鐮形棘豆提取物對(duì)糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

武 燕 鄧婉蓉 武三卯

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 定西 743000)

鐮形棘豆提取物對(duì)糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

武 燕 鄧婉蓉 武三卯

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 定西 743000)

目的 觀察鐮形棘豆提取物對(duì)糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用。方法 采用鏈脲佐菌建立糖尿病模型，通過結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支法建立心肌缺血/再灌注損傷模型，再給予鐮形棘豆提取物進(jìn)行保護(hù)后，測定血清及心肌的相關(guān)生化指標(biāo)，并采用RT-PCR 法測定組織Caspase-3 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果 與模型組比較，鐮形棘豆保護(hù)組的血清及心肌細(xì)胞相關(guān)生化指標(biāo)具有顯著差異(P<0.05)，且Caspase-3表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 鐮形棘豆對(duì)糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制與鐮形棘豆提取物通過抑制Caspase-3 mRNA的表達(dá)，清除過量的氧自由基，同時(shí)抑制脂質(zhì)過氧化有關(guān)。

鐮形棘豆提取物；心肌缺血/再灌注；黃酮；Caspase-3

研究表明，鐮形棘豆具有清熱解毒，生肌止痛、抗紫外線、抗氧化及抗腫瘤等作用〔1～4〕。糖尿病的發(fā)病率逐年上升，已成為心血管疾病的主要的合并疾病之一。有研究表明心肌缺血/再灌注損傷(I/R)后，激發(fā)細(xì)胞氧化應(yīng)激，致使有害物質(zhì)堆積，易導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死，而細(xì)胞凋亡是心肌I/R發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)〔5〕；同時(shí)，糖尿病心肌氧化應(yīng)激可加重I/R損傷，心肌I/R后產(chǎn)生過量活性氧可進(jìn)一步加重再灌注后的心肌損傷〔6〕。Caspase-3在凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中處于核心地位，被稱為死亡蛋白酶。研究表明心肌I/R時(shí)，心肌組織的Caspase-3表達(dá)顯著提高〔7，8〕?？寡趸瘎┛梢郧宄罅康淖杂苫犘渭怪泻写罅康目寡趸镔|(zhì)〔2，9〕，本文觀察鐮形棘豆提取物(EOF)對(duì)糖尿病大鼠I/R損傷的保護(hù)作用。

1 材料與儀器

1.1 藥物與試劑 鐮形棘豆樣品采于甘肅省瑪曲縣，經(jīng)甘肅省中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系鑒定；鏈脲佐菌素(STZ)購于美國西格瑪奧德里奇公司；通心絡(luò)膠囊購于以嶺藥業(yè)；2′，4′-二羥基查耳酮對(duì)照品購自中國藥品生物制品檢定所；乳酸脫氫酶 (LDH) 測定試劑盒(批號(hào)：20120901)、肌磷酸酶(CK) 測定試劑盒 (批號(hào)：20120918)、丙二醛(MDA) 測定試劑盒(批號(hào)：20120920)、超氧化物歧化酶(SOD) 測定試劑盒(批號(hào)：20120903)、谷胱甘肽(GSH) 測定試劑盒(批號(hào)：20120920) 均購于南京建成生物制品研究所；Prime ScriptTMRT 試劑盒購自寶生物(大連)有限公司；引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.2 動(dòng)物及儀器 雄性SD大鼠，體重150～170 g，由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。離心機(jī)Z-36HK臺(tái)式離心機(jī)；UV-1800紫外可見分光光度計(jì)；DK-98-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋；BS-224-S型電子分析天平；熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀 (Invitrogen Biotechnology Co.，LTD)；DYY-8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀；Image Quant 300凝膠成像系統(tǒng)(GE Health)；1100 HPLC系統(tǒng)(Agilent)。

