血清miR-21和miR-34a與晚期胃癌患者Folfox化療方案化療療效的關(guān)系研究

董 峰 馬君俊 蔡正昊 趙 軒 鄭民華

血清miR-21和miR-34a與晚期胃癌患者Folfox化療方案化療療效的關(guān)系研究

董 峰 馬君俊 蔡正昊 趙 軒 鄭民華

目的 探討晚期胃癌患者Folfox方案化療前后血清miR-21和miR-34a水平變化及其與化療療效的關(guān)系。方法 以在我院接受Folfox方案化療的45例晚期胃癌患者為研究對象。采用Real-time PCR檢測化療前后miR-21和miR-34a水平，分析miR-21和miR-34a水平與化療療效和患者預(yù)后的關(guān)系，采用受試者工作曲線(ROC)評估m(xù)iR-21和miR-34a對化療療效的評估。結(jié)果 化療后，部分緩解6例(13.33%)、疾病穩(wěn)定10例(22.22%)、疾病進展29例(64.44%)，客觀緩解率為13.33%，疾病控制率為35.56%，中位生存期為8.1個月。化療后miR-21水平下調(diào)，而miR-34a水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?；熡行ЫMmiR-21水平低于無效組，而miR-34a水平高于無效組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。miR-21與化療療效呈負相關(guān)，miR-34a與之呈正相關(guān)(rs=-0.431，0.504，P<0.05)。miR-21低水平患者中位生存期7.6個月，而高水平患者為6.0個月；miR-34a低水平患者中位生存期5.5個月，而高水平患者為8.3個月，Log-Rank檢驗顯示，miR-21低水平患者中位生存期大于高水平患者(P<0.05)，miR-34a高水平患者中位生存期大于低水平患者(P<0.05)。miR-21和miR-34a聯(lián)合評估化療療效的曲線下面積為0.865、靈敏度為80.9%、特異度為89.8%。結(jié)論 血清miR-21和miR-34a與晚期胃癌化療療效和患者中位生存期相關(guān)。

微小RNA；晚期胃癌；化療療效；中位生存期

胃癌是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，我國每年胃癌新發(fā)人數(shù)約占全球胃癌新發(fā)人數(shù)的40%以上[1-2]。早期胃癌通常行外科手術(shù)根治切除，術(shù)后5年生存率在90%以上；然而早期胃癌并無明顯臨床癥狀，直至發(fā)現(xiàn)時，大約1/3的患者已處于晚期階段[3-4]。晚期胃癌主要采用Folfox方案化療治療[5]。miRNA是近幾年來被大量研究的一類非編碼單鏈小分子RNA，有研究報道m(xù)iRNA異常表達與腫瘤藥物化療敏感性有關(guān)，在化療療效評價和預(yù)后判斷等方面發(fā)揮重要作用[6-7]。本研究通過檢測化療前后患者血清miR-21和miR-34a水平變化，分析其與化療療效和患者預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年5月—2015年10月，在我院接受Folfox方案化療的45例晚期胃癌患者為研究對象。其中男性31例，女性14例；年齡35～77歲，平均年齡(59.7±8.6)歲；低分化27例，中高分化18例；TNM分期，Ⅲ期20例，Ⅳ期25例；美國東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)評分，0～1分的18例，2分的27例。納入標(biāo)準：經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為晚期胃癌；均為首次治療，既往無放化療史；ECOG評分≤2分；無嚴重肝腎肺等器官功能障礙者。排除標(biāo)準：合并糖尿病、高血壓等其它慢性疾病者；合并其它惡性腫瘤者；存在精神障礙無法配合者。所有患者均簽署知情同意書，并經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.2 化療方法

所有患者均采用Folfox化療方案：第1 d，奧沙利鉑，130 mg/m2，持續(xù)靜脈滴注2 h；第1 d，亞葉酸鈣，400 mg/m2，持續(xù)靜脈滴注2 h；氟尿嘧啶，2 400 mg/m2，持續(xù)靜脈滴注46 h。一個化療周期為21 d，一共進行2個周期的化療。

