DNA載體介導(dǎo)的小干擾RNA Tet-on基因表達系統(tǒng)的調(diào)控效應(yīng)檢測*

李朵璐，周玉冰，韓超，安琪，李峰，段震峰，張曉堅，闞全程

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450052）

DNA載體介導(dǎo)的小干擾RNA Tet-on基因表達系統(tǒng)的調(diào)控效應(yīng)檢測*

李朵璐，周玉冰，韓超，安琪，李峰，段震峰，張曉堅，闞全程

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450052）

目的 觀察構(gòu)建的DNA載體介導(dǎo)的小干擾RNA Tet-on基因表達系統(tǒng)的調(diào)控效應(yīng)。方法構(gòu)建DNA載體介導(dǎo)的小干擾RNA（siRNA）Tet-on表達載體，pDIRS4.1 siRNA。以增強綠色熒光蛋白（EGFP）基因和白細胞介素6（IL-6）基因為目的基因，應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)染方法，分別將pDIRS4.1/EGFP siRNA載體和pEGFP-N 3質(zhì)粒、pDIRS4.1IL-6siRNA載體和p IRESIL-6質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人成骨肉瘤細胞，加入系列濃度的四環(huán)素（Dox）后，觀察其誘導(dǎo)效應(yīng)。結(jié)果pDIRS4.1 siRNA在人成骨肉瘤細胞中能夠高效轉(zhuǎn)染；隨著Dox濃度升高，pDIRS4.1 siRNA載體在人成骨肉瘤細胞中對目的基因的沉默作用有較好的調(diào)控性，且目的基因的表達與Dox具有嚴格的劑量依賴關(guān)系，高濃度Dox時，IL-6表達水平降低約12倍。結(jié)論該研究構(gòu)建的以DNA載體介導(dǎo)的能夠高效調(diào)控siRNA沉默基因效應(yīng)的Tet-On基因表達系統(tǒng)，能夠促進其在更多模型系統(tǒng)中進行基因功能研究的應(yīng)用。

小分子干擾RNA；四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)；DNA載體；基因調(diào)控

基因表達的調(diào)控作用對于解釋不同生物的各種生物機制是至關(guān)重要的。利用RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)進行基因沉默，在研究腫瘤發(fā)生機制以及開發(fā)抗腫瘤靶向治療藥物方面是一個有效的研究手段[1-2]。目前，通過病毒載體介導(dǎo)的可調(diào)控性表達的RNA i載體系統(tǒng)，已經(jīng)在哺乳動物的細胞模型和動物模型中，應(yīng)用于基因功能的研究[3-5]。雖然病毒載體介導(dǎo)的RNA i調(diào)控系統(tǒng)有轉(zhuǎn)染效率高的優(yōu)點，但是病毒載體在制備過程中潛在的野生型病毒基因的污染所引起的使用安全性問題，及其高昂的制備費用，仍然是限制病毒型載體在臨床廣泛應(yīng)用的重要原因[6-7]。因此，研發(fā)一種高效、低毒的基于非病毒載體的RNAi調(diào)控系統(tǒng)，對于促進這一技術(shù)在臨床的廣泛應(yīng)用是必要的。

四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)能夠在真核生物中，通過加入四環(huán)素（Tetracycline，Tc），或其類似物強力霉素（Doxycycline，Dox），實現(xiàn)對特定目的基因精準而高效的調(diào)控表達，這種類型的四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)，被稱為Tet-On調(diào)控系統(tǒng)。在Tet-On調(diào)控系統(tǒng)中，在非誘導(dǎo)狀態(tài)下，目的基因基本不表達，而當加入四環(huán)素時，可以實現(xiàn)目的基因強于背景基因105個數(shù)量級倍數(shù)的表達[8]。目前，四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于包括植物、動物等多細胞生物在內(nèi)的真核細胞生物[9-11]。