1.3 方法

1.3.1 鐮形棘豆提取物的制備及含量測定 鐮形棘豆粉碎后加入圓底燒瓶，加入適量乙醇，加熱回流提取3 h后，減壓回收乙醇，其成分測定采用高效液相色譜法(HPLC)，首先將提取物用無水乙醇溶解，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法測定EOF中2′，4′-二羥基查耳酮的含量〔9〕。

1.3.2 糖尿病模型建立 大鼠高脂飼料飼養(yǎng)(含10%豬油與90%普通飼料)4 w后禁食12 h，腹腔注射0.1 mmol/L枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液溶解的STZ 50 mg/kg，72 h后采尾血測定血糖。血糖持續(xù)≥16.7 mmol/L 達(dá)1 w，并出現(xiàn)明顯多尿、多飲癥狀者定為糖尿病大鼠〔10〕。

1.3.3 I/R損傷模型建立 大鼠以烏拉坦腹腔注射麻醉，頸動(dòng)脈插管，按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行〔10〕，建立I/R損傷模型。

1.3.4 分組與給藥 糖尿病大鼠被隨機(jī)分為空白組、I/R模型組，EOF低、中、高(50、100、200 mg·kg-1·d-1)劑量組和陽性對(duì)照組，每組8只大鼠。EOF組每天采用EOF不同劑量灌胃處理，I/R模型組用與藥物等體積的生理鹽水灌胃，陽性對(duì)照用通心絡(luò)膠囊按照100 mg·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)給藥2 w后，頸動(dòng)脈取血，并分離心臟后用生理鹽水清洗。-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 血清及心肌生物指標(biāo)測定 血清及心肌組織的LDH、CK、MDA、SOD、GSH測定依據(jù)試劑盒操作進(jìn)行。

1.3.6 心肌組織Caspase-3 mRNA表達(dá)的測定 采用Trizol試劑一步法提取細(xì)胞和組織總RNA后依據(jù)試劑盒說明合成cDNA，β-actin為內(nèi)參基因，然后采用半定量RT-PCR檢測Caspase-3 mRNA表達(dá)。以各基因片段(目的基因)與相應(yīng)模板β-actin(內(nèi)參)片段灰度值的比值作為其 mRNA相對(duì)表達(dá)水平數(shù)值(N)。N=目的基因片段的灰度值/對(duì)應(yīng)內(nèi)參片段灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 EOF中2′，4′-二羥基查耳酮的含量 對(duì)照品的HPLC如圖1所示，測得結(jié)果表明EOF中2′，4′-二羥基查耳酮的含量為6.25%。

2.2 EOF對(duì)糖尿病I/R大鼠血清指標(biāo)的影響 與空白組比較，I/R模型組大鼠血清MDA、CK以及LDH明顯升高，SOD含量以及GSH活性明顯降低(P<0.01)；EOF中、高劑量組能明顯減少LDH、CK和MDA，同時(shí)提高SOD含量和GSH活性(P<0.01；P<0.05)；陽性對(duì)照組各項(xiàng)測定指標(biāo)與I/R模型組也有顯

著差異(P<0.01；P<0.05)，見表1。

圖1 對(duì)照品的HPLC色譜圖表1 EOF對(duì)糖尿病I/R大鼠模型血清、心臟組織中相關(guān)生化指標(biāo)的影響±s,n=8)

組別血清LDH(×103U/L)CK(U/ml)MDA(μmol/L)SOD(U/ml)GSH(μmol/L)心臟組織LDH(×103U/L)CK(U/ml)MDA(μmol/L)SOD(U/ml)GSH(μmol/L)空白組3.2±1.30.7±0.26.0±1.042.3±5.296.6±7.96.2±1.51.4±0.26.2±0.656.5±6.3106.6±4.5I/R模型組8.3±1.51)2.3±0.81)10.4±1.71)22.3±2.61)68.5±6.31)10.3±1.31)3.9±0.51)12.4±1.71)30.3±8.11)72.3±5.81)EOF低劑量組5.6±1.81.8±1.38.8±1.628.4±5.373.4±5.98.3±1.52.4±1.210.2±2.246.3±3.980.5±7.1EOF中劑量組4.4±1.42)1.2±0.43)7.2±1.43)35.2±5.62)84.2±5.02)7.9±2.01.9±0.22)8.4±1.23)49.5±4.32)98.3±3.93)EOF高劑量組4.2±1.53)1.2±0.23)6.5±1.33)34.5±3.52)86.5±6.72)6.4±1.03)1.7±0.32)7.5±0.43)52.4±5.52)100.7±7.53)陽性對(duì)照組4.0±1.13)0.8±0.32)6.2±0.92)33.3±5.22)85.9±7.32)6.3±1.23)1.4±0.22)7.0±0.82)53.7±4.82)103.2±6.23)

