利奈唑胺耐藥糞腸球菌感染患者臨床分離株與定植株同源性分析

蒲彰雅, 余治健, 陳 重, 鄧向斌, 白 冰, 李多云, 劉曉軍, 韓雪瑩, 林佛君, 鄧啟文

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院 深圳市內(nèi)源性感染診治研究重點實驗室，廣東 深圳 518052)

·論著·

利奈唑胺耐藥糞腸球菌感染患者臨床分離株與定植株同源性分析

蒲彰雅, 余治健, 陳 重, 鄧向斌, 白 冰, 李多云, 劉曉軍, 韓雪瑩, 林佛君, 鄧啟文

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院 深圳市內(nèi)源性感染診治研究重點實驗室，廣東 深圳 518052)

目的 研究1例患者體內(nèi)利奈唑胺(LZD)耐藥糞腸球菌臨床分離株與定植株同源性特點。方法 對1例肺部感染患者分離的10株糞腸球菌(其中2株分離自尿標本，8株分離自糞便標本)進行細菌耐藥分析，并通過脈沖場凝膠電泳(PFGE)確定糞腸球菌之間的同源性。結(jié)果 患者進行LZD治療前后，尿標本分離出的2株糞腸球菌均為LZD耐藥株(MIC值分別為8 mg/mL，16 mg/mL)，糞便中培養(yǎng)挑取的8株(治療前6株，治療后2株)，其中LZD敏感4株，中介2株，耐藥2株(MIC值波動在0.25～12 mg/mL)。通過PFGE分型檢測提示10株糞腸球菌具有同源性。結(jié)論 該例患者泌尿道和腸道檢出的糞腸球菌具有同源性，提示LZD耐藥腸球菌可能長期定植于患者體內(nèi)，并可能發(fā)生移位導(dǎo)致耐藥細菌感染。

利奈唑胺； 糞腸球菌； 臨床耐藥； 定植； 同源性

[Chin J Infect Control，2017，16(4)：343-345，350]

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis,E.faecalis)廣泛分布在自然界，常棲居在人、動物的腸道和女性生殖道，是常見的一種條件致病菌。近年來隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，不斷有臨床耐藥菌株出現(xiàn)，尤其是耐萬古霉素腸球菌(vancomycin-resistantEnterococccu, VRE)等多重耐藥菌株的報道不斷增多，已經(jīng)成為社區(qū)獲得性感染和醫(yī)院感染的主要病原體之一[1]。利奈唑胺(linezolid, LZD)是第一種應(yīng)用于臨床的口惡唑烷酮類抗生素，由于全新的分子結(jié)構(gòu)和獨特的抗菌機制，使其對包括VRE在內(nèi)的大多數(shù)革蘭陽性菌所致的感染具有較好的治療作用，但隨著LZD在臨床上的應(yīng)用，其耐藥問題也逐漸出現(xiàn)，國內(nèi)外不斷有關(guān)于LZD耐藥腸球菌的個例甚至是醫(yī)院感染暴發(fā)的報道，多發(fā)生在暴露于利奈唑胺治療以及延長療程的患者中[2-4]。目前鮮有關(guān)于無LZD治療史患者檢出利奈唑胺耐藥菌株的報道，對于這些患者其臨床分離菌株與定植于患者體內(nèi)菌株的同源性和突變規(guī)律有待進一步明確。本研究從1例從未使用過LZD的肺炎患者臨床尿標本中分離出LZD耐藥腸球菌，繼之分別從尿和糞便中分離出多株LZD不敏感糞腸球菌，并通過脈沖場凝膠電泳(PFGE)進行同源性分析，初步探討利奈唑胺耐藥糞腸球菌的臨床分離株與定植株的同源性。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 1例肺部感染患者檢出的10株糞腸球菌，其中2株分離自尿標本，8株分離自糞便標本。

1.2 儀器和試劑 糞腸球菌質(zhì)控株ATCC 29212購自廣東省臨床檢驗中心，利奈唑胺耐藥糞腸球菌標準株DENG 1(我科分離保存，Genebank 序列號 CP004081)和沙門菌h9812(我院微生物室保存)作為對照菌株，VITEK 2 compact全自動微生物分析儀(法國生物梅里埃公司)，CTCA培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，LZD為美國Pfizer公司產(chǎn)品，LZD E-test 條為法國梅里埃公司產(chǎn)品，細菌DNA提取試劑盒 QIAamp DNA Mini kit 為德國QIAGEN公司產(chǎn)品。

1.3 菌種鑒定和藥敏試驗 對于分離的菌株采用法國生物梅里埃VITEK 2 compact全自動微生物分析儀及配套的鑒定卡進行菌種的鑒定，菌株LZD的藥敏試驗通過E-test 測定，嚴格按照說明書進行操作。依據(jù)2013年版美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)標準進行利奈唑胺的耐藥結(jié)果判定[5]。糞腸球菌ATCC 29212為質(zhì)控菌株。

