栝樓種子萌發(fā)期總黃酮含量變化研究

霍立群，張文霞，辛杰，張永清，李佳，劉紅燕

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

【中藥與天然活性產(chǎn)物】

栝樓種子萌發(fā)期總黃酮含量變化研究

霍立群，張文霞，辛杰，張永清，李佳*，劉紅燕

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

采用超聲輔助提取的方法，研究栝樓種子吸脹前期、吸脹期、萌動期、胚根伸長期、萌芽期及幼苗期6個時期的總黃酮含量及變化規(guī)律。各萌發(fā)階段的栝樓種子經(jīng)石油醚脫脂后，以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液為溶劑，采用超聲輔助提取法提取總黃酮，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用比色法測定各萌發(fā)階段栝樓種子總黃酮含量。結(jié)果表明，栝樓種子中總黃酮含量較低，約為1 mg/g，整個萌發(fā)階段總黃酮含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，至幼苗期總黃酮含量已達(dá)2.7 mg/g。本研究為進(jìn)一步認(rèn)識及開發(fā)利用栝樓種子提供了參考，為人工調(diào)控栝樓種子中總黃酮含量提供了理論依據(jù)。

栝樓種子；萌發(fā)過程；總黃酮

瓜蔞子為葫蘆科植物栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim.)或雙邊栝樓(TrichosanthesrosthorniiHarms)的干燥成熟種子，具有潤肺化痰、滑腸通便的功效，主要用于治療燥咳痰黏、腸燥便秘[1]。瓜蔞子中富含油脂、甾醇、三萜及其苷、蛋白質(zhì)、多種氨基酸、維生素，以及鈣、鐵、鋅、硒等16種無機(jī)元素[2]。目前關(guān)于瓜蔞子油脂、皂苷、氨基酸等成分研究的較多，而對黃酮的研究報(bào)道較少。

黃酮類化合物廣泛存在于自然界植物體內(nèi)，屬于植物次生代謝產(chǎn)物。對植物而言，黃酮類化合物具有多種生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)植物生長、保護(hù)植物免受紫外線的損傷以及作為植物抗毒素(phytoalexin)和活性氧清除劑等，對入侵的病原物有直接的毒殺作用；其作為植物花和果實(shí)的色素，既是引誘劑，又是驅(qū)避劑，是植物體內(nèi)重要的防御性次生代謝產(chǎn)物[3-4]。對于人類而言，黃酮類化合物大多與糖類結(jié)合為苷存在，可清除自由基，具抗氧化、抑菌、抗病毒、抗癌和抗腫瘤作用，對防治心血管疾病、肝病均有一定的療效。而且，黃酮類化合物對畜禽生產(chǎn)也有良好的促進(jìn)功能[5]。本文對栝樓干種子及種子萌發(fā)期間黃酮含量的變化情況進(jìn)行研究，以期為進(jìn)一步了解栝樓種子生長及人工調(diào)控栝樓黃酮含量提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LHR-250-GS型人工氣候箱(廣東省醫(yī)療器械廠)；SW-CJ-1G型單人凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；HH-1型電熱恒溫水浴鍋(常州博遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)分析儀器廠)；LE204E/02型萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；GFL-230型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市萊博特瑞儀器有限公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水多用真空泵(鞏義市英峪高科儀器廠)；UV 5100B型紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)。

1.2 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%)；濃硫酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%)；體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液(AR)；石油醚(沸程60～90 ℃)；質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硝酸鋁溶液(AR)；質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞硝酸鈉溶液(AR)；質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%氫氧化鈉溶液(AR)；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.3 材料

栝樓果實(shí)于2015年11月采收自山東中醫(yī)藥大學(xué)藥圃，采摘后懸掛在室內(nèi)通風(fēng)處，至果實(shí)晾干，取出種子，放在陰涼干燥處備用。經(jīng)張永清教授鑒定，為葫蘆科栝樓屬植物栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim.)的干燥成熟種子。

2 方法與結(jié)果

2.1 發(fā)芽實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 種子培養(yǎng)

參考許桂芳等[6-7]的方法對栝樓種子進(jìn)行培養(yǎng)。選取籽粒飽滿、大小相近的栝樓種子1 000粒，濃硫酸浸泡10 min，蒸餾水洗去種子表面因酸蝕而形成的附著物后，在40 ℃溫水浸泡6 h，再轉(zhuǎn)冷水中浸泡24 h，取出用濾紙吸干表層水分，均勻放入鋪有3層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿30粒，放入30 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)。及時補(bǔ)充培養(yǎng)皿中水分以保持培養(yǎng)條件濕潤；不正常種子、死種子及嚴(yán)重霉?fàn)€的種子需隨時揀出。