本研究首次將Tet-On調(diào)控元件與能夠啟動小干擾RNA（siRNA）表達的人U6啟動子融合，構(gòu)建了非病毒siRNA Tet-On基因表達載體pDIRS4.1。該載體系統(tǒng)目的siRNA的表達將隨著外源性Dox的加入而增強，并將由于缺乏Dox而受抑制。本研究觀察到pDIRS4.1在人成骨肉瘤細胞能夠高效轉(zhuǎn)染，并且能夠有效調(diào)節(jié)siRNA對目的基因EGFP和IL-6的干擾效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 載體系統(tǒng)構(gòu)建

本研究構(gòu)建的pDIRS4.1載體是在pTRE2hyg（美國BD公司）載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建而成的。pTRE2 hyg載體是一種能夠在Tet-On或Tet-Off基因修飾的細胞株中表達的質(zhì)粒，是在Resnitzky等曾經(jīng)報到的pUHD10-3載體的基礎(chǔ)上發(fā)展而來[12]。首先，擴增pSilencerTM2.1-U6neo載體中（美國Ambion公司）RNA聚合酶Ⅲ依賴性的能夠啟動siRNA表達的人U6啟動子序列（GenBank序列號：XO7425）。人U6啟動子PCR擴增引物見表1。利用TA Cloning試劑盒（美國Invitrogen公司），將U6的PCR擴增產(chǎn)物克隆入pCR 2.1載體，鑒定。從pCR 2.1載體中酶切出U6啟動子片段，與已經(jīng)過SacI酶切（美國Promega公司）的pTRE2hyg載體連接。將重組質(zhì)粒送上海生物工程股份有限公司進行測序鑒定。

表1 U6引物序列

構(gòu)建表達EGFP或IL-6 siRNA的Tet-On表達載體，關(guān)鍵步驟是將目的基因的反向重復(fù)序列克隆至pDIRS4.1。選擇編碼EGFP siRNA和IL-6 siRNA的基因序列，通常以GG開頭，并在每個基因編碼區(qū)確定兩個靶向結(jié)合位點，BLAST軟件比對，確定選擇的序列和其他基因不具有同源性。EGFP基因和IL-6基因的兩個靶向結(jié)合位點序列見表2。合成以上帶有靶向結(jié)合位點的EGFP siRNA和IL-6 siRNA寡核苷酸探針序列（美國Integrated DNA Technologies公司），退火，并將其反向連接入已經(jīng)過BamHⅠ和CIaⅠ酶切酶切處理的pDIRS4.1載體，得到重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，提取。經(jīng)BamHⅠ/CIaⅠ酶切鑒定，將重組質(zhì)粒送上海生物工程股份有限公司進行測序鑒定。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

本研究應(yīng)用的細胞株是課題組前期構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pTet-On的U-2OS Tet-On細胞株。U-2OS Tet-On細胞株用含有10%四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)專用胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液（美國Invitrogen公司，含100 u/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素），在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前，將細胞接種至24孔板，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)至細胞融合達70%～80%時進行轉(zhuǎn)染。采用脂質(zhì)體（Lipofectamine PlusTM，美國Invitrogen公司）轉(zhuǎn)染方法，按照2.5μl siRNA∶0.1μg質(zhì)粒∶1μl轉(zhuǎn)染試劑的比例，配制100nm的siRNA轉(zhuǎn)染體系，將0.1μg/孔的pEGFP-N3質(zhì)粒和0.5μg/孔的pDIRS4.1/ EGFPa siRNA或pDIRS4.1/EGFPb siRNA共轉(zhuǎn)染至U-2OS Tet-On細胞。采用同樣方法，將0.1μg/孔的 p IRESIL-6質(zhì)粒和 0.5μg/孔的 pDIRS4.1IL-6a或pDIRS4.1IL-6b共轉(zhuǎn)染至U-2OS Tet-On細胞。Dox應(yīng)用蒸餾水配制為1 mg/ml的母液，過濾，并配制0.00、0.01、0.05、0.20和2.00μg/ml的Dox，避光置入-20℃冰箱冷凍保存。轉(zhuǎn)染24 h后，分別加入配制的0.00、0.01、0.05、0.20和2.00μg/ml的Dox，并于轉(zhuǎn)染48 h后觀察結(jié)果。

