation was less than 1.96. There were differences in the amounts of six ingredients among different varieties of rawGastrodiaelata, for instance, the contents of the six ingredients inGastrodiaelataf.elatawere slightly higher than those inGastrodiaelataf.glauca. In the same variety, the content of parishin glycosides was higher while the contents of adenosine and 4, 4′-dihydroxydibenzyl ether were lower. The six ingredients such as gastrodin extracted from fresh gastrodin were stable within 8 hours. This method has the advantage of good separating effect and repeatability, rapid and simple, which could provide references for objective and comprehensive researches on the Rhizoma Gastrodiae.

∶Gastrodiaelata; gastrodin; p-hydroxybenzyl alcohol; parishin A; determination of content

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.02.002

2016-09-09

山東省科技發(fā)展計劃(2014GZX219003)

李 云(1990—)，女，碩士在讀，研究方向為中藥及復方活性成分質(zhì)量控制研究。E-mail: liyun137934@163.com

*通信作者， 王曉(1972—),男，研究員，研究方向為天然產(chǎn)物分離純化與功能食品。E-mail:wangx@sdas.org

R284.1

A

1002-4026(2017)02-0007-06