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    豬圓環(huán)病毒2型與豬輪狀病毒混合感染的防控

    2017-05-09 22:22:06熊文海凌萬旭顏洪奎何錦
    農(nóng)業(yè)與技術(shù) 2017年1期
    關(guān)鍵詞:混合感染

    熊文海 凌萬旭 顏洪奎 何錦

    摘要:云南省某養(yǎng)殖場飼養(yǎng)母豬260多頭,所產(chǎn)仔豬近期有20%左右發(fā)病,發(fā)病時(shí)間已達(dá)2個(gè)多月,部分仔豬出生第2天發(fā)病,主要癥狀表現(xiàn)為腹瀉,拉黃色糞便,同養(yǎng)殖場肥豬、保育豬均表現(xiàn)正常。為診斷仔豬患病情況,為綜合防控提供支持,對該場送檢的3頭病仔豬進(jìn)行病理剖檢,采集組織用PCR技術(shù)進(jìn)行病原檢測。檢測結(jié)果為1號豬豬圓環(huán)病毒2型抗原檢測呈陽性,3頭仔豬豬輪狀病毒抗原檢測呈陽性,說明該生豬養(yǎng)殖場發(fā)生了豬圓環(huán)病毒2型與豬輪狀病毒的混合感染。通過對該養(yǎng)殖場母豬、仔豬進(jìn)行免疫接種,發(fā)病仔豬隔離治療、加強(qiáng)養(yǎng)殖場飼養(yǎng)管理等措施,最終控制了豬圓環(huán)病毒2型與豬輪狀病毒混合感染的疫情。

    關(guān)鍵詞:仔豬腹瀉;豬圓環(huán)病毒2型;豬輪狀病毒;混合感染;PCR診斷

    中圖分類號:S828 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A DOI:10.11974/nyyjs.20170132061

    前言

    豬輪狀病毒(RV)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)輪狀病毒屬(Rotavirus)雙股RNA病毒。豬輪狀病毒病為急性腸道傳染病,臨床上表現(xiàn)為哺乳仔豬和斷奶前、后仔豬嘔吐、腹瀉、脫水體重減輕為特征的急性腸道傳染病。該病在全世界各地豬場均有發(fā)生,多發(fā)生于晚秋、冬季和早春,呈地方性流行,輪狀病毒感染是斷奶前后仔豬腹瀉的重要原因,初期病豬表現(xiàn)為沉郁、食欲不振和不愿活動(dòng),之后不久會(huì)發(fā)生嚴(yán)重腹瀉,糞便呈水樣或糊狀,黃白色或暗黑色,嚴(yán)重脫水、消瘦、體重減輕30%。本病癥狀的輕重受發(fā)病豬日齡、環(huán)境條件以及免疫狀況等的影響,一周齡以內(nèi)的仔豬受母源抗體的保護(hù),不易發(fā)病,但如果缺乏有效的母源抗體保護(hù),10日齡內(nèi)的仔豬發(fā)病癥狀嚴(yán)重,嚴(yán)重時(shí)病死率可達(dá)100%。病豬剖檢時(shí)可見豬小腸脹氣,腸內(nèi)容物呈棕黃色水樣,腸壁菲薄呈半透明狀,有時(shí)可見小腸彌漫性出血,胃中有未消化凝乳塊。

    豬圓環(huán)病毒?。≒VCD)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種較難控制的病毒性傳染病,該病由豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)引發(fā)。該病不同年齡階段的豬均可感染,該病主要侵害哺乳仔豬和育肥豬及懷孕母豬。臨床表現(xiàn)為豬高熱、呼吸困難、咳嗽、腸炎,母豬表現(xiàn)為繁殖障礙等。其引起的疫病包括豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS),增生性壞死性肺炎(PNP)、豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)、豬呼吸系統(tǒng)疾病綜合征(PRDC)、繁殖障礙、先天性震顫及腸炎等。該病的主要病理變化為:貧血、黃疸、淋巴結(jié)異常腫脹,內(nèi)臟和外周淋巴結(jié)腫大到正常體積的3~4倍,切面為均勻的白色,肺部有灰褐色炎癥和腫脹,肝臟發(fā)暗、萎縮、腎臟水腫、脾臟輕度腫大,胰、小腸、結(jié)腸也常有腫大及壞死病變。豬圓環(huán)病毒病為免疫抑制性疾病,常引發(fā)其他病原混合感染和繼發(fā)感染。如豬圓環(huán)病毒2型與豬瘟混合感染、豬圓環(huán)病毒2型與豬附紅細(xì)胞體混合感染等,而豬圓環(huán)病毒2型與豬輪狀病混合感染卻不常見。