表2 EGFP基因和IL-6基因的靶向結(jié)合位點序列

1.3 EGFP、IL-6表達的檢測

EGFP的表達水平在轉(zhuǎn)染后48 h，倒置熒光顯微鏡下觀察。轉(zhuǎn)染后96 h，收集細胞上清液，應(yīng)用定量ELISA試劑盒（美國R&D公司）檢測IL-6的表達水平，酶標儀450 nm處測定吸光值，并建立標準曲線，計算IL-6濃度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用Graph Pad Prism 5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用均數(shù)±標準差（±s）表示，t檢驗比較不同組別間基因表達水平的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建的pDIRS4.1 siRNA載體系統(tǒng)

本研究在含有四環(huán)素反應(yīng)元件（Tet-responsive element，TRE） 的 pTRE2hyg質(zhì)?；A(chǔ)上構(gòu)建了pDIRS4.1 siRNA載體系統(tǒng)。在構(gòu)建的pDIRS4.1載體的TRE-U6啟動子區(qū)域下游存在一個多克隆位點（multiple cloning site，MCS）。構(gòu)建的pDIRS4.1載體在系列Dox濃度下，實現(xiàn)對TRE-U6啟動子下游目的siRNA的可調(diào)控性表達，pDIRS4.1載體的工作原理見圖1。

本研究構(gòu)建的 pDIRS4.1載體是通過將pTRE2hyg載體中的CMV啟動子替換為能夠啟動siRNA表達的人U6啟動子而構(gòu)建成的。TRE在U6啟動子上游，含有42 bp的7個同向重復(fù)的四環(huán)素操縱子序列（tet operator sequene，tetO）。因此，當加入外源性Dox時，U6啟動子功能激活，從而啟動下游siRNA的表達（見圖1A）。

圖1 pDIRS4.1 siRNA載體系統(tǒng)構(gòu)建示意圖

本研究構(gòu)建的pDIRS4.1載體的結(jié)構(gòu)圖見圖1B，它是建立在5.3 kb的含有潮霉素抗性基因的DNA載體pTRE2hyg的基礎(chǔ)上。pDIRS4.1的U6啟動子區(qū)域位于 320~577 bp。構(gòu)建的 pDIRS4.1 EGFP siRNA載體，轉(zhuǎn)錄過程中能夠形成含有10 bp環(huán)狀結(jié)構(gòu)的19~22 bp的發(fā)卡結(jié)構(gòu)（見圖1C）。

2.2 U-2OSTet-On細胞中pDIRS4.1 EGFP siRNA對EGFP表達的影響

隨著加入不同濃度的Dox，能夠有效誘導(dǎo)EGFP的表達，倒置熒光顯微鏡下可見，隨著加入的Dox濃度增高，EGFP的表達量增加，證明U-2OS Tet-On細胞功能正常。在未加入Dox時，轉(zhuǎn)染pTRE-d2EGFP質(zhì)粒的細胞中幾乎沒有EGFP的表達（見圖2A）。

在 U-2OS Tet-On細胞中，pDIRS4.1 EGFP siRNA對EGFP表達的干擾作用如圖2B。在加入Dox 48 h后，EGFP的表達隨著Dox濃度的增加而下降；而當未加入Dox時，EGFP的表達則幾乎不受干擾。

