大黃牡丹湯含藥血清對小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞吞噬功能及Toll樣受體mRNA表達(dá)的影響

苗大興 肖天保 梁宛伶

(貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肛腸病醫(yī)院，貴州 貴陽 550002)

大黃牡丹湯含藥血清對小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞吞噬功能及Toll樣受體mRNA表達(dá)的影響

苗大興 肖天保 梁宛伶

(貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肛腸病醫(yī)院，貴州 貴陽 550002)

目的 觀察大黃牡丹湯含藥血清對小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞(Mφ)吞噬活性和Toll樣受體(TLRs)表達(dá)的影響。方法 常規(guī)制備大黃牡丹湯水煎劑，分大、中、小劑量灌胃干預(yù)清潔級SD大鼠，收集含藥血清。采集小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)M-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)Mφ，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞純度。在96孔板中，用含藥血清干預(yù)骨髓源Mφ一定時間后，中性紅法檢測Mφ吞噬活性；RT-PCR法檢測TLR-1～5 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測顯示，誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓源Mφ純度超過90%。與正常對照組比較，各劑量給藥組含藥血清干預(yù)Mφ的吞噬功能明顯增強(P<0.05或P<0.01)；大劑量給藥組含藥血清干預(yù)Mφ的TLR-3、各劑量給藥組含藥血清干預(yù)Mφ的TLR-4和TLR-5的mRNA表達(dá)量明顯增強(P<0.05或P<0.01)，大、小劑量給藥組含藥血清干預(yù)Mφ的TLR-1、各劑量給藥組含藥血清干預(yù)Mφ的TLR-2、小劑量給藥組含藥血清干預(yù)Mφ的TLR-3的mRNA表達(dá)量明顯減弱(P<0.01)。結(jié)論 一定濃度大黃牡丹湯含藥血清對Mφ吞噬功能和TLRs的表達(dá)具有明顯調(diào)節(jié)效應(yīng)，這可能是該方臨床抗炎作用的部分機制。

大黃牡丹湯；巨噬細(xì)胞；吞噬功能；Toll樣受體

大黃牡丹湯組成為大黃、丹皮、冬瓜仁、桃仁、芒硝等，具有瀉熱破瘀、散結(jié)消腫功效，用于濕熱蘊結(jié)、氣血凝滯所致腸癰等癥。該方在臨床上廣泛用于治療重癥肝炎、膽囊炎、胰腺炎、闌尾炎、結(jié)腸炎、盆腔炎等多種炎性疾病〔1〕。長期臨床實踐中，我院在國家級名老中醫(yī)符中柱教授的主導(dǎo)下，采用大黃牡丹湯加減治療肛癰，療效十分顯著〔2〕。活化的巨噬細(xì)胞(Mφ)在炎癥的啟動、發(fā)展及恢復(fù)階段均發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)控作用，吞噬功能增強是Mφ活化的重要體現(xiàn)。Toll樣受體(TLRs)是Mφ表面的一類重要的模式識別受體，與Mφ活化、吞噬、分泌細(xì)胞因子和炎癥調(diào)控等功能密切相關(guān)。為研究大黃牡丹湯臨床治療炎性疾病的部分機制，本文觀察其含藥血清對Mφ吞噬功能和TLRs表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 大黃牡丹湯組方藥材購自北京同仁堂(貴陽店)，按《金匱要略》原方比例(大黃12 g、丹皮3 g、桃仁9 g、冬瓜仁30 g、芒硝9 g)配制，常規(guī)制備水煎劑，調(diào)整儲存濃度為相當(dāng)于生藥3 g/ml，置4℃冰箱在1 w內(nèi)使用。

1.2 實驗動物 制備含藥血清選用清潔級SD大鼠，雄性，體重(220±20)g；制備單核/巨噬細(xì)胞選用清潔級C57BL/6小鼠，雄性，體重(20±2)g。實驗動物均購自重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司，動物合格證 SCXK(軍)2012-0011。

1.3 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(美國，Gibco)；Trizol試劑(美國，Invitrogen)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶(大連，寶生物)；PCR引物(北京鼎國生物科技有限公司合成)；中性紅(上海試劑三廠)；CD11b、F4/80流式細(xì)胞儀檢測試劑(美國，eBioscience)；M-CSF(美國，PeproTech)；胎牛血清(美國，Gibco)。

1.4 主要儀器 VX-55高壓滅菌鍋(德國，Systec)；NU-440-400E生物安全柜(美國，Nuair)；DMI3000B顯微鏡(德國，Leica)；MK3酶標(biāo)儀、CO2培養(yǎng)箱(美國，Thermo)；3-18K低溫離心機(德國，Sigma)；Biometra TProfessional Thermocycler PCR儀(德國，Biometra)；Biorad GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)(美國，Bio-Rad)；BD FACSAria型流式細(xì)胞儀(美國BD)。