    云南某生豬養(yǎng)殖場共養(yǎng)殖母豬260多頭,所產(chǎn)仔豬近期有20%左右發(fā)病,發(fā)病時(shí)間已達(dá)2個(gè)多月,發(fā)病豬死亡率不高,仔豬從出生的第2天發(fā)病,主要癥狀表現(xiàn)腹瀉,拉黃色糞便,仔豬斷奶后病情有所好轉(zhuǎn)。同養(yǎng)殖場大豬、保育豬均表現(xiàn)正常。

    2016年9月1日,云南省某生豬養(yǎng)殖場把3頭腹瀉仔豬送往云南農(nóng)業(yè)大學(xué)做檢測,根據(jù)腹瀉仔豬臨床癥狀、病理解剖結(jié)果、養(yǎng)殖場流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室PCR檢測結(jié)果,最終確診該養(yǎng)殖場哺乳仔豬腹瀉由豬圓環(huán)病毒2型與豬輪狀病毒混合感染引發(fā),根據(jù)診斷結(jié)果養(yǎng)殖場立即采取防控措施,7d后病情被控制,14d后疫情完全平息,現(xiàn)報(bào)告如下。

    1材料與方法

    1.1材料的來源

    1.1.1病豬病料

    來源于云南省某生豬養(yǎng)殖場送檢3頭腹瀉仔豬,由實(shí)驗(yàn)室解剖并無菌采取仔豬的肺臟、腎臟、肝臟,小腸內(nèi)容物。3頭仔豬組織樣品分別編號1號、2號、3號。

    1.1.2試劑

    RNAiso PlusTotalRNA購自大連寶生物生物技術(shù)有限公司;Bioteke細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒購至北京百泰克生物技術(shù)有限公司;RI Enzyme Mix、2×ES Reaction Mix、2×Trans Taq HiFiPCR Super Mix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;異丙醇、75%乙醇、瓊脂粉、TAE緩沖液、雙蒸水、氯仿等由實(shí)驗(yàn)室提供。

    1.2臨床觀察及病理解剖

    對送檢的3頭腹瀉仔豬進(jìn)行臨床癥狀觀察,并向養(yǎng)殖場戶主詳細(xì)了解發(fā)病情況,實(shí)驗(yàn)室剖檢3頭腹瀉仔豬,詳細(xì)記錄剖檢變化并取材保存。

    1.3PCR檢測

    1.3.1引物

    本次檢測7個(gè)病原特異性引物均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科院動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì),特異性引物片段長度為:豬瘟病毒234bp、豬藍(lán)耳病毒330bp、豬圓環(huán)病毒701bp、豬偽狂犬病毒500bp、豬流行性腹瀉病毒為471bp、豬傳染性胃腸炎病毒439bp、豬輪狀病毒374bp。引物由上海生工(生物)有限公司合成。

    1.3.2樣品DNA/RNA提取

    用Trizol法提取樣品組織中的總RNA,實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行;病毒DNA的提取按照百泰克生物技術(shù)有限公司的DNA快速提取試劑盒提取,實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行。

    1.3.3PCR擴(kuò)增目的片段

    提取的RNA利用北京全式金公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號AE301-02)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,并以eDNA為模板,利用特異性引物分別進(jìn)行豬瘟、藍(lán)耳、豬流行性腹瀉、傳染性胃腸炎及輪狀病毒PCR擴(kuò)增。提取的DNA利用北京全式金公司的試劑盒(貨號AS131-02),利用特異性引物進(jìn)行豬圓環(huán)、豬偽狂犬病毒PCR擴(kuò)增。