2.3 U-2OS Tet-On細胞中pDIRS4.1IL-6siRNA對IL-6表達的沉默效應(yīng)

圖2 pDIRS4.1 EGFP siRNA對EGFP表達的調(diào)控作用 （倒置熒光顯微鏡×100）

表3 在U2OS Tet-On細胞中pDIRS4.1IL-6siRNA對IL-6表達的沉默效應(yīng) （n=3，pg/m l，±s）

表3 在U2OS Tet-On細胞中pDIRS4.1IL-6siRNA對IL-6表達的沉默效應(yīng) （n=3，pg/m l，±s）

組別IL-6 p IRESIL-6 630.53±16.77 p IRESIL-6+pDIRS4.1 EGFPsiRNA 622.50±13.02 p IRESIL-6+pDIRS4.1IL-6a（Dox：0.00μg/ml） 610.67±8.56 p IRESIL-6+pDIRS4.1IL-6a（Dox：0.01μg/ml） 504.56±23.61 p IRESIL-6+pDIRS4.1IL-6a（Dox：0.05μg/ml） 92.28±8.18 p IRESIL-6+pDIRS4.1IL-6a（Dox：0.20μg/ml） 61.52±6.30 PiresIL-6+pDIRS4.1IL-6a（Dox：2.00μg/ml） 50.68±9.52 p IRESIL-6p IRESIL-6+pDIRS4.1 EGFPsiRNA p IRESIL-6+pDIRS4.1IL-6b（Dox：0.00μg/m l）p IRESIL-6+pDIRS4.1IL-6b（Dox：0.01μg/m l）p IRESIL-6+pDIRS4.1IL-6b（Dox：0.05μg/ml）p IRESIL-6+pDIRS4.1IL-6ab（Dox：0.20μg/m l）p IRESIL-6+pDIRS4.1IL-6ab（Dox：2.00μg/m l）642.58±6.63 625.46±13.15 581.64±7.87 265.62±11.61 180.39±8.84 82.48±9.49 69.25±5.42

用p IRESIL-6質(zhì)粒和構(gòu)建的pDIRS4.1IL-6asiRNA或pDIRS4.1IL-6bsiRNA載體共轉(zhuǎn)染U-2OS Tet-On細胞，轉(zhuǎn)染后96 h，觀察到了IL-6的表達與Dox濃度具有劑量依賴性關(guān)系，此外，將p IRESIL-6質(zhì)粒和構(gòu)建的pDIRS4.1 EGFP siRNA載體共轉(zhuǎn)染U-2OS Tet-On細胞后，pDIRS4.1 EGFP siRNA并未影響IL-6的表達（見表3、4和圖3）。

表4 不同組別Il-6表達的t檢驗比較

圖3 U-2OS Tet-On細胞中pDIRS4.1 IL-6 siRNA對IL-6表達的沉默效應(yīng)

3 討論

自GOSSEN等首次報道四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)后，四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)至今仍是研究最詳細、并廣泛應(yīng)用于哺乳動物細胞、轉(zhuǎn)基因植物及轉(zhuǎn)基因鼠的一種可調(diào)控性載體[14-15]。本研究首次將四環(huán)素調(diào)控元件和表達siRNA的質(zhì)粒融合構(gòu)建了以DNA載體介導(dǎo)的siRNA Tet-On載體系統(tǒng)，pDIRS4.1 siRNA。非病毒真核表達載體，以其安全低毒、更易獲得的優(yōu)點在轉(zhuǎn)基因研究中廣泛應(yīng)用。限制非病毒DNA載體臨床應(yīng)用的主要原因是較低的轉(zhuǎn)染效率以及不可控性的持續(xù)基因表達。然而本研究觀察到pDIRS4.1 siRNA載體在U-2OS Tet-On細胞中能夠高效轉(zhuǎn)染，在共轉(zhuǎn)染0.5μg pDIRS4.1/EGFP和0.1μg pEGFP-N3后，當沒有加入Dox時，倒置熒光顯微鏡下觀察到了pEGFP-N370%～80%的轉(zhuǎn)染率，隨著Dox濃度的增高，pDIRS4.1/EGFP幾乎可以完全抑制pEGFP-N3中EGFP的表達，表明pDIRS4.1 siRNA載體在U-2OS Tet-On細胞中的高效轉(zhuǎn)染。此外，本研究構(gòu)建的pDIRS4.1 siRNA載體通過副作用較小、且價格相對低廉的Dox做誘導(dǎo)劑，能夠?qū)崿F(xiàn)對目的基因的可調(diào)控性表達，從而避免不可控的持續(xù)基因表達狀態(tài)。