1.3 療效判定

療效判定參考(WHO)制定的實體瘤療效評價標(biāo)準(RECIST 1.1版)：完全緩解(CR)：所有靶病灶全部消失；部分緩解(PR)：所有靶病灶的最大長徑總和減少30%或以上；疾病穩(wěn)定(SD)：所有靶病灶的最大長徑總和減少小于30%或增大20%以下；疾病進展(PD)：所有靶病灶的最大長徑總和增大20%或以上。客觀緩解率(ORR)=(CR+PR)/總例數(shù)，疾病控制率(DCR)=(CR+PR+SD)/總例數(shù)。

1.4 Real-time PCR檢測miR-21和miR-34a水平

(1)采集對象空腹肘靜脈血，離心取上層血清，按miRNeasy Serum/Plasma Kit提取試劑盒操作提取血清miRNA，采用Nano Drop 2 000 c評估樣品質(zhì)量；(2)按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。體系：5×miScript HiSpec Buffer 2 μL，10×miScript Nucleics Mix 1 μL，miScript Reverse Transcriptase 1 μL，RNase-free Water 3 μL，模板miRNA 3 μL。條件：16℃/30 min，42℃/30 min，85℃/5 min；(3)以cDNA為模板，進行Real-time PCR擴增。體系：2×SYBR Green PCR Mix 5 μL，10×miScript Universal Primer(通用下游引物)1 μL，特異性上游引物1 μL，RNase-free Water 2 μL，模板cDNA 1 μL，共計10 μL。條件：95℃/15 min，94℃/15 s、55℃/30 s、70℃/30 s，共40個循環(huán)。所需引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計合成(表1)。目的基因相對表達水平ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參Ct值，ΔCt化療前=Ct化療前-U6，ΔCt化療后=Ct化療后-U6。ΔCt值越大，目的基因相對表達水平越低，ΔCt值越小，目的基因相對表達水平越高。

表1 miRNAs特異性引物

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 化療前后血清miR-21和miR-34a水平比較

與化療前比較，化療后患者血清miR-21相對表達水平顯著降低[(2.015±1.054)vs.(2.809±2.321)]；而血清miR-34a相對表達水平顯著升高[(2.419±1.215)vs.(1.323±0.071)]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 晚期胃癌患者化療前后血清miR-21和miR-34a水平比較

2.2 miR-21和miR-34a水平與化療療效的關(guān)系

45例患者經(jīng)化療后，CR 0例，PR 6例(13.33%)，SD 10例(22.22%)，PD 29例(64.44%)，ORR 6例(13.33%)，DCR 16例(35.56%)。根據(jù)化療療效將患者分為有效組(CR+PR+SD，n=16)和無效組(PD，n=29)?；熡行ЫM患者化療后miR-21水平明顯低于無效組(3.532±2.383vs. 2.064±1.055)，化療有效組患者化療后miR-34a水平明顯高于無效組(1.006±0.051vs. 2.531±1.258)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表3)。Spearman秩相關(guān)分析，miR-21與化療療效呈負相關(guān)(rs=-0.431，P<0.05)，miR-34a與化療療效呈正相關(guān)(rs=0.504，P<0.05)。

2.3 miR-21和miR-34a水平與預(yù)后的關(guān)系

化療后，45例患者miR-21和miR-34a平均值為(2.809±2.321)和(1.323±0.071)，高于均值的定義為高水平，低于均值的定義為低水平。miR-21低水平患者21例，中位生存期7.6個月；高水平患者24例，中位生存期6.0個月。Log-Rank檢驗顯示，miR-21低水平患者中位生存期顯著大于高水平患者(P<0.05)。miR-34a低水平患者27例，中位生存期5.5個月；高水平患者18例，中位生存期8.3個月。Log-Rank檢驗顯示，miR-34a高水平患者中位生存期顯著大于低水平患者(P<0.05)。(圖1)。

表3 化療有效組和無效組miR-21和miR-34a水平比較

圖1 不同水平miR-21和miR-34a患者的生存曲線Figure 1 Survival curves of patients with different levels of miR-21 and miR-34aNote：Left：Survival curves of patients with different levels of miR-21；Right：Survival curves of patients with different levels of miR-34a.

