低頻脈沖超聲對(duì)失下牙槽神經(jīng)后下頜骨病理改變修復(fù)的影響

楊 博，吳慶慶，張 亮，郭彥君，宮 蘋

四川大學(xué) 華西口腔醫(yī)學(xué)院口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院種植科，成都 610041

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·論 著·

低頻脈沖超聲對(duì)失下牙槽神經(jīng)后下頜骨病理改變修復(fù)的影響

楊 博，吳慶慶，張 亮，郭彥君，宮 蘋

四川大學(xué) 華西口腔醫(yī)學(xué)院口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院種植科，成都 610041

目的 觀察低頻脈沖超聲對(duì)于神經(jīng)損傷導(dǎo)致的骨質(zhì)病變的修復(fù)效果，并探討超聲作用的最佳劑量。方法 采用外科手術(shù)法經(jīng)頰側(cè)入路截?cái)啻笫笙卵啦凵窠?jīng)，對(duì)接縫合后每日行低頻脈沖超聲干預(yù)，術(shù)后4周行下頜骨取材，進(jìn)行感覺(jué)功能的恢復(fù)測(cè)試，觀察神經(jīng)恢復(fù)情況，顯微CT定量觀察骨質(zhì)改變，并通過(guò)HE、Masson以及免疫組織化學(xué)分析病理變化。結(jié)果 截?cái)嗌窠?jīng)后超聲干預(yù)可以促進(jìn)神經(jīng)損傷的恢復(fù)，同時(shí)提高骨小梁厚度與連續(xù)性，且占空比越高，效果越明顯。結(jié)論 低頻脈沖超聲可促進(jìn)神經(jīng)損傷導(dǎo)致的骨質(zhì)病變修復(fù)。

低頻脈沖超聲；下牙槽神經(jīng)；下頜骨

ActaAcadMedSin，2017,39(2)：215-224

在人的一生中骨組織始終處于骨改建的動(dòng)態(tài)平衡中，而成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞則直接參與平衡建立。骨組織中含有有髓鞘和無(wú)髓鞘的感覺(jué)神經(jīng)，神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)骨改建的調(diào)控一直是該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。研究顯示神經(jīng)末梢分泌的神經(jīng)肽，如降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)、P物質(zhì)、血管活性腸肽、神經(jīng)肽Y等參與調(diào)節(jié)骨改建[1- 2]。CGRP作為一種重要的感覺(jué)神經(jīng)肽，可以間接反映感覺(jué)神經(jīng)的恢復(fù)情況，以此判斷感覺(jué)神經(jīng)以神經(jīng)肽為媒介在調(diào)控骨代謝中的作用。有研究表明失下牙槽神經(jīng)可抑制下頜骨骨新生，促進(jìn)骨吸收，證實(shí)在神經(jīng)損傷后骨結(jié)構(gòu)會(huì)有一定程度的損傷[3- 4]。強(qiáng)度低于100 mW/cm2的低頻脈沖超聲(low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)是一種廣泛應(yīng)用于臨床的促進(jìn)骨折修復(fù)的治療手段，受到美國(guó)FDA食品藥品監(jiān)督管理局許可并允許進(jìn)行常規(guī)臨床使用。大量研究證實(shí)超聲可縮短新鮮骨折愈合時(shí)間，促進(jìn)延遲愈合或合并感染的骨折愈合[5- 6]。另有研究表明，LIPUS在體內(nèi)外周神經(jīng)損傷實(shí)驗(yàn)中可以促進(jìn)軸突再生[7- 8]。部分學(xué)者也對(duì)LIPUS促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的原理進(jìn)行了細(xì)胞水平的研究，認(rèn)為L(zhǎng)IPUS在體外可促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖，促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌[9- 10]。此外，大量證據(jù)顯示，LIPUS自身各項(xiàng)參數(shù)，如能量密度[10]、占空比[11]等的設(shè)定對(duì)于其生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮也有影響。因此，本研究擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)估低頻脈沖超聲對(duì)于神經(jīng)損傷導(dǎo)致的骨質(zhì)問(wèn)題的修復(fù)效果，并探究超聲作用的最佳劑量。

材料和方法

材料及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10%水合氯醛麻醉注射液；4萬(wàn)U注射用青霉素鈉；0.9%生理鹽水；聚酮碘液；75%酒精；4%多聚甲醛溶液；17%乙烯二胺四乙酸溶液；70%～100%梯度酒精溶液；蘇木素溶液，伊紅溶液等；兔抗CGRP抗體(Chemicon Ltd.，美國(guó))；二氨基聯(lián)苯胺試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，北京)等。手術(shù)儀器主要包括手術(shù)刀(直刀)、撐開器、小挖匙、小脈鑷、探針、持針器、顯微剪、線剪、眼科剪、注射器、沖洗空針、三角針、3- 0縫線、5- 0縫線、10- 0縫線。Von-Frey纖維絲(North Coast Medical，美國(guó))；Nikon Eclipse 80i 顯微鏡(Nikon，日本)及NIS-Elements采圖軟件(Nikon，日本)，顯微CT(μCT50，Scanco Medical，瑞士)等。Sprague-Dawley大鼠42只，8周齡，體重200 g左右，雄性，四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