2.1.2 記錄

從種子培養(yǎng)的當(dāng)天開始觀察，以種子吸水完全為吸脹期，以胚根突破種皮1～3 mm視為萌動期，胚根伸長至胚芽伸出前為伸長期，長出第一片真葉前為萌芽期，長至兩葉一心時為幼苗期，記錄種子生長至每個時期的日期。將第一粒種子胚根突破種皮之日作為萌發(fā)的開始，以后每天定時記錄萌發(fā)種子數(shù)，當(dāng)連續(xù)幾天不再有種子萌發(fā)時作為萌發(fā)結(jié)束期。不正常種子、死種子及嚴(yán)重霉?fàn)€的種子及時揀出并記錄。計(jì)算發(fā)芽勢、發(fā)芽率。

具體指標(biāo)計(jì)算方法如下:

發(fā)芽勢 = ( 萌發(fā)高峰期種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù))× 100% ，

(1)

發(fā)芽率 = ( 種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù))× 100% 。

(2)

2.1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

種子培養(yǎng)第0天為吸脹前期，前3天無萌發(fā)現(xiàn)象，為吸水階段；第3天為吸脹期；自第4天開始出現(xiàn)萌發(fā)的種子，進(jìn)入萌動期；第9～11天為胚根伸長期；第12～14天為萌芽期；第16～18天為幼苗期。所有培養(yǎng)的種子在第7天達(dá)萌發(fā)高峰期，整個發(fā)芽現(xiàn)象持續(xù)23 天，23 天以后沒有新的種子萌發(fā)。最終計(jì)算得發(fā)芽勢為85%，發(fā)芽率為93%。

2.2 總黃酮測定

2.2.1 樣品前處理

分別取6個萌發(fā)階段的栝樓種子于60 ℃烘箱中烘干，研缽研碎后濾紙包好，用石油醚回流2.0 h，除去色素和脂溶性成分，60 ℃烘干備用。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品9.8 mg于50 mL容量瓶中，用70%乙醇溶液溶解并定容至刻度，得0.196 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；加10% 硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，再靜置6 min；加4% 氫氧化鈉4 mL，再加入70%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min后，在510 nm處測其吸光度[8]。以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y= 11.184x- 0.012 67，R2= 0.999 53。x為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(mg/mL)，y為吸光度值，結(jié)果如圖1所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve

2.2.4 供試品溶液制備

分別稱取各時期樣品1.000 g置于100 mL具塞錐形瓶中，按液料比1∶40加入40 mL 70%乙醇溶液，70 ℃超聲提取1 h，提取1次，提取液冷卻并過濾于50 mL的容量瓶內(nèi)，用70%乙醇溶液定容至刻度，即得供試品溶液，備用。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取吸脹前的供試品溶液5 mL，置于10 mL容量瓶中，按照2.2.3 項(xiàng)下方法操作，于510 nm處測定吸光度，連續(xù)測定6次，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.67%，精密度良好，結(jié)果見表1。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取吸脹前樣品1 g，按照2.2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2.3項(xiàng)下方法操作，于510 nm處測定吸光度，平行操作6次，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.57%。表明樣品測定符合技術(shù)要求，重現(xiàn)性良好，結(jié)果見表2。

表2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取吸脹前的供試品溶液5 mL，按照2.2.3項(xiàng)下方法于510 nm處測定在反應(yīng)5 、10、15、20、30 min時的吸光度，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.65%。表明 30 min 內(nèi)樣品穩(wěn)定性良好，結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，精密稱取已測知總黃酮含量的吸脹前的樣品1 g，精密加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品約1 mg，按照2.2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2.3項(xiàng)下方法于510 nm處測定吸光度，平行操作6份，計(jì)算平均回收率為99.07%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.89%，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品測定

分別精密吸取各時期供試品溶液5 mL，按照2.2.3項(xiàng)下方法，于510 nm處測定吸光度值，重復(fù)6次，代入回歸方程計(jì)算出各時期供試品溶液稀釋后的總黃酮濃度，并計(jì)算各萌發(fā)階段種子中總黃酮含量，表5為各時期總黃酮濃度及含量結(jié)果，圖2為總黃酮含量變化趨勢。

表5 栝樓種子萌發(fā)期間總黃酮含量測定結(jié)果(n=6)

圖2 栝樓種子萌發(fā)過程中總黃酮含量變化趨勢Fig.2 Trend of the change of total flavonoids content during germination process of Trichosanthes kirilowii Maxim. seeds

由測定結(jié)果可以看出，栝樓種子中總黃酮含量較低，在1 mg/g上下波動。從圖2變化趨勢可看出，干種子中總黃酮含量大于吸脹期的種子，種子吸水進(jìn)入萌動階段后，總黃酮含量隨種子繼續(xù)生長而逐漸增加，進(jìn)入幼苗期時總黃酮含量增長迅速，總體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。