2.4 miR-21和miR-34a對化療療效的評估

miR-21和miR-34a 聯(lián)合評估化療療效的曲線下面積(Area under curve，AUC)為0.865、靈敏度為80.9%、特異度為89.8%(表4)。

表4 miR-21和miR-34a對化療療效的評估

3 討論

目前，針對晚期胃癌患者臨床上主要采用以鉑類化合物為基礎(chǔ)的化療方法，然而由于腫瘤細胞對鉑類化合物存在耐藥，多數(shù)患者經(jīng)一線化療后臨床效果并不令人滿意，必須進行二線甚至三線化療[8]。目前國內(nèi)外大都采用RECIST實體瘤療效評價法對化療療效進行評價，然而該方法存在周期長、費用高昂等不足之處[9]。因此，尋找預(yù)測鉑類化合物化療療效的敏感標(biāo)志物具有重大的臨床應(yīng)用價值，以便對化療療效進行及時有效的評估，及時區(qū)分對化療不敏感的患者，并及時調(diào)整化療方案。

miRNA參與了各種類型腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10]，其作為新的血液腫瘤標(biāo)志物，在腫瘤化療療效評價以及預(yù)后判斷方面的研究應(yīng)用已成為近幾年來的熱點話題。Wei等[11]研究發(fā)現(xiàn)，與進展期肺癌患者相比，化療后緩解患者的血清miR-21顯著下降，提示miR-21可作為肺癌對鉑類化療藥物敏感性的評價指標(biāo)。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-21低表達肺癌患者，其3年存活率明顯大于高表達患者，提示血清miR-21是判斷肺癌患者存活期的獨立預(yù)測因素。Yang等[13]研究顯示，對順鉑耐藥的胃癌SGC7901/DPP細胞株中miR-21的表達明顯上調(diào)，而下調(diào)該細胞株中miR-21的表達可顯著增加其對順鉑的敏感性。劉明明等[14]研究顯示，過表達肺癌A549/DDP細胞株中miR-34a可明顯增加腫瘤細胞對順鉑的敏感性，其機制可能與降低耐藥基因表達有關(guān)。Cao等[15]研究證實，胃癌SGC-7901/DDP細胞株中miR-34a的表達顯著上調(diào)，而過表達該細胞株中miR-34a的表達可明顯增加其對順鉑的敏感性。基于以上研究，我們認為miR-21和miR-34a與包括胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的化療療效有關(guān)。因此，通過檢測化療前后miR-21和miR-34a水平的變化能夠預(yù)測化療療效和預(yù)后。血清中miRNA可以抵抗內(nèi)源性RNase酶的降解作用，非常穩(wěn)定，然而成熟的miRNA片段非常短，且其在血清中的含量非常少，因此對于檢測技術(shù)的要求非常高，目前通常采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測其表達情況。

本研究采用Real-time PCR檢測化療前后miR-21和miR-34a水平，結(jié)果顯示，化療后患者血清miR-21表達水平明顯下調(diào)而miR-34a表達水平明顯上調(diào)，提示miR-21和miR-34a可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。為進一步探討miR-21和miR-34a在晚期胃癌Folfox方案化療療效預(yù)測中的作用，本研究比較了化療有效組和無效組患者血清miR-21和miR-34a中的水平，結(jié)果顯示，化療后，有效組患者miR-21水平低于無效組而miR-34a水平高于無效組。相關(guān)性分析顯示miR-21與化療療效呈負相關(guān)，而miR-34a與之呈正相關(guān)。與此同時，本研究進一步分析了miR-21和miR-34a與患者生存期的關(guān)系，結(jié)果顯示，miR-21低水平患者中位生存期大于高水患者，而miR-34a低水平患者中位生存期低于高水平患者。相關(guān)性分析顯示miR-21與中位生存期呈負相關(guān)，而miR-34a與之呈正相關(guān)。以上結(jié)果提示miR-21和miR-34a與化療療效和患者預(yù)后密切相關(guān)。ROC曲線評估結(jié)果顯示，miR-21聯(lián)合miR-34a預(yù)測化療療效的曲線下面積(AUC)為0.865、靈敏度為80.9%、特異度為89.8%。