動(dòng)物模型制備 按4 μl/g經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛注射液進(jìn)行麻醉。待大鼠麻醉完成后，行右側(cè)下頜骨區(qū)域備皮，手術(shù)區(qū)聚維酮碘液消毒3次，75%酒精脫碘后鋪巾。距口角5 mm處向腮腺區(qū)行皮膚切口，切開后可見(jiàn)兩條面神經(jīng)分支，在兩根面神經(jīng)中間行肌肉切口，直達(dá)下頜骨骨面，鈍性分離后撐開肌肉，充分暴露下頜骨骨面，骨開窗位置位于第三磨牙下方，用小挖匙除下牙槽神經(jīng)表面皮質(zhì)骨，避免挖匙擠壓神經(jīng)造成損傷(圖1A)。暴露出的下牙槽神經(jīng)約5 mm，顯微剪剪斷神經(jīng)，10- 0縫線對(duì)接縫合。假手術(shù)組僅暴露出下牙槽神經(jīng)約5 mm，不剪斷。剪下5 mm神經(jīng)不縫合，超聲干預(yù)組則將暴露出的5 mm下牙槽神經(jīng)兩端全部剪下。用0.9%生理鹽水沖洗術(shù)區(qū)，拉攏肌肉進(jìn)行分層縫合，嚴(yán)密關(guān)閉切口。術(shù)后注射青霉素3 d。

低頻脈沖超聲干預(yù) 本研究各組能量密度值為20 mW/cm2，重復(fù)頻率固定為1 kHz。實(shí)驗(yàn)共分7組：空白組、假手術(shù)組、截?cái)嗌窠?jīng)縫合未超聲組、剪下5 mm神經(jīng)不縫合超聲組和3組不同的截?cái)嗌窠?jīng)縫合超聲組，其中截?cái)嗌窠?jīng)縫合超聲組根據(jù)超聲占空比不同分為3組：占空比20%的低頻脈沖超聲刺激組、占空比50%的低頻脈沖超聲刺激組以及占空比80%的低頻脈沖超聲刺激組。設(shè)立剪下5 mm神經(jīng)不縫合超聲組，神經(jīng)在術(shù)后4周內(nèi)無(wú)法愈合，可以以此判斷神經(jīng)在LIPUS促進(jìn)骨質(zhì)修復(fù)中的作用。每組樣本量相同(n=6)，超聲刺激時(shí)間為30 min/d，取材時(shí)間點(diǎn)設(shè)為術(shù)后4周。

感覺(jué)功能的恢復(fù)測(cè)試 參照Mai等[7]的方法于檢測(cè)前1周訓(xùn)練大鼠可以熟練的進(jìn)入一個(gè)黑色塑料籠，并將鼻子和嘴巴伸出洞口以便于檢測(cè)大鼠右側(cè)頦孔前部皮膚處的痛閾基礎(chǔ)值，于術(shù)后1 d、3 d、7 d、2周、4周每日超聲刺激前測(cè)大鼠痛閾值。共使用12根Von Frey纖維絲，刺激強(qiáng)度分別為：1、1.4、2、4、6、8、10、15、26、60、100、180 g；分別對(duì)應(yīng)型號(hào)為4.08、4.17、4.31、4.56、4.74、4.93、5.07、5.18、5.46、5.88、6.10、6.45的Von Frey纖維絲。大鼠自適應(yīng)環(huán)境15～30 min至安靜后，將Von-Frey纖維絲置于大鼠右側(cè)頦孔前部皮膚處，使纖維絲彎曲，持續(xù)時(shí)間1～2 s，間隔5 s，前后兩種不同刺激強(qiáng)度間隔至少10 min。最大機(jī)械刺激值為100 g，以恒定速度刺激，至大鼠出現(xiàn)縮頭反應(yīng)時(shí)，記錄閾值。分別測(cè)定5次，取平均值記為大鼠機(jī)械痛閾值(測(cè)量單位為g)。

顯微CT 術(shù)后4周取材，以腹腔注射過(guò)量10%水合氯醛法處死動(dòng)物，分離右側(cè)下頜骨。10%中性福爾馬林固定。所有標(biāo)本進(jìn)行顯微CT掃描分析，掃描參數(shù)為分辨率10 μm，電壓80 kV，電流100 μA。以第一磨牙根尖區(qū)牙槽中隔的骨小梁作為感興趣區(qū)，計(jì)算機(jī)進(jìn)行骨小梁微觀結(jié)構(gòu)相關(guān)參數(shù)的定量分析，包括骨密度(bone mineral density，BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume/tissue volume，BV/TV)和骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)。