1.4 細菌基因組DNA提取和PFGE 患者分離的糞腸球菌Ying 0-9，其菌株的基因組DNA采用SmaI酶消化法通過PFGE確定糞腸球菌菌株之間的同源性[6]。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離過程 共分離糞腸球菌10株(其中來源于尿2株，糞便8株)?；颊邽?例64歲老年女性，于2015年8月診斷為肺部感染入院治療，入院前從未使用過利奈唑胺藥物治療。2015年9月16日在治療肺部感染過程中取患者尿標本，從中分離出1株LZD耐藥的糞腸球菌(Ying 0)。2015年10月3日患者因左側(cè)化膿性頜下腺炎調(diào)整為利奈唑胺(600 mg 靜脈注射 q12h)抗感染治療11 d，治療前取糞便標本采用腸球菌選擇性無抗和含有2 mg/mL LZD的CTCA培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑取敏感、中介和耐藥糞腸球菌共6株(其中Ying 1-3從無抗平板挑取，Ying 4-6從含LZD平板挑取)。2015年10月21日LZD治療結(jié)束后再次從尿中分離出1株利奈唑胺耐藥糞腸球菌(Ying 7)，同時取糞便按照同樣方法培養(yǎng)，分離出糞腸球菌株Ying 8(無抗CTCA平板分離) 和Ying 9(含LZD的CTCA平板分離)。

2.2 細菌耐藥及同源性分析 在使用LZD治療前后，尿標本分離的Ying 0和Ying 7，藥敏試驗提示均為利奈唑胺耐藥菌株，同時對環(huán)丙沙星、頭孢西丁、妥布霉素、呋西地酸、慶大霉素(高濃度)、四環(huán)素、復(fù)方磺胺甲口惡唑、利福平、奎奴普丁/達福普汀等耐藥，但對呋喃妥因、氨芐西林、萬古霉素、替考拉寧敏感，且LZD治療后耐藥菌株的MIC值明顯升高，MIC值分別為8 mg/mL和16 mg/mL。在使用LZD前糞便培養(yǎng)分離的Ying 1-6，其中3株敏感，2株中介，1株耐藥，MIC值波動在0.25～12 mg/mL；菌株Ying 8-9，在LZD治療結(jié)束5 d后糞便培養(yǎng)分離，1株敏感，1株耐藥(MIC值為12 mg/mL)，10株菌株通過PFGE分型檢測具有高度同源性，見圖1。提示該患者尿標本檢出的LZD不敏感菌株可能是腸道細菌移位所致，并長期定植于體內(nèi)。

注：LZD檢測MIC值結(jié)果，其中S為H9812標準株，ATCC 29212為糞腸球菌質(zhì)控株，Deng 為我科分離保存利奈唑胺耐藥糞腸球菌Deng 1，0-9 代表糞腸球菌株Ying 0-9

圖1 患者尿和糞便標本分離的10株糞腸球菌PFGE圖

Figure 1 PFGE mapping of 10 strains ofE.faecalisisolated from urine and stool specimens

3 討論

利奈唑胺屬于完全人工合成的口惡唑烷酮類抗生素，不存在利奈唑胺耐藥的天然儲備庫，該藥主要通過與細菌50S亞基23S rRNAV區(qū)結(jié)合，阻止mRNA與核糖體結(jié)合抑制細菌蛋白質(zhì)的合成從而產(chǎn)生抗菌作用[7]。糞腸球菌有4個拷貝23S rRNA基因，屎腸球菌有6個23S rRNA拷貝基因數(shù)，曾經(jīng)一度認為這種復(fù)雜的基因結(jié)構(gòu)形式很難出現(xiàn)利奈唑胺耐藥的腸球菌，但是,隨著LZD在臨床上應(yīng)用的日益廣泛，不斷有LZD耐藥腸球菌的報道出現(xiàn)，甚至是小范圍內(nèi)的醫(yī)院感染暴發(fā)，多發(fā)生有LZD暴露史在抗菌藥物選擇壓力下出現(xiàn)，尤其是患者既往有廣譜抗菌藥物使用史、免疫抑制、基礎(chǔ)疾病、器官移植、侵入性置管等情況下更易造成LZD耐藥菌株的出現(xiàn)，既往研究表明，細菌耐LZD作用機制主要由于下面幾個方面：細菌23S rRNA V區(qū)基因的點突變；編碼核糖體蛋白L3和L4蛋白氨基酸變異；多耐藥基因Cfr基因的獲得[3, 8]。