1.5 大黃牡丹湯含藥血清的制備 參照文獻(xiàn)方法并略加調(diào)整〔3〕。實驗大鼠隨機分為正常對照組、大、中、小劑量給藥組，每組10只。大黃牡丹湯水煎劑以成人(體重按60 kg計算)用藥劑量的等效劑量為小劑量灌胃，大、中、小劑量分別為30、15、7.5 g/kg，灌胃體積為1 ml/100 g；正常對照組代以生理鹽水，1次/d，連續(xù)3 d。第3天給藥結(jié)束前12～16 h內(nèi)禁食不禁水，末次給藥后1～2 h股靜脈采血，同組血液混合，常規(guī)收集血清，在56℃水浴鍋中經(jīng)30 min滅活血清補體，0.22 μm濾膜除菌，置-80℃?zhèn)溆?。根?jù)前期結(jié)果，大黃牡丹湯含藥血清終濃度在20%以內(nèi)對Mφ無明顯毒性〔4〕。故本實驗中使用含藥血清終濃度為15%。

1.6 小鼠骨髓源Mφ的誘導(dǎo)培養(yǎng) 無菌操作下頸椎脫臼處死小鼠，小心剝離雙側(cè)脛骨和股骨，去除肌肉和關(guān)節(jié)。以1～2 ml 4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)用1 ml注射器灌洗骨髓，灌洗液收集至無菌離心管中，1 200 r/min離心5 min，棄上清。用與灌洗液等量的DMEM培養(yǎng)基重懸骨髓細(xì)胞，5 ml/瓶分裝，37℃ 5%CO2培養(yǎng)。3 d后換液1次并繼續(xù)培養(yǎng)，7 d時光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，消化收集合適細(xì)胞并分裝為5×105個/管，采用APC標(biāo)記的F4/80小鼠抗體(1∶100)、FITC標(biāo)記的CD11b小鼠抗體(1∶100)在4℃下避光孵育20 min后，流式細(xì)胞儀檢測Mφ比例，純度超過85%可用于檢測后續(xù)指標(biāo)。

1.7 中性紅法檢測含藥血清對Mφ吞噬功能的影響 在96孔板中，加入濃度為5×106個/ml的細(xì)胞懸液100 μl，37℃、5% CO2溫育貼壁2 h，PBS洗3次，棄上清后每孔加入終濃度為15%的含藥血清200 μl，正常對照組加入同濃度正常血清，所有加樣設(shè)8個復(fù)孔。置37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。取出棄培養(yǎng)液，每孔加入用DMEM培養(yǎng)液配置的終濃度為0.002 g/ml的中性紅溶液，繼續(xù)孵育3 h，棄中性紅溶液，PBS洗3次，每孔加入細(xì)胞溶解液(等體積乙酸和無水乙醇混合液)200 μl，室溫下放置24 h裂解細(xì)胞，492 nm下測定吸光度。

1.8 RT-PCR法檢測含藥血清對Mφ的TLR-1～5 mRNA表達(dá)的影響 參考文獻(xiàn)方法〔3〕。在6孔板中，分別將濃度為1×107個/ml的骨髓源Mφ 1 ml與各組終濃度為15%的實驗血清共同孵育24 h后，常規(guī)Trizol法提取總RNA，以O(shè)ligo-dT為引物逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。TLRs引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：94℃、45 s，53℃、45 s，72℃、1 min，35個循環(huán)；反應(yīng)體系：ddH2O 17.5 μl，10×PCR緩沖液2.5 μl，10×dNTP Mix 2.5 μl，引物10.5 μl，引物20.5 μl，Taq plusDNA 0.5 μl，cDNA 1 μl。結(jié)果用Quantity One軟件分析，灰度值檢測重復(fù)8次。

表1 TLRs引物序列

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 M-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓源Mφ純度 采用流式細(xì)胞儀鑒定Mφ表面CD11b、F4/80分子標(biāo)記。結(jié)果顯示，M-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓源Mφ純度達(dá)到94.7%。見圖1。

2.2 大黃牡丹湯含藥血清對Mφ吞噬功能的影響 與正常對照組比較〔(3.961±0.113)〕，大黃牡丹湯大、中、小劑量〔(4.168±0.105)、(4.507±0.15)、(4.226±0.110〕、給藥組含藥血清干預(yù)的Mφ吞噬功能均有明顯增強(P<0.05或P<0.01)。

a：對照；b：誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果圖1 M-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓源Mφ純度

2.3 大黃牡丹湯含藥血清對小鼠骨髓源Mφ的TLR-1～5 mRNA表達(dá)的影響 核酸電泳分析并檢測灰度值見圖2、表2。與正常對照組比較，大劑量給藥組含藥血清干預(yù)的TLR-3、各劑量給藥組含藥血清干預(yù)的Mφ的TLR-4和TLR-5的mRNA表達(dá)量明顯增強(P<0.05或P<0.01)，大、小劑量給藥組含藥血清干預(yù)的Mφ的TLR-1、各劑量給藥組含藥血清干預(yù)的Mφ的TLR-2、小劑量給藥組含藥血清干預(yù)的Mφ的TLR-3的mRNA表達(dá)量明顯減弱(P<0.01)。