組織學(xué)切片 術(shù)后4周取材，常規(guī)組織沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋，5 μm連續(xù)切片，HE、Masson以及免疫組織化學(xué)染色，光鏡觀察。

HE染色：切片置二甲苯中脫蠟。100%～95%～90%～80%的梯度酒精中脫水。雙蒸水洗5 min。蘇木素溶液中染色5 min，自來(lái)水沖洗5 min；1%鹽酸酒精分色5 d，自來(lái)水沖洗30 min；0.5%伊紅溶液中染色3 min，蒸餾水洗5 min；80%酒精溶液洗5 s；90%～95%～100%的梯度酒精中脫水。二甲苯中透明。樹膠封片，晾干。100倍鏡頭下隨機(jī)選取5個(gè)視野，記錄每個(gè)區(qū)域骨小梁面積，以百分率(%)表示。

Masson染色：先于37℃恒溫箱中，將切片放于二甲苯中脫蠟約20 min。依次用100%～95%～90%～80%的梯度酒精中脫水，37℃溫水清洗切片。蘇木精染液染核5～10 min，充分清洗，如果過(guò)染可用鹽酸酒精分化；蒸餾水沖洗后用麗春紅酸性復(fù)紅液然色5～10 min，2%冰醋酸浸洗片刻；1%磷鉬酸分化3～5 min，用苯胺藍(lán)或光綠液染5 min，再用0.2%冰醋酸浸洗片刻；90%～95%～100%的梯度酒精中脫水。二甲苯中透明。中性樹膠封片，晾干。100倍鏡頭下隨機(jī)選取5個(gè)視野，記錄每個(gè)區(qū)域新生骨面積，以百分率(%)表示。

免疫組織化學(xué)染色：石蠟切片脫蠟至水，PBS沖洗3次，每次3 min，3%H2O2孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加抗原修復(fù)液，37℃孵育15 min，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加血清封閉液，室溫孵育15 min，傾去，滴加兔抗CGRP抗體(1∶8000稀釋)，PBS作為陰性對(duì)照，4℃過(guò)夜；復(fù)溫5 min，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG，室溫孵育15 min，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加DAB顯色液，鏡下控制顯色時(shí)間，要求所有切片顯色時(shí)間相同；流水充分沖洗，蘇木素復(fù)染3 min，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，觀察拍照記錄。CGRP陽(yáng)性區(qū)域染成棕黃色或淡黃色，陰性區(qū)域無(wú)著色。400倍鏡頭下隨機(jī)取5個(gè)具有代表性的CGRP陽(yáng)性染色最密集區(qū)，記錄其中細(xì)胞染色強(qiáng)度，以陽(yáng)性細(xì)胞的百分率(%)表示。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)資料進(jìn)行分析。組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

大體觀察 術(shù)后所有動(dòng)物存活良好，飲食、行為、二便等均未發(fā)現(xiàn)異常，傷口早期局部可見(jiàn)軟組織紅腫和滲出，后期逐漸消退，未見(jiàn)化膿、傷口裂開等異常(圖1B)。

感覺(jué)功能的恢復(fù)測(cè)試結(jié)果 在第1天至第2周內(nèi)，空白組與假手術(shù)組的機(jī)械痛閾值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，剪下5 mm神經(jīng)不縫合超聲組的大鼠機(jī)械痛閾值較其余組均明顯升高，且一直持續(xù)到第4周(與空白組相比，1 d時(shí)t=4.145，P=0.002，3 d時(shí)t=4.132，P=0.002，7 d時(shí)t=4.118，P=0.002，14 d時(shí)t=4.088，P=0.002；與假手術(shù)組相比，1 d時(shí)t=3.836，P=0.003，3 d時(shí)t=3.857，P=0.003，7 d時(shí)t=3.659，P=0.004，14 d時(shí)t=3.539，P=0.004；與截?cái)嗌窠?jīng)縫合未超聲組相比，1 d時(shí)t=2.553，P=0.025，3 d時(shí)t=2.417，P=0.031，7 d時(shí)t=2.448，P=0.030，14 d時(shí)t=2.387，P=0.033；與占空比20%的低頻脈沖超聲刺激組相比，1 d時(shí)t=2.765，P=0.017，3 d時(shí)t=2.833，P=0.015，7 d時(shí)t=2.856，P=0.015，14 d時(shí)t=2.988，P=0.012；與占空比50%的低頻脈沖超聲刺激組相比，1 d時(shí)t=2.753，P=0.017，3 d時(shí)t=2.891，P=0.014，7 d時(shí)t=2.931，P=0.013，14 d時(shí)t=3.019，P=0.011；與占空比80%的低頻脈沖超聲刺激組相比，1 d時(shí)t=2.793，P=0.016，3 d時(shí)t=2.914，P=0.013，7 d時(shí)t=3.112，P=0.009，14 d時(shí)t=3.135，P=0.009)。截?cái)嗌窠?jīng)縫合未超聲組的大鼠機(jī)械痛閾值高于接受超聲刺激的大鼠，隨著占空比增高，機(jī)械痛閾值下降。至第4周，除剪下5 mm神經(jīng)不縫合超聲組外，其余各組間的大鼠機(jī)械痛閾值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(與空白組相比，假手術(shù)組t=0.837，P=0.268；截?cái)嗌窠?jīng)縫合未超聲組t=2.540，P=0.025；剪下5 mm神經(jīng)不縫合超聲組t=1.980，P=0.063；占空比20%的低頻脈沖超聲刺激組t=1.460，P=0.134；占空比50%的低頻脈沖超聲刺激組t=1.580，P=0.114；占空比80%的低頻脈沖超聲刺激組t=1.530，P=0.122)。在第2周時(shí)，3組占空比20%(t=0.985，P=0.233)、50%(t=1.178，P=0.190)、80%(t=1.210，P=0.183)的截?cái)嗌窠?jīng)超聲干預(yù)組與空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