綜上所述，血清miR-21和miR-34a與晚期胃癌化療療效和患者中位生存期相關(guān)。本研究尚存在以下不足：樣本量較少且來源單一，缺少大樣本多中心的臨床研究；隨訪時間較短，缺少遠期生存分析。欲深入探討miR-21和miR-34a與晚期胃癌患者化療療效間的關(guān)系，尚需更多、更全面的研究，這也是本研究下一步研究的方向。

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(收稿：2016-10-25)

The correlation between serum miR-21 and miR-34a expression and the efficacy of Flofox chemotherapy regimen in patients with advanced gastric carcinoma

DONGFeng，MAJunjun，CAIZhenghao，ZHAOXuan，ZHENGMinhua

Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai Minimal Invasive Surgery Center，Shanghai 200025，China

Objective The objective of this study was to investigate the levels of serum miR-21 and miR-34a in patients with advanced gastric cancer before and after Folfox chemotherapy and its relationship with chemotherapy efficacy.Methods Forty-five patients with advanced gastric cancer who underwent Folfox chemotherapy were enrolled from May 2015 to October 2015.The levels of miR-21 and miR-34a were analyzed by Real-time PCR before and after chemotherapy.The relationship between miR-21 and miR-34a levels and chemotherapy efficacy was analyzed.The predictive values of miR-21 and miR-34a on the efficacy of chemotherapy were evaluated by the receiver operating curve(ROC).Results After chemotherapy，6 cases(13.33%)were relieved，10 cases(22.22%)were stable disease(SD)，29 cases(64.44%)were disease progress(PD)，the objective response rate(ORR)was 13.33%，the disease control rate(DCR)was 35.56%，the median survival time was 8.1 months.The level of miR-21 was down-regulated and up-regulation for miR-34a after chemotherapy.They were statistically significant(P<0.05).The level of miR-21 in the chemotherapy group was lower than that in the ineffective group，and the level of miR-34a was higher than that of the ineffective group(P<0.05).MiR-21 was negatively correlated with the efficacy of chemotherapy(rs=-0.431，P<0.05)，while miR-34a was positively correlated with it(rs=0.504，P<0.05).The median survival time was 7.6 months for low-level patients with miR-21 and 6.0 months for high-level patients.The median survival time of miR-34a patients was 5.5 months，compared with 8.3 months for high-level patients，with a statistically significant difference(P<0.05).The Log-Rank test showed that the median survival of patients with low miR-21 was higher than that of patients with high miR-21(P<0.05).The median survival of patients with high miR-34a was higher than that of patients with low miR-34a(P<0.05).The miR-21 combined with miR-34a in predicting chemotherapy efficacy under the curve(AUC)was 0.865，the sensitivity was 80.9% and the specificity was 89.8%.Conclusion miR-21 and miR-34a are correlated with chemotherapy efficacy median survival time of patients with advanced gastric cancer.

miRNA；Advanced gastric cancer；Chemotherapy efficacy；Median survival time

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院；上海市微創(chuàng)外科臨床醫(yī)學(xué)中心(上海 200025)

董峰，男，(1971-)，碩士，副主任醫(yī)師，從事胃腸道腫瘤的微創(chuàng)手術(shù)及分子靶向綜合治療的研究。

董峰，E-mail：kong6907@126.com

R453.9

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.02.010