3 分析與討論

研究表明[6-7,9-10]，栝樓種子存在休眠現(xiàn)象，萌發(fā)困難，出苗率低且不齊。針對栝樓破休眠及促萌的研究也有很多，本實(shí)驗(yàn)采用文獻(xiàn)[6-7]的處理方法，雖然發(fā)芽勢為85%，發(fā)芽率達(dá)到93%，但同批處理的種子培養(yǎng)20 d以后仍有剛萌發(fā)者，即發(fā)芽不齊現(xiàn)象依然存在，尚待解決。

許多文獻(xiàn)表明[11-13]，成熟干種子自吸水至胚根突破種皮之前的階段，種子內(nèi)部開始進(jìn)行復(fù)雜的生理變化：干燥種子的鮮重急劇增加，一些酶也因?yàn)榈玫阶杂伤謴?fù)代謝，細(xì)胞代謝空前旺盛，此時氧氣大量進(jìn)入，呼吸速率顯著加快，此階段種子內(nèi)多數(shù)物質(zhì)開始被分解，含量降低；然而胚根突破種皮繼續(xù)生長至幼苗期的階段，種子會重吸收外界中的小分子代謝物，供細(xì)胞分裂和營養(yǎng)物質(zhì)合成，從而使一部分成分積累增加。本實(shí)驗(yàn)中栝樓種子萌發(fā)階段黃酮含量變化趨勢亦符合此變化規(guī)律：干種子(1.114 7 mg/g)到種子萌動前期(0.906 3 mg/g)總黃酮含量有所降低;胚根突破種皮后至萌芽期，總黃酮含量緩慢上升;至幼苗期，總黃酮含量迅速積累達(dá)2.715 3 mg/g。

總黃酮的合成還受多方面影響，基因表達(dá)[3]、酶活性變化(PAL酶)[14]、內(nèi)源激素水平變化[15]及外界環(huán)境(光照、溫度等)[14]等均有可能影響總黃酮含量。植物內(nèi)源激素中的生長素、乙烯和脫落酸有助于植物中黃酮類成分的合成與積累，而赤霉素則不利于黃酮類成分的合成，茉莉酸、茉莉酸甲酯和水楊酸也被證明可以誘導(dǎo)植物黃酮類成分的合成和積累[15]。礦質(zhì)營養(yǎng)可以通過調(diào)控植物的碳、氮代謝過程以及植物體內(nèi)內(nèi)源激素代謝和關(guān)鍵酶活性等方面，從而影響黃酮類成分的合成代謝過程[14-15]。

4 結(jié)論

若想調(diào)控種子及植株生長，必須首先了解植株生長過程中內(nèi)部成分的變化。本實(shí)驗(yàn)對種子萌發(fā)過程中總黃酮積累規(guī)律進(jìn)行研究，以期為調(diào)控植株生長提供參考。研究表明，栝樓種子萌發(fā)過程中總黃酮含量呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢，基因表達(dá)、酶活性變化、內(nèi)源激素水平等也是影響種子萌發(fā)的因素，可從這幾方面進(jìn)行全面、系統(tǒng)地研究，找出栝樓種子萌發(fā)過程中影響總黃酮含量變化的關(guān)鍵點(diǎn)和關(guān)鍵物質(zhì)，從而采取措施對黃酮類物質(zhì)的合成及積累進(jìn)行人工調(diào)控，如施以合理的礦質(zhì)營養(yǎng)供應(yīng)，促使其關(guān)鍵酶表達(dá)、活性和內(nèi)源激素的變化朝著生產(chǎn)需要的方向發(fā)展等，進(jìn)而更好地實(shí)現(xiàn)對栝樓的認(rèn)識、開發(fā)和利用。

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Research on the change of total flavonoids content ofTrichosantheskirilowiiseeds during germination period

HUO Li-qun,ZHANG Wen-xia,XIN Jie，ZHANG Yong-qing,LI Jia*,LIU Hong-yan

(Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

∶With the method of ultrasonic-assisted extraction, the content and its change rule of total flavonoids inTrichosantheskirilowiiseeds during six stages of prophase imbibition, imbibition, germination, radicle elongation, bud breaking and seedling were studied. After degreased by petroleum ether, total flavonoids ofTrichosantheskirilowiiseeds at different germination stage were extracted with 70% ethanol as solvent by ultrasonic-assisted extraction, and determined using rutin as the standard by colorimetry method. The results showed that total flavonoids content in the seeds ofTrichosantheskirilowiiwas low, about 1 mg/g, and it showed tendency to descend firstly and then ascend during the whole germination process, rising to 2.7 mg/g at seeding stage. This study provides references for further understanding and utilization ofTrichosantheskirilowiiseeds, and provides theoretical basis for artificial regulation of total flavonoids content inTrichosantheskirilowiiseeds.

∶Trichosantheskirilowiiseeds；germination process；total flavonoids

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.02.001

2016-08-08

國家中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)(201407002)；山東省高?？蒲邪l(fā)展計(jì)劃(J14LM06)

霍立群(1991—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量與資源。

*通信作者，李佳。E-mail：ljytl7172@163.com

R284.1

A

1002-4026(2017)02-0001-06