A.頰側(cè)開窗，暴露下牙槽神經(jīng)(箭頭)；B.術(shù)后2周愈合情況

A. the exposed inferior alveolar nerve(arrow)through a buccal incision；B. postoperative healing after two weeks

圖 1 下牙槽神經(jīng)截?cái)嗍中g(shù)示意圖

Fig 1 Surgical access to inferior alveolar nerve

顯微CT結(jié)果 在第4周時(shí)占空比80%的低頻脈沖超聲刺激組的BMD、BV/TV和Tb.Th與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(BMD：t=0.945，P=0.243；BV/TV：t=1.412，P=0.143；Tb.Th：t=1.460，P=0.134)，除占空比80%的低頻脈沖超聲刺激組外，截?cái)嗌窠?jīng)一側(cè)的BMD、BV/TV和Tb.Th與空白組比較均顯著降低(截?cái)嗌窠?jīng)縫合未超聲組BMD：t=2.620，P=0.021，BV/TV：t=2.756，P=0.017，Tb.Th：t=2.420，P=0.030；剪下5 mm神經(jīng)不縫合超聲組BMD：t=2.528，P=0.025，BV/TV：t=2.640，P=0.021，Tb.Th：t=2.328，P=0.036；占空比20%的低頻脈沖超聲刺激組BMD：t=2.383，P=0.033，BV/TV：t=2.376，P=0.033，Tb.Th：t=2.333，P=0.036；占空比50%的低頻脈沖超聲刺激組BMD：t=2.389，P=0.032，BV/TV：t=2.423，P=0.030，Tb.Th：t=2.230，P=0.042)。3組截?cái)嗌窠?jīng)超聲組實(shí)驗(yàn)側(cè)的BMD、BV/TV和Tb.Th較截?cái)嗌窠?jīng)未超聲組有所恢復(fù)，且隨著占空比增大，恢復(fù)效果增加。此外，剪下5 mm神經(jīng)不縫合超聲組和截?cái)嗌窠?jīng)縫合未超聲組的BMD、BV/TV和Tb.Th差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(BMD：t=1.251，P=0.175；BV/TV：t=1.372，P=0.151；Tb.Th：t=1.325，P=0.160)(圖3)。

HE染色結(jié)果 第4周時(shí)，截?cái)嗌窠?jīng)縫合未超聲組(t=2.550，P=0.024)和剪下5 mm神經(jīng)不縫合超聲組(t=2.280，P=0.038)與空白組比較，骨小梁數(shù)目均降低，連續(xù)性中斷，骨髓腔變大，骨小梁寬度降低。截?cái)嗌窠?jīng)超聲組實(shí)驗(yàn)側(cè)骨小梁連續(xù)性有所恢復(fù)，且隨著占空比增大，恢復(fù)效果增加(與空白組比較，占空比20%的低頻脈沖超聲刺激組t=2.258，P=0.040；占空比50%的低頻脈沖超聲刺激組t=2.320，P=0.036；占空比80%的低頻脈沖超聲刺激組t=1.800，P=0.083)(圖4)。

LIPUS：低頻脈沖超聲；Ⅰ組：空白組；Ⅱ組：假手術(shù)組；Ⅲ組：截?cái)嗌窠?jīng)縫合未超聲組；Ⅳ組：剪下5 mm神經(jīng)不縫合超聲組；Ⅴ組：占空比20%的低頻脈沖超聲刺激組；Ⅵ組：占空比50%的低頻脈沖超聲刺激組；Ⅶ組：占空比80%的低頻脈沖超聲刺激組；與Ⅰ組相比，aP<0.05；與Ⅲ組相比，bP<0.05；與Ⅴ組相比，cP<0.05