    1.3.4目的基因片段PCR擴(kuò)增

    將上述提取出來的樣品RNA利用特異性引物對其進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,反轉(zhuǎn)錄體系如下2×ES Reaction Mix(含10×RTBuffer,dNTPs)5uL,EasyScriptTMⅡRT/RIEmzyme Mix(含Rnase Inhibitor,反轉(zhuǎn)錄酶)0.5uL,下游引物1uL,模板RNA 3.5uL,反應(yīng)體系為10uL。將配制好的體系置于42℃反應(yīng)30min,之后85℃反應(yīng)5min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于4℃保存?zhèn)溆?。將上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及提取出來的樣品DNA利用特異性引物對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增體系為:Mix(含10×PCR buffer,dNTPs,TransTaq酶)12.5 uL,dH20 10.5 uL,上下游引物各0.5 uL,DNA 1 uL,總反應(yīng)體系為25 uL。PRRSV擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94℃3 min;94℃1 min,65℃1 min,72℃1 min,40個(gè)循環(huán);72℃5 min。PCV、RV、TGEV、PEDV擴(kuò)增反應(yīng)條件同PRRSV。

    CSFV第1輪擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94℃5min;94℃30sec,53℃45sec,72℃50sec,34個(gè)循環(huán);72℃5min。將所得到的第1輪產(chǎn)物稀釋300倍后,進(jìn)行第2輪擴(kuò)增,反應(yīng)條件為:94℃5 min;94℃ 40sec,56℃40sec,72℃ 40sec,34個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。

    取上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL配制成體系后加樣到1.5%瓊脂糖凝膠(含0.2%EB)孔中,并在120V電壓下進(jìn)行30min的電泳,在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果,并拍照。

    1.4治療方法

    根據(jù)診斷結(jié)果采取特異性防控措施和綜合性防控措施相結(jié)合的方法。方法如下。

    1.4.1加強(qiáng)養(yǎng)殖場飼養(yǎng)管理

    新生仔豬及時(shí)飼喂初乳,注意仔豬防寒保暖;斷奶仔豬提供全價(jià)飼料,提高抵抗力;保證畜舍內(nèi)通風(fēng),防止飼養(yǎng)密度過大;做好衛(wèi)生消毒工作,嚴(yán)格控制人員、豬只流動(dòng),畜舍外每天采用3%火堿進(jìn)行消毒,畜舍內(nèi)使用高效且刺激性小的消毒威等消毒液加大稀釋倍數(shù)進(jìn)行帶豬消毒。

    1.4.2做好免疫接種工作

    對該養(yǎng)殖場母豬、哺乳仔豬、斷奶仔豬進(jìn)行豬輪狀病毒弱毒苗、豬圓環(huán)病毒弱毒苗緊急免疫接種。

    1.4.3發(fā)病豬的治療與處理

    對于發(fā)病仔豬,采取隔離措施,并對腹瀉物污染的設(shè)備、飼料等進(jìn)行嚴(yán)格消毒;停止飼喂母乳,采用抗病毒、抗細(xì)菌藥物,防止豬圓環(huán)病毒2型引發(fā)繼發(fā)感染,并配合免疫球蛋白進(jìn)行治療,口服糖鹽水或靜脈注射10%葡萄糖鹽水和3%-5%碳酸氫鈉溶液,補(bǔ)充Vc。對于治療無效仔豬,立即撲殺,嚴(yán)格的無害化處理。