目前研究多集中于臨床分離LZD耐藥致病菌株的耐藥機制研究，對于既往無LZD暴露史，長期定植于患者體內(nèi)的耐藥菌株的定植規(guī)律及耐藥機制的相關(guān)報道較少。學(xué)者Marra AR等[9]曾報道1例呼吸機相關(guān)肺炎銅綠假單胞菌感染患者的中心靜脈置管中分離出1株LZD耐藥糞腸球菌，既往無LZD用藥史，同時期無醫(yī)院內(nèi)多重耐藥菌株的傳播，考慮其為定植菌株，并未予以特殊治療，但其耐藥機制并未進一步闡明。該院也曾從1例反復(fù)發(fā)作肺炎(1年內(nèi)反復(fù)發(fā)作5次)的急性白血病患者的氣管分泌物中分離出LZD不敏感糞腸球菌10株，其1年前曾因革蘭陽性菌感染接受LZD治療，之后未有LZD暴露史，通過PFGE分型提示高度同源性，基因測序顯示23S rRNA V區(qū) 存在G2424U、G2576U突變[10]。本例患者從未使用LZD治療，但是從尿和糞便標本中同時分離出LZD不敏感菌株，在LZD治療后，不敏感菌株的MIC值明顯升高，PFGE分型檢測提示高度同源。這些數(shù)據(jù)表明LZD不敏感菌株可長期定植于患者體內(nèi)，在一定條件下發(fā)生移位導(dǎo)致感染發(fā)生并在藥物選擇性壓力下出現(xiàn)高水平耐藥可能?；颊呔哂蠰ZD耐藥菌的定植可以使用LZD進行治療，該患者在LZD治療后泌尿道和腸道的LZD耐藥菌負荷均顯著下降，但耐藥定植菌對臨床結(jié)局的影響程度有待進一步研究。對于從無LZD接觸史的患者體內(nèi)檢出定植的LZD不敏感菌株，其定植規(guī)律有待進一步闡述，以及是否存在現(xiàn)有耐藥機制無法解釋的新的耐藥特點需要更多的研究資料證實。

目前腸球菌耐藥現(xiàn)象日益嚴峻，一個重要的原因在于抗菌藥物的不合理使用，LZD已成為治療包括VRE在內(nèi)的難治性革蘭陽性菌感染和控制醫(yī)院感染的理想藥物，關(guān)注細菌對LZD的定植規(guī)律和耐藥機制有助于延長抗菌藥物的使用壽命。本研究初步揭示了既往無LZD暴露史的患者體內(nèi)LZD不敏感菌株的同源性特點，提示臨床工作中需要密切關(guān)注LZD不敏感菌株的定植情況和MIC值動態(tài)變化，防止不恰當(dāng)?shù)氖褂迷斐赡退幘甑倪x擇移位及醫(yī)院感染的暴發(fā)。

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(本文編輯：陳玉華)

Homology analysis of clinically isolated and colonized linezolid-resistantEnterococcusfaecalisstrains from a patient

PUZhang-ya,YUZhi-jian,CHENZhong,DENGXiang-bin,BAIBing,LIDuo-yun,LIUXiao-jun,HANXue-ying,LINFo-jun,DENGQi-wen

(ShenzhenKeyLaboratoryforEndogenousInfection,TheAffiliatedShenzhenNanshanPeople’sHospitalofGuangdongMedicalUniversity,Shenzhen518052,China)

Objective To study the homology characteristics of clinicaly isolated and colonized linezolid(LZD)-resistantEnterococcusfaecalis(E.faecalis) strains from a patient.Methods TenE.faecalisstrains (2 were isolated from urine specimens and 8 were from stool specimens) isolated from a patient with pulmonary infection were performed antimicrobial susceptibility testing, homology ofE.faecaliswas determined by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE).Results Before and after patients received LZD therapy, 2E.faecalisstrains isolated form urine specimens were both resistant to LZD (MICs: 8 mg/mL, 16 mg/mL, respectively), among 8 strains from stool specimens (6 were isolated before therapy, and 2 were isolated after therapy), LZD susceptible, intermediate, and resistant strains were 4, 2, and 2 respectively(MICs: 0.25-12 mg/mL). 10 strains ofE.faecaliswere homologous by PFGE typing. Conclusion In this case, the detection ofE.faecalisfrom urinary tract and intestinal tract is homologous, which suggested that LZD-resistantEnterococcusmay be colonized in vivo for a long time, and may be shift to cause bacterial infection.

linezolid;Enterococcusfaecalis; clinical resistance; colonization; homology

2016-05-24

深圳市科技創(chuàng)新委基礎(chǔ)研究基金項目(JCYJ20150402152130173)；深圳市南山區(qū)科技項目(2015019，2015022)

蒲彰雅(1989-)，女(瑤族)，湖南省懷化市人，碩士研究生，主要從事細菌耐藥性研究。

鄧啟文 E-mail:qiwendeng@hotmail.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.04.013

R378.1

A

1671-9638(2017)04-0343-04