LIPUS：low-intensity pulsed ultrasound；Ⅰ group：control group；Ⅱ group：sham group；Ⅲ group：nerve sutured but not treated with LIPUS group；Ⅳ group：5 mm nerve transected and treated with LIPUS group；Ⅴ group：LIPUS with 20% duty ratio group；Ⅵ group：LIPUS with 50% duty ratio group；Ⅶ group：LIPUS with 80% duty ratio group；aP<0.05 compared with Ⅰ group；bP<0.05 compared with Ⅲ group；cP<0.05 compared with Ⅴ group

圖 2 大鼠截?cái)嘞卵啦凵窠?jīng)LIPUS干預(yù)后頦孔前皮膚機(jī)械痛閾值的變化

Fig 2 Changes in mechanical threshold of the facial skin above the mental foramen following inferior alveolar nerve transaction in rats treated with LIPUS

BMD：骨密度；BV/TV：骨體積分?jǐn)?shù)；Tb.Th：骨小梁厚度；Ⅰ組：空白組；Ⅱ組：假手術(shù)組；Ⅲ組：截?cái)嗌窠?jīng)縫合未超聲組；Ⅳ組：剪下5 mm神經(jīng)不縫合超聲組；Ⅴ組：占空比20%的低頻脈沖超聲刺激組；Ⅵ組：占空比50%的低頻脈沖超聲刺激組；Ⅶ組：占空比80%的低頻脈沖超聲刺激組；與Ⅰ組相比，aP<0.05；與Ⅲ組相比，bP<0.05

BMD：bone mineral density；BV/TV：bone volume/tissue volume；Tb.Th：trabecular thickness；Ⅰ group：control group；Ⅱ group：sham group；Ⅲ group：nerve sutured but not treated with LIPUS group；Ⅳ group：5 mm nerve transected and treated with LIPUS group；Ⅴ group：LIPUS with 20% duty ratio group；Ⅵ group：LIPUS with 50% duty ratio group；Ⅶ group：LIPUS with 80% duty ratio group；aP<0.05 compared with Ⅰ group；bP<0.05 compared with Ⅲ group

A.顯微CT感興趣區(qū)；B.顯微CT BMD分析；C.顯微CT BV/TV分析；D.顯微CT Tb.Th分析

A. micro-CT region of interest；B. micro-CT BMD analysis；C. micro-CT BV/TV analysis；D：micro-CT Tb.Th analysis

圖 3 顯微CT分析結(jié)果

Fig 3 Results of micro-CT analysis

Masson染色結(jié)果 在Masson染色中，藍(lán)色區(qū)域代表膠原纖維與未完全礦化的新生骨，紅色區(qū)域代表膠原蛋白較多、礦化程度高的骨。截?cái)嗌窠?jīng)縫合未超聲組(t=2.830，P=0.015)和剪下5 mm神經(jīng)不縫合超聲組(t=2.750，P=0.017)大鼠新生骨區(qū)域減少，藍(lán)色區(qū)域較少。截?cái)嗌窠?jīng)超聲組實(shí)驗(yàn)側(cè)骨礦化區(qū)域較截?cái)嗌窠?jīng)未超聲組有所恢復(fù)，且隨著占空比增大，藍(lán)色區(qū)域增加(與空白組比較，占空比20%的低頻脈沖超聲刺激組：t=2.780，P=0.016；占空比50%的低頻脈沖超聲刺激組：t=2.620，P=0.021；占空比80%的低頻脈沖超聲刺激組：t=2.100，P=0.052)。在第4周時(shí)，占空比80%的低頻脈沖超聲刺激組實(shí)驗(yàn)側(cè)新生骨區(qū)域接近空白組和假手術(shù)組(圖5)。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 CGRP免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性纖維表現(xiàn)為棕黃色。CGRP陽(yáng)性纖維在切牙根周圍骨髓腔內(nèi)大量分布，陽(yáng)性染色程度較深，橫斷面觀呈致密多孔狀。神經(jīng)截?cái)?周時(shí)，與空白組和假手術(shù)組比較，剪下5 mm神經(jīng)不縫合超聲組神經(jīng)明顯退化，呈脫水狀。截?cái)嗌窠?jīng)未超聲組(t=2.317，P=0.036)陽(yáng)性染色程度明顯降低，神經(jīng)橫斷面成不規(guī)則形狀。超聲組可觀察到神經(jīng)分布，與空白組間的差異縮小，隨著占空比增大，陽(yáng)性染色程度加深(與空白組比較，占空比20%的低頻脈沖超聲刺激組：t=2.760，P=0.017；占空比50%的低頻脈沖超聲刺激組：t=2.480，P=0.027；占空比80%的低頻脈沖超聲刺激組：t=1.810，P=0.081)。雖然占空比80%的低頻脈沖超聲刺激組的陽(yáng)性染色程度接近空白組，但神經(jīng)橫斷面呈空泡狀不良恢復(fù)(圖6)。

