三陰性乳腺癌中miRNA-124表達與E-鈣黏蛋白及雄激素受體的關系

湯大北 金 艷 龔振琴 初 眾 曹仲茹 張清媛

·基礎研究·

三陰性乳腺癌中miRNA-124表達與E-鈣黏蛋白及雄激素受體的關系

湯大北 金 艷 龔振琴 初 眾 曹仲茹 張清媛

目的 研究三陰性乳腺癌(Triple-negative breast cancer，TNBC)中miRNA-124(miR-124)的表達與E-鈣黏蛋白(E-cadherin)及雄激素受體(Androgen receptor，AR)的關系。方法 采用RT-PCR在TNBC組織和癌旁正常乳腺組織中檢測miR-124的表達，免疫組化檢測TNBC中E-cadherin及雄激素受體(AR)的表達。結果 與癌旁正常乳腺組織相比，TNBC組織中miR-124表達明顯降低(P<0.05)；TNBC組織中，miR-124表達與組織分級、E-cadherin表達有關(P<0.05)，與AR表達無關(P>0.05)。結論 在TNBC中，miR-124可能通過調(diào)節(jié)E-cadherin的表達發(fā)揮抑癌作用。

三陰性乳腺癌；miR-124；E-鈣黏蛋白；雄激素受體

三陰性乳腺癌(Triple-negative breast cancer，TNBC)是指雌激素受體(Estrogen receptor，ER)、孕激素受體(Progesterone receptor，PR)和人表皮生長因子受體(Human epidermal growth factor receptor，HER-2)均為陰性的一種特殊類型乳腺癌，約占所有乳腺癌的15%，侵襲性高，容易復發(fā)轉移，預后差?？笶R、PR的內(nèi)分泌治療和抗HER-2的靶向治療對TNBC無效，化療作為目前唯一較為成熟的治療方法卻普遍存在副作用。因此尋找到能夠準確判定TNBC預后并對其進行有效治療的方法迫在眉睫。雄激素受體(Androgen receptor，AR)在TNBC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用并與預后相關，可能成為TNBC靶向治療的新選擇[1]。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)是一類介導細胞間相互黏附的鈣依賴性跨膜糖蛋白，參與形成和維護細胞間連結，作為上皮間質(zhì)轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程中的重要分子，其表達下降或缺失可造成乳腺癌的侵襲和轉移。相關研究證實TNBC組織中E-cadherin及AR的表達與患者臨床病理特征及預后有關[2]。目前雖然對AR和E-cadherin在TNBC中的表達情況有所研究，但二者在基因水平的調(diào)控因素尚不明確。

微小RNA(MicroRNA，miRNA)是指長度約21nt的非編碼小RNA，能夠在轉錄水平調(diào)節(jié)人體基因組內(nèi)1/3以上的基因表達[4]。miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[5-6]。miR-124是一個高度保守的抑癌miRNA，它在多種腫瘤中表達下調(diào)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預后密切相關。細胞學研究證實在乳腺癌中miR-124直接靶向EMT相關重要轉錄因子Slug，繼而調(diào)節(jié)E-cadherin表達，影響乳腺癌細胞轉移[3]；關于前列腺癌的研究表明，miR-124可靶向AR，抑制癌細胞生長[4]。Liang等[3]應用miRanda和TargetScan進行生物學信息預測，結果顯示miR-124可以靶向人類AR及EMT相關重要轉錄因子Slug(又名Snail2)3′UTR區(qū)。那么在TNBC中，miR-124可否參與TNBC的發(fā)生發(fā)展，與E-cadherin和AR是否相關，值得進一步研究。本研究擬分析TNBC中miR-124表達情況及其與AR和E-cadherin之間關系。

1 材料與方法

1.1 臨床標本

新鮮冰凍組織標本(腫瘤組織及癌旁正常組織)來自2011年1月—2012年8月入組的74例哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院TNBC患者。中位年齡49歲(28～70歲)。腫瘤組織學分級Ⅰ+Ⅱ級28例(37.8%)，Ⅲ級46例(62.2%)。

1.2 方法及試劑

1.2.1 免疫組化染色主要試劑及方法 抗AR兔多克隆抗體購自Abcam有限公司；抗E-cadherin兔多克隆抗體、即用型SABC(兔IgG)試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；免疫組化染色采用SABC法，并按試劑盒操作；抗AR兔多克隆抗體稀釋濃度1∶100；抗E-cadherin兔多克隆抗體稀釋濃度1∶100。