四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)質(zhì)粒（pTet-On）在CMV啟動子作用下表達四環(huán)素調(diào)控蛋白（rtTA）。當含有TRE的載體轉(zhuǎn)染進入Tet-On細胞后，細胞內(nèi)表達的rtTA與TRE結(jié)合，在Dox存在的情況下，啟動下游基因的表達；在未加入Dox時，TRE介導(dǎo)的下游基因轉(zhuǎn)錄將會關(guān)閉。在有關(guān)pTet-On應(yīng)用于組織培養(yǎng)的研究中表明，轉(zhuǎn)染后4 h，能夠檢測到rtTA的表達，且在研究體系暴露于Dox的12～24 h后，能夠觀察到載體系統(tǒng)有效的誘導(dǎo)效應(yīng)[8，12]。本研究應(yīng)用了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pTet-On的U-2OSTet-On細胞，分別在轉(zhuǎn)染后的48和96 h，觀察pDIRS4.1/EGFP siRNA對EGFP表達的影響，以及pDIRS4.1IL-6siRNA對IL-6表達的影響，本研究結(jié)果觀察到在低濃度Dox下，pDIRS4.1 siRNA載體中的TRE-U6啟動子就能夠有效抑制目的基因的表達。如結(jié)果圖2和圖3所示，在0～2μg/ml的Dox濃度范圍內(nèi)，EGFP和IL-6的表達被有效干擾，呈現(xiàn)較大幅度的降低，高濃度Dox時，IL-6表達水平降低約12倍。

本研究構(gòu)建的pDIRS4.1 siRNA載體系統(tǒng)能夠在哺乳動物細胞模型中，實現(xiàn)對目的siRNA的有效調(diào)控，并且目的siRNA的表達水平與Dox的濃度具有明顯的劑量依賴性關(guān)系。pDIRS4.1 siRNA載體的應(yīng)用，能夠?qū)崿F(xiàn)在界定時間內(nèi)，逐步減少基因表達的基因功能研究，并且該工作原理的成功應(yīng)用也同樣適用于Tet-Off系統(tǒng)在基因功能研究中的運用。構(gòu)建將有利于促進應(yīng)用RNAi技術(shù)，在動物模型體內(nèi)進一步開展有關(guān)腫瘤發(fā)生機制以及開發(fā)抗腫瘤靶向治療藥物方面的研究，從而能夠?qū)σ恍┲匾膮?shù)進行更加準確地定量評估。

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（張西倩 編輯）

Detection of regulatory effects of a DNA vector-mediated Doxycycline-inducible siRNA system*

Duo-lu Li,Yu-bing Zhou,Chao Han,Qi An,Feng Li,Zhen-feng Duan, Xiao-jian Zhang,Quan-cheng Kan
(Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou,Henan 450052,China)

ObjectiveTo detect the regulatory effects of the established DNA vector-mediated Doxycyclineinducible siRNA system.MethodsA DNA vector-mediated Doxycycline-inducible siRNA system,pDIRS4.1,was established.The regulatory effects of pDIRS4.1 were investigated by detecting the expression changes of enhanced green fluorescent protein(EGFP)and interleukin 6(IL-6)after pDIRS4.1/EGFP siRNA,pEGFP-N3 plasmid, pDIRS4.1/IL-6 siRNA and pIRES IL-6 plasmid had been cotransfected into U-2OSTet-On cells respectively which were added with serial concentrations of Doxycycline(Dox).ResultsThe results showed that a high transfection efficiency(70%～80%)was obtained in the U-2OS Tet-On cells with pDIRS4.1 siRNA.pDIRS4.1 siRNA showed tight gene regulatory effects in the U-2OS Tet-On cells with the increase of Dox concentrations.Furthermore,the expressions of EGFP and IL-6 mediated by pDIRS4.1/EGFP siRNA and pDIRS4.1/IL-6 siRNA respectively had dose-dependent effectwith the concentration of Dox.When the concentration of Dox was high,the expression level of IL-6 decreased 12 times.ConclusionsA Dox-inducible siRNA expression system has been established through a non-viral mammalian expression vector.Tightly-regulated inducible siRNA expression systems of this type willlikely have wide application in exploring gene functions in numerousmodel systems.

small interference RNA;Tet-On system;DNA vector;gene regulation

R733

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.07.007

1005-8982（2017）07-0030-06

2016-04-12

河南省優(yōu)秀創(chuàng)新型科技團隊醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃項目（No：201303013）

闞全程，E-mail：quanchengkan@126.com