箭頭：骨小梁；Ⅰ組：空白組；Ⅱ組：假手術(shù)組；Ⅲ組：截?cái)嗌窠?jīng)縫合未超聲組；Ⅳ組：剪下5 mm神經(jīng)不縫合超聲組；Ⅴ組：占空比20%的低頻脈沖超聲刺激組；Ⅵ組：占空比50%的低頻脈沖超聲刺激組；Ⅶ組：占空比80%的低頻脈沖超聲刺激組；與Ⅰ組相比，aP<0.05；與Ⅲ組相比，bP<0.05

arrows:trabeculae;Ⅰ group：control group；Ⅱ group：sham group；Ⅲ group：nerve sutured but not treated with LIPUS group；Ⅳ group：5 mm nerve transected and treated with LIPUS group；Ⅴ group：LIPUS with 20% duty ratio group；Ⅵ group：LIPUS with 50% duty ratio group；Ⅶ group：LIPUS with 80% duty ratio group；aP<0.05 compared with Ⅰ group；bP<0.05 compared with Ⅲ group

A.空白組；B.假手術(shù)組；C.截?cái)嗌窠?jīng)縫合未超聲組；D. 剪下5 mm神經(jīng)不縫合超聲組；E. 占空比20%的低頻脈沖超聲刺激組；F.占空比50%的低頻脈沖超聲刺激組；G. 占空比80%的低頻脈沖超聲刺激組；H.4周時(shí)骨小梁面積定量分析

A. control group；B. sham group；C. nerve sutured but not treated with LIPUS group；D. 5 mm nerve transected and treated with LIPUS group；E. LIPUS with 20% duty ratio group；F. LIPUS with 50% duty ratio group；G. LIPUS with 80% duty ratio group；H. the quantitative analysis of trabecular bone area at 4 weeks

圖 4 HE染色觀察下牙槽神經(jīng)管附近的骨小梁(×100)

Fig 4 HE staining of the trabeculae near inferior alveolar nerve(×100)

Ⅰ組：空白組；Ⅱ組：假手術(shù)組；Ⅲ組：截?cái)嗌窠?jīng)縫合未超聲組；Ⅳ組：剪下5 mm神經(jīng)不縫合超聲組；Ⅴ組：占空比20%的低頻脈沖超聲刺激組；Ⅵ組：占空比50%的低頻脈沖超聲刺激組；Ⅶ組：占空比80%的低頻脈沖超聲刺激組；與Ⅰ組相比，aP<0.05；與Ⅲ組相比，bP<0.05

Ⅰ group：control group；Ⅱ group：sham group；Ⅲ group：nerve sutured but not treated with LIPUS group；Ⅳ group：5 mm nerve transected and treated with LIPUS group；Ⅴ group：LIPUS with 20% duty ratio group；Ⅵ group：LIPUS with 50% duty ratio group；Ⅶ group：LIPUS with 80% duty ratio group；aP<0.05 compared with Ⅰ group；bP<0.05 compared with Ⅲ group

A.空白組；B.假手術(shù)組；C.截?cái)嗌窠?jīng)縫合未超聲組；D. 剪下5 mm神經(jīng)不縫合超聲組；E. 占空比20%的低頻脈沖超聲刺激組；F. 占空比50%的低頻脈沖超聲刺激組；G. 占空比80%的低頻脈沖超聲刺激組；H.4周時(shí)新生骨區(qū)域定量分析

A. control group；B. sham group；C. nerve sutured but not treated with LIPUS group；D. 5 mm nerve transected and treated with LIPUS group；E. LIPUS with 20% duty ratio group；F. LIPUS with 50% duty ratio group；G. LIPUS with 80% duty ratio group；H. the quantitative analysis of new bone area at 4 weeks

圖 5 Masson染色觀察新生骨區(qū)域(藍(lán)色)(×100)

Fig 5 Masson staining of the new bone area(blue)(×100)

CGRP：降鈣素基因相關(guān)肽；Ⅰ組：空白組；Ⅱ組：假手術(shù)組；Ⅲ組：截?cái)嗌窠?jīng)縫合未超聲組；Ⅳ組：剪下5 mm神經(jīng)不縫合超聲組；Ⅴ組：占空比20%的低頻脈沖超聲刺激組；Ⅵ組：占空比50%的低頻脈沖超聲刺激組；Ⅶ組：占空比80%的低頻脈沖超聲刺激組；與Ⅰ組相比，aP<0.05；與Ⅲ組相比，bP<0.05

CGRP：calcitonin gene related peptide；Ⅰ group：control group；Ⅱ group：sham group；Ⅲ group：nerve sutured but not treated with LIPUS group；Ⅳ group：5 mm nerve transected and treated with LIPUS group；Ⅴ group：LIPUS with 20% duty ratio group；Ⅵ group：LIPUS with 50% duty ratio group；Ⅶ group：LIPUS with 80% duty ratio group；aP<0.05 compared with Ⅰ group；bP<0.05 compared with Ⅲ group