1～4：正常對照組、大劑量給藥組、中劑量給藥組、小劑量給藥組圖2 大黃牡丹湯含藥血清對小鼠骨髓源Mφ的 TLR-1～5 mRNA表達(dá)的影響表2 Mφ的TLRs mRNA表達(dá)量的灰度值分析

組別TLR-1TLR-2TLR-3TLR-4TLR-5正常對照組16.74±1.6014.33±1.497.21±1.1211.29±1.333.79±0.91大劑量給藥組8.92±1.162)1.88±0.702)9.17±1.011)14.84±1.112)12.60±1.342)中劑量給藥組17.13±1.621.60±0.182)7.41±1.6514.90±1.042)14.13±2.012)小劑量給藥組12.02±1.162)5.69±1.172)3.27±0.662)13.44±1.091)13.75±1.852)

與正常對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

3 討 論

血清藥理學(xué)方法是田代真一〔5〕在二十世紀(jì)八十年代末提出的一種藥理研究技術(shù)。因其具有“半體內(nèi)”的特點，所以能更貼近真實地反應(yīng)中藥在體內(nèi)的作用及機制，受到中藥尤其是中藥復(fù)方研究者的關(guān)注。Mφ是機體免疫系統(tǒng)的一種重要的細(xì)胞成員，具有識別、吞噬、抗原提呈、炎癥調(diào)控等重要作用。Mφ經(jīng)各種因素刺激活化而發(fā)揮功能，吞噬功能的增強是其活化的重要表現(xiàn)之一〔6〕。TLRs是近年來在Mφ表面發(fā)現(xiàn)的一類重要的模式識別受體，其中TLR1-5對Mφ識別、活化和發(fā)揮炎癥調(diào)控效應(yīng)至關(guān)重要〔7〕。金匱大黃牡丹湯是臨床上治療炎癥性疾病的重要方劑，在我院治療肛癰的實踐中也表明其療效十分顯著〔2〕。在本實驗中，為了盡可能接近Mφ在體內(nèi)的真實情況，我們采用小鼠骨髓源Mφ作為實驗材料，并用血清藥理學(xué)技術(shù)作為實驗方法。實驗結(jié)果顯示：M-CSF誘導(dǎo)的小鼠骨髓源Mφ純度可達(dá)到90%以上，能夠滿足實驗要求；在一定濃度的大黃牡丹湯含藥血清干預(yù)下，小鼠骨髓源Mφ的吞噬功能明顯增強，提示該方具有調(diào)節(jié)Mφ活性的作用；一定濃度的大黃牡丹湯含藥血清對Mφ表面TLRs中的TLR-1～5 mRNA的表達(dá)具有促進(jìn)或抑制作用，這可能與該方臨床炎癥調(diào)控效應(yīng)的作用機制有關(guān)，其具體調(diào)控途徑有待進(jìn)一步研究。

1 張保國，劉慶芳.大黃牡丹湯現(xiàn)代藥效學(xué)研究與臨床應(yīng)用〔J〕.中國藥學(xué)雜志，2009；44(21)：1601-4.

2 李 可.符中柱教授運用《金匱要略》理論治療肛癰的臨床體會〔J〕.中醫(yī)臨床研究，2011；3(7)：68.

3 張智偉，蔡 琨，吳瑪莉，等.紫花地丁含藥血清對巨噬細(xì)胞吞噬功能及TOLL樣受體表達(dá)的影響〔J〕.中國免疫學(xué)雜志，2014；30(6)：759-62.

4 苗大興，肖天保，梁宛伶.大黃牡丹湯含藥血清對巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子的影響〔J〕.時珍國醫(yī)國藥，2014；25(4)：843-5.

5 田代真一.和漢藥の實驗的研究におる諸問題-invitro實驗の問題〔J〕.和漢醫(yī)藥學(xué)會雜志，1991；(3)：218-21.

6 Fujiwara N，Kobayashi K.Macrophages in inflammation〔J〕.Curr Drug Targets Inflamm Allerg，2005；4(3)：281-6.

7 Akira S，Takeda K，Kaisho T.Toll-like receptors：critical proteins linking innate and acquired immunity〔J〕.Nat Immunol，2001；2(8)：675-80.

〔2015-12-05修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

貴州省科技廳聯(lián)合基金項目(黔科合中藥字〔2012〕LkZ7047)

苗大興(1970-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事肛腸病中西醫(yī)結(jié)合治療的臨床與基礎(chǔ)研究。

R285

A

1005-9202(2017)08-1891-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.029