與空白組比較:1)P<0.01；與I/R模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05

2.3 EOF對(duì)心肌組織各指標(biāo)的影響 I/R模型組所有指標(biāo)與空白組比較有顯著差異(P<0.01)；EOF中、高劑量組均能明顯減少LDH和MDA，且可顯著提高SOD和CK含量以及GSH的活性(P<0.01；P<0.05)；陽性對(duì)照組上述各項(xiàng)測定指標(biāo)與模型組有顯著差異(P<0.01；P<0.05)。見表1。

2.4 EOF對(duì)I/R大鼠心肌組織Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響 Caspase-3 mRNA在290 bp左右有一清晰的擴(kuò)增條帶，與空白組比較，Caspase-3 mRNA在I/R模型組顯著升高(0.79±0.10 vs 0.46±0.09,P<0.01)，Caspase-3 mRNA在EOF中(0.58±0.12)、高劑量組(0.50±0.08)及陽性對(duì)照組(0.49±0.05)中的平均相對(duì)含量明顯低于I/R模型組(P<0.01；P<0.05)，而在EOF低劑量組(0.72±0.15)中與模型組無差異(P>0.05)。見圖2。

1.空白組；2.I/R模型組；3.EOF低劑量組；4.EOF中劑量組；5.EOF高劑量組；6.陽性對(duì)照組；7.Marker圖2 EOF對(duì)糖尿病I/R大鼠Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響

3 討 論

EOF含有山奈素、鼠李素和2′，4′-二羥基查耳酮等黃酮類化合物，黃酮類化合物能誘導(dǎo)肝微粒體蛋白及細(xì)胞色素P450的合成，具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化等作用〔11〕。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示EOF對(duì)糖尿病大鼠I/R損傷具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與清除氧自由基、抑制氧自由基產(chǎn)生、抑制脂質(zhì)過氧化的作用有關(guān)。再灌注損傷使得代謝產(chǎn)物增多，大量氧自由基產(chǎn)生，引起細(xì)胞脂質(zhì)化，從而影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性，血清MDA水平升高，SOD氧自由基清除能力和GSH 活性下降〔12〕。

因此測定血清中酶如LDH和CK等的活性可評(píng)價(jià)缺氧所致組織損傷的程度，而GSH、SOD和MDA等是反映脂質(zhì)過氧化損傷的指標(biāo)，可間接反映細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：EOF中、高劑量組能明顯抑制缺血/再灌注損傷所致的血清和心肌中LDH、CK活性的升高，增加心肌細(xì)胞和血清中SOD和GSH活性。且EOF中、高劑量能夠下調(diào)Caspase-3 mRNA的表達(dá)，可以推測EOF抗凋亡與下調(diào)Caspase-3的mRNA基因表達(dá)有關(guān)，由此減少自由基的生成和心肌細(xì)胞的氧化性損傷，增強(qiáng)了心肌抗氧化能力的同時(shí)改善能量代謝，從而起到了對(duì)抗心肌缺血再灌注損傷的作用。

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〔2015-12-07修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)

武三卯(1955-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥理研究。

武 燕(1981-)，女，講師，主要從事內(nèi)科學(xué)及分子藥理學(xué)研究。

R541.4

A

1005-9202(2017)08-1884-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.026