A.空白組；B.假手術(shù)組；C.截?cái)嗌窠?jīng)縫合未超聲組；D. 剪下5 mm神經(jīng)不縫合超聲組；E. 占空比20%的低頻脈沖超聲刺激組；F. 占空比50%的低頻脈沖超聲刺激組；G. 占空比80%的低頻脈沖超聲刺激組；H.4周時(shí)CGRP染色陽(yáng)性率定量分析

A. control group；B. sham group；C. nerve sutured but not treated with LIPUS group；D. 5 mm nerve transected and treated with LIPUS group；E. LIPUS with 20% duty ratio group；F. LIPUS with 50% duty ratio group；G. LIPUS with 80% duty ratio group；H. the quantitative analysis of CGRP staining(+) at 4 weeks

圖 6 CGRP免疫組織化學(xué)染色觀察骨髓腔內(nèi)的CGRP陽(yáng)性纖維(×200)

Fig 6 Immunohistochemical staining of the CGRP (+) nerve fibers in the marrow cavity(×200)

討 論

LIPUS作為骨折修復(fù)的治療手段已廣泛應(yīng)用于臨床[5，12]，但文獻(xiàn)多基于單純骨組織損傷修復(fù)的基礎(chǔ)研究[6]。近年LIPUS開始應(yīng)用于單純神經(jīng)損傷的修復(fù)。Raso等[13]使用大鼠坐骨神經(jīng)壓傷模型，發(fā)現(xiàn)每日應(yīng)用LIPUS可改善修復(fù)后的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)，提高修復(fù)后的神經(jīng)纖維密度。Chang等[14]使用聚乳酸-羥基乙酸共聚物可吸收材料植入大鼠坐骨神經(jīng)節(jié)段缺損處，同時(shí)施加LIPUS，發(fā)現(xiàn)可增加修復(fù)組織中的神經(jīng)軸突數(shù)量和面積。但對(duì)于采用LIPUS改善因神經(jīng)損傷導(dǎo)致骨改變的研究罕見(jiàn)報(bào)道。2012年，Lam等[15]報(bào)道LIPUS在坐骨神經(jīng)切除的大鼠腿部不能促進(jìn)脛骨骨折的愈合，而神經(jīng)存在時(shí)超聲組則表現(xiàn)出更快更成熟的愈合，表明完整的神經(jīng)分布在LIPUS促進(jìn)骨折愈合中發(fā)揮重要作用。本研究探討了采用LIPUS對(duì)頜骨神經(jīng)損傷導(dǎo)致骨組織密度降低的影響，并篩選出LIPUS有效修復(fù)、改善骨組織結(jié)構(gòu)的最佳劑量和療程時(shí)間，即每日30 min/次的LIPUS刺激4周可以顯著促進(jìn)由神經(jīng)損傷導(dǎo)致的骨質(zhì)損傷修復(fù)。

本研究觀察到第2周時(shí)，截?cái)嗌窠?jīng)超聲組的神經(jīng)功能與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但對(duì)于缺乏神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)的骨組織，如研究中截?cái)? mm神經(jīng)不縫合采用超聲干預(yù)，LIPUS對(duì)骨質(zhì)恢復(fù)的作用并不明顯。但截?cái)嗌窠?jīng)縫合并采用超聲干預(yù)4周后，顯微CT和骨組織學(xué)觀察結(jié)果顯示骨質(zhì)損傷修復(fù)速度更快、效果更佳，表現(xiàn)為骨小梁厚度、連續(xù)性及骨礦化區(qū)域明顯增加，且觀察到更多CGRP陽(yáng)性纖維，表明神經(jīng)的存在對(duì)于骨穩(wěn)態(tài)的維持具有重要的促進(jìn)作用。

由于受測(cè)試者本身主觀性影響及檢測(cè)方法的不同都會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此客觀、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)外周神經(jīng)的修復(fù)是比較困難的。大部分關(guān)于外周神經(jīng)修復(fù)再生的研究是基于病理切片或者電鏡觀察，但這類結(jié)果并不能說(shuō)明神經(jīng)功能的實(shí)際恢復(fù)情況。Von Frey纖維絲通過(guò)測(cè)定機(jī)械性痛覺(jué)超敏評(píng)定大鼠疼痛狀況，廣泛用于腳部[16]、頦前區(qū)[7]以及三叉神經(jīng)處[17]疼痛的測(cè)定。本研究獲得了相對(duì)準(zhǔn)確、重復(fù)性強(qiáng)的測(cè)量下牙槽神經(jīng)功能恢復(fù)的檢測(cè)方法，可對(duì)神經(jīng)的恢復(fù)情況進(jìn)行直觀的觀察判斷。