    2結(jié)果與分析

    2.1臨床癥狀及病理解剖結(jié)果

    送檢3頭仔豬表現(xiàn)現(xiàn)為精神沉郁,怕冷,體型消瘦,腹瀉嚴(yán)重,拉黃色糞便。經(jīng)養(yǎng)殖戶了解到該生豬養(yǎng)殖場共飼養(yǎng)母豬260多頭,所產(chǎn)仔豬近期有20%左右發(fā)病,發(fā)病時(shí)間已達(dá)2個(gè)多月,發(fā)病仔豬死亡率不高,仔豬從出生的第2天發(fā)病,主要癥狀表現(xiàn)腹瀉,拉黃色糞便,仔豬斷奶后病情有所好轉(zhuǎn),同養(yǎng)殖場大豬、保育豬均表現(xiàn)正常。

    實(shí)驗(yàn)室剖檢3頭仔豬,可見仔豬腎臟出血、腸膨氣脹腫、肺出血變白、脾臟腫大,結(jié)合腹瀉仔豬臨床癥狀、及養(yǎng)殖場發(fā)病情況調(diào)查,初步懷疑仔豬感染病毒性疾病。

    2.2PCR檢測結(jié)果與分析

    3頭仔豬樣品PCR檢測結(jié)果顯示(見圖1):1號豬組織樣品豬圓環(huán)病毒抗原檢測出現(xiàn)陽性條帶,片段大小為701bp;1號豬、2號豬、3號豬組織樣品輪狀病毒抗原檢測出現(xiàn)陽性條帶,片段大小為374bp;均與預(yù)期相符,其他病毒檢測結(jié)果均為為陰性;說明該生豬養(yǎng)殖場發(fā)生了豬圓環(huán)病毒2型和豬輪狀病毒的混合感染。

    2.3治療結(jié)果

    采取1.4所述治療措施7d后回訪,養(yǎng)殖場未出現(xiàn)新病例,14d后回訪,疫情已被控制,養(yǎng)殖場正常運(yùn)轉(zhuǎn)。

    3結(jié)果討論

    臨床上豬圓環(huán)病毒2型與豬輪狀病毒混合感染仔豬的案例并不常見,僅根據(jù)病豬臨床癥狀和病理變化,根本無法確診,科學(xué)的診斷必須在此基礎(chǔ)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測。RV實(shí)驗(yàn)室檢測可以采用電鏡法、放射免疫實(shí)驗(yàn)、ELISA雙抗體夾心法和PCR病原檢測等H。PCV-2實(shí)驗(yàn)室檢測包括病毒分離與鑒定、間接免疫熒光技術(shù)、免疫組化技術(shù)、PCR病原檢測等。PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感度高、快速、簡便、重復(fù)性好等突出優(yōu)點(diǎn),在動(dòng)物疫病病原學(xué)檢測中越來越受歡迎,PCR技術(shù)在不斷完善與改進(jìn),臨床已有成熟的PCR方法進(jìn)行豬輪狀病毒、豬圓環(huán)病毒2型的檢測。此次實(shí)驗(yàn)室檢測正是采用PCR技術(shù)。

    根據(jù)腹瀉仔豬臨床癥狀、剖檢病理變化以及實(shí)驗(yàn)室PCR檢測結(jié)果,確診為該養(yǎng)殖場發(fā)生了豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)與豬輪狀病毒(RV)混合感染。該養(yǎng)殖場仔豬腹瀉主要發(fā)生在哺乳仔豬,揭示母源抗體水平下降。此次腹瀉由豬輪狀病毒感染引發(fā),而豬圓環(huán)病毒感染則使病情進(jìn)一步惡化。

    在確定病因后,養(yǎng)殖場立即采取對母豬、哺乳仔豬、斷奶仔豬緊急免疫接種豬圓環(huán)病毒2型弱毒苗、豬輪狀病病毒弱毒疫苗,對發(fā)病仔豬進(jìn)行隔離治療以及加強(qiáng)養(yǎng)殖場飼養(yǎng)管理等方面措施,最終控制了疫情。

    4結(jié)論

    該養(yǎng)殖場發(fā)生了豬圓環(huán)病毒2型與豬輪狀病毒混合感染疫情,通過對母豬、斷奶仔豬、哺乳仔豬進(jìn)行疫苗免疫,以及加強(qiáng)養(yǎng)殖場飼養(yǎng)管理等措施,最終控制了疫情。

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