1.2.2 結果判斷 AR陽性判斷標準：以細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆?；蜃睾稚珵殛栃约毎?，對每片隨機選取3個高倍視野，分別統(tǒng)計每個視野的細胞總數(shù)和陽性細胞數(shù)，之后將這3個視野的陽性細胞率取平均值得到該片的細胞陽性率。陽性細胞數(shù)<10%為陰性，≥10%為陽性[5]。E-cadherin陽性判斷標準：以細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，結果采用半定量記分法判定。按染色強度評分：無顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽性細胞的百分比評分：陽性細胞≤25%為0分，26%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分。最后以兩者乘積所得分值作為判定標準：<4分者為陰性表達，≥4分者為陽性表達[6]。

1.2.3 總RNA的抽提制備及實時定量RT-PCR檢測 應用mirVanaTMRNA Isolation Kit提取總RNA，步驟按試劑盒說明書執(zhí)行。采用上海諾倫生物醫(yī)藥技術有限公司的Two Step Stemaim-it miR qRT-PCR Quantitation Kit(SYBR Green)(Cat.NO.LM-0101A)，并依照說明書完成應用BIO-RAD公司IQ5型實時定量PCR儀進行熒光定量PCR反應，反應條件：預變性95℃，3 min；變性95℃，20 s；退火及延伸62℃，40 s，重復40個循環(huán)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 以U6為內(nèi)參基因檢測miRNA的相對表達量變化，每個標本3次RQ均值用于統(tǒng)計學分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 miR-124在TNBC冰凍腫瘤組織中的表達

miR-124在TNBC組相對表達量為0.34±0.15，癌旁正常組miR-124的相對表達量為1.00±0.12。TNBC組明顯低于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1)。

圖1 miR-124在乳腺癌組織與正常組織中表達的差異性分析Figure 1 Comparison of miR-124 expression in TNBC tissues vs. PN controlsNote：*P<0.05，vs PN controls.

2.2 miR-124表達與臨床病理特征的關系

miR-124表達水平與腫瘤的組織學分級有關，組織學分級越高，miR-124表達水平越低(P=0.012)。miR-124表達與年齡、腫瘤大小、淋巴結狀態(tài)、臨床分期、月經(jīng)狀態(tài)、及組織學類型無關(P>0.05)(表1)。

表1 miR-124表達與臨床病理特征的關系

2.3 miR-124表達與AR、E-cadherin的關系

免疫組化法檢測TNBC患者冰凍腫瘤組織中AR及E-cadherin在TNBC中表達情況。AR的陽性表達率為21.6%，E-cadherin的陽性表達率為32.4%(圖2)。

在組織中，AR陽性組與陰性組miR-124表達水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；E-cadherin陽性組miR-124表達水平高于E-cadherin陰性組，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.045)(表2)，所以miR-124表達水平與E-cadherin表達有關，與AR表達無關。

表2 miR-124與AR及E-cadherin的關系

圖2 AR及E-cadherin在TNBC組織中的陽性表達(400×)Figure 2 The positive expression of AR and E-cadherin in TNBC tissue(400×)Note：A.The positive expression of AR in TNBC；B.The positive expression of E-cadherin in TNBC；C.The negative expression of AR in TNBC；D.The negative expression of E-cadherin in TNBC.

3 討論

TNBC是乳腺癌中的特殊亞型，Lehmann等[7]通過基因集群序列表達法將TNBC分為基底細胞樣1型(Basal-like 1，BL1)、基底細胞樣2型(Basal-like 2，BL2)、免疫調(diào)節(jié)亞型(Immunomodulatory，IM)、間質(zhì)型(Mesenchymal，M)、間質(zhì)干細胞樣亞型(Mesenchymal stem-like，MSL)和管腔雄激素受體亞型(Luminal androgen receptor，LAR)6種亞型。LAR亞型高表達AR DNA及AR蛋白。對比其他亞型，化療pCR低，但對抗雄激素治療敏感[6]。對AR信號轉導通路的研究有助于TNBC診治及預后判斷。國內(nèi)外研究表明[8-9]，AR在非三陰乳腺癌中的表達率超過70%，在TNBC表達為10%～50%的AR。多項研究認為AR表達與TNBC預后不良相關[9]。本研究中，AR的陽性表達率為21.6%。

E-cadherin是鈣黏蛋白家族的一員，其表達水平下降可導致細胞間黏附功能喪失，腫瘤細胞容易從原發(fā)灶中脫落并發(fā)生浸潤轉移，是上皮間質(zhì)化過程的標志。研究報道65%～73%的TNBC患者存在E-cadherin表達缺失現(xiàn)象[10-11]。在本研究中，有67.6%的患者E-cadherin表達陰性。在TNBC中，E-cadherin的表達意義尚無定論，但多數(shù)研究認為E-cadherin表達陰性組預后不良。既往研究結果顯示E-cadherin和AR可作為TNBC預后的預測因子[2]，通過兩者表達狀態(tài)的聯(lián)合分析，有助于評價TNBC的預后。