本課題組前期通過(guò)手術(shù)失感覺(jué)神經(jīng)研究了生理情況下神經(jīng)對(duì)骨生長(zhǎng)的影響，證實(shí)在神經(jīng)損傷后骨結(jié)構(gòu)確有一定程度的損傷，顯微CT及組織學(xué)切片結(jié)果表現(xiàn)為骨密度降低，骨小梁連續(xù)性下降，骨形成速率降低，CGRP陽(yáng)性纖維數(shù)量降低[3]。本研究進(jìn)一步探究LIPUS對(duì)于下牙槽神經(jīng)損傷導(dǎo)致的下頜骨改變的影響，發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)縫合后的超聲組表現(xiàn)出明顯的骨結(jié)構(gòu)恢復(fù)，而且觀察到更多CGRP陽(yáng)性纖維，證實(shí)LIPUS不僅對(duì)脛骨這類長(zhǎng)骨具有一定的促進(jìn)修復(fù)作用，對(duì)下頜骨這類扁骨也具有同樣影響。CGRP作為一種重要的感覺(jué)神經(jīng)肽，在骨形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[18]。在骨代謝活躍的區(qū)域，CGRP陽(yáng)性纖維分布密度增高。CGRP陽(yáng)性纖維的存在間接反映了感覺(jué)神經(jīng)的恢復(fù)情況，以及感覺(jué)神經(jīng)以神經(jīng)肽為媒介在調(diào)控骨代謝中的作用。

LIPUS自身各項(xiàng)參數(shù)，如能量密度[10]、占空比[11]等的設(shè)定已被證實(shí)對(duì)生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮均有影響。Jiang等[8]研究顯示不同能量密度的LIPUS在自體神經(jīng)移植中軸突再生的速率也不同。進(jìn)一步提示若神經(jīng)再生速率不同，骨組織受到神經(jīng)的作用效果可能也會(huì)有影響。本研究在能量密度一定的條件下，設(shè)立3種不同占空比，發(fā)現(xiàn)占空比愈大，骨質(zhì)恢復(fù)效果愈明顯，可能也是由于不同占空比對(duì)神經(jīng)具有不同的作用效果進(jìn)而影響了骨組織。進(jìn)一步表明不同參數(shù)的LIPUS對(duì)于下牙槽神經(jīng)損傷導(dǎo)致的下頜骨病理改變的修復(fù)具有不同的作用，提示正確選擇LIPUS參數(shù)的重要性。

綜上，本研究LIPUS可以顯著促進(jìn)由神經(jīng)損傷導(dǎo)致的骨質(zhì)損傷修復(fù)，且在能量密度一定的條件下，占空比愈大，恢復(fù)效果愈明顯，但只發(fā)生在神經(jīng)可愈合的情況下，當(dāng)神經(jīng)無(wú)法愈合時(shí)，LIPUS并不能促進(jìn)下頜骨病理改變的修復(fù)。目前LIPUS在促進(jìn)神經(jīng)與骨穩(wěn)態(tài)平衡中的作用機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步對(duì)其機(jī)制進(jìn)行相關(guān)探索。

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Effect of Low-intensity Pulsed Ultrasound on the Mandibular Remodeling Following Inferior Alveolar Nerve Transection

YANG Bo，WU Qingqing，ZHANG Liang，GUO Yanjun，GONG Ping

State Key Laboratory of Oral Disease，West China School of Stomatology， Department of Oral Implantology，West China Hospital of Stomatology，Sichuan University，Chengdu 610041，China

Corresponding author：GONG Ping Tel：028- 85501427，E-mail：gp602002@163.com

Objective To investigate the effects of low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) on the mandibular remodeling following inferior alveolar nerve transection (IANX) and to optimize the parameters of LIPUS in the treatment of nerve injury. Methods IANX was performed in male Sprague-Dawley rats. Four weeks after IANX，the effect of daily LIPUS (from day 1) on the transected inferior alveolar nerve was examined in terms of sensitivity to mechanical stimulation. Moreover，histopathologic changes of mandibles were analyzed by micro-CT，HE staining，Masson trichrome staining，and immunohistochemical staining. Results LIPUS promoted the recovery of inferior alveolar nerve injury after transection. HE staining displayed the improvement of trabecular thickness and continuity. LIPUS with higher duty ratios had more obvious effect on bone remodeling. Conclusion LIPUS promotes the mandibular remodeling following IANX.

low-intensity pulsed ultrasound；inferior alveolar nerve；mandibular

國(guó)家自然科學(xué)基金(81571008、81500895) Supported by the National Nature Sciences Fundation of China (81571008，81500895)

宮 蘋 電話：028- 85501427，電子郵件：gp602002@163.com

R782.4

A

1000- 503X(2017)02- 0215- 10

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.02.009

2016- 12- 25)