目前雖然對AR和E-cadherin在TNBC中的表達情況有所研究，但二者在基因水平的調(diào)節(jié)因素尚不明確。miRNA能夠識別特定的目標miRNA，在轉錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達。人類腫瘤中普遍存在miRNA的表達失調(diào)，發(fā)揮癌基因或抑癌基因的功能參與細胞增殖、凋亡和分化的調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的生物學功能。在前列腺癌中，miR-124可靶向作用于AR，抑制前列腺癌細胞的生長[12]。Lv等[13]通過細胞學實驗發(fā)現(xiàn)miR-124可以調(diào)節(jié)一系列轉移相關基因進而抑制乳腺癌轉移的多個步驟。MiR-124/miR-147/miR-193a-3p可共同靶向EGFR驅動的細胞周期網(wǎng)絡蛋白進而抑制細胞周期進展和乳腺癌增殖[14]。既往研究提示miR-124在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有抑癌功能，那么在TNBC中，miR-124與E-cadherin和AR是否有關，其又可否參與TNBC的發(fā)生發(fā)展值得研究。本研究首次在TNBC患者癌組織及其配對癌旁正常組織中比較miR-124的表達，RT-PCR結果顯示TNBC組織miR-124的表達明顯低于癌旁正常組織。MiR-124的表達與腫瘤分級呈負相關，與E-cadherin表達有關。Wang等[15]報道結直腸癌組織中miR-124比其配對癌旁正常組織的表達水平要低，并且與腫瘤組織分化程度相關；Liang等[16]報道乳腺癌組織中miR-124比其配對癌旁正常組織的表達水平低，并且與腫瘤的組織學分級及年齡呈負相關，與E-cadherin表達呈正相關；Lv等[17]在乳腺癌中未發(fā)現(xiàn)miR-124與E-cadherin存在相關性。本研究結果與既往研究結果相似，提示miR-124可能作為一個抑癌基因參與TNBC的發(fā)生發(fā)展。雖然Shi等[18]發(fā)現(xiàn)miR-124靶向作用于AR，通過抑制AR表達，上調(diào)抑癌基因p53，抑制前列腺癌細胞增殖，但本研究結果未顯示TNBC組織miR-124的表達與AR表達具有相關性，這與Peters在乳腺癌細胞之中的研究結果一致[19]。這一結果提示在不同腫瘤中，同種基因可能受不同的靶基因調(diào)控，乳腺癌中miR-124與AR的關系需大樣本量的體內(nèi)外實驗進一步研究。

綜上所述，在TNBC中miR-124可能通過調(diào)節(jié)E-cadherin的表達發(fā)揮抑癌作用。然而本研究樣本量有限，且未進行細胞學及動物學研究，結果仍需進行大樣本量臨床研究及分子生物學實驗加以證實。本研究為揭示TNBC中miR-124的作用及其與AR和E-cadherin的關系提供理論依據(jù)和實驗基礎。

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(收稿：2016-10-27)

Expression of miR-124 and its relationship with E-cadherin and androgen receptor in triple-negative breast cancer

TANGDabei，JINYan，GONGZhenqin，CHUZhong，CAOZhongru，ZHANGQingyuan

Harbin Medical University Cancer Hospital，Harbin 150081，China

Objective The objective of this study was to explore the expression of miRNA-124(miR-124)and its correlation with E-cadherin and androgen receptor(AR)in triple-negative breast cancer(TNBC).Methods The expression of miR-124 was detected by RT-PCR in TNBC tissues and adjacent normal breast tissues.The expression of E-cadherin and AR in TNBC was detected by immunohistochemistry.Results The expression of miR-124 in TNBC tissues was significantly correlated with histological grade and the expression of E-cadherin(P<0.05)，and the expression of miR-124 in TNBC tissues was significantly lower than that in adjacent normal breast tissues.No correlation was found between miR-124 and AR in TNBC tissues(P>0.05).Conclusion In TNBC，miR-124 may play an anti-tumor effect by modulating the expression of E-cadherin.

Triple-negative breast cancer；miR-124；E-cadherin；Androgen receptor

黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12541507)

哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院(哈爾濱 150081)

湯大北，女，(1983-)，博士，副主任醫(yī)師，從事乳腺癌診療的研究。

張清媛，E-mail：doctortang2008@126.com

R37.9

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.02.001