微生態(tài)發(fā)酵床功能菌株產(chǎn)孢條件的優(yōu)化

秦艷梅+張愛民

摘要：發(fā)酵床養(yǎng)殖技術(shù)是依據(jù)微生物學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、生態(tài)學(xué)、空氣動力學(xué)等原理，利用特有活性的功能微生物復(fù)合菌群，持續(xù)、穩(wěn)定地將動物的糞尿廢棄物轉(zhuǎn)化為多種營養(yǎng)物質(zhì)與能量，實現(xiàn)糞尿完全降解的無污染、零排放目標的一種新環(huán)保型養(yǎng)殖模式。其中高轉(zhuǎn)化率微生物菌株起著重要作用。對豬排泄物具有除臭功能的枯草芽孢桿菌N43進行發(fā)酵條件研究，通過單因素試驗對培養(yǎng)基成分進行篩選，利用響應(yīng)面分析法（response surface methodology，簡稱RSM）和Box-Benhnken中心組合試驗建立數(shù)學(xué)模型，確定該菌株最佳培養(yǎng)基濃度為玉米粉0.5%、大豆餅粉2.5%、FeSO4 05%、MgSO4 0.05%，最佳培養(yǎng)條件為pH值7.5、種齡20 h、裝量30 mL/250 mL，芽孢生成率為95%。

關(guān)鍵詞：微生態(tài)發(fā)酵床；功能菌株；產(chǎn)孢條件；發(fā)酵工藝；培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件；芽孢形成率；優(yōu)化

中圖分類號： S188+.4文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）04-0235-04

我國是一個農(nóng)牧業(yè)大國，隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展和人們對環(huán)境保護的重視，在養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的糞便污染問題嚴重制約了該行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。禽畜糞便的污染也成為綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展中不可忽視的問題[1]。發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)運用墊料中的微生物迅速降解、消化豬的排泄物，從源頭實現(xiàn)免沖洗豬欄、無臭味、零污染的養(yǎng)殖目的[2]。新型微生物發(fā)酵床養(yǎng)殖技術(shù)可以有效地解決畜禽生產(chǎn)中的糞便處理和環(huán)境污染問題，緩解養(yǎng)豬業(yè)對環(huán)境帶來的壓力。

本研究通過對具有除臭功能的枯草芽孢桿菌N43進行發(fā)酵工藝的優(yōu)化，從而為研制出高效的適宜產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的微生態(tài)制劑提供種質(zhì)資源和理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料[HT]

枯草芽孢桿菌N43菌株，由河北省微生物研究所提供。

葡萄糖、NaCl、（NH4）2SO4，KH2PO4·2H2O、NaH2PO4·2H2O、MnSO4·H2O、CuSO4·5H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、ZnCl2、FeSO4·5H2O、蔗糖、乳糖、甘油、麥芽糖、可溶性淀粉、麥芽糊精，胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸膏、大豆蛋白胨、蛋白胨均為分析純，玉米粉、大豆餅粉、豆粕為市售。

1.2試驗方法

1.2.1種子培養(yǎng)及發(fā)酵

將試管斜面上活化的菌株接種于裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，振蕩后制成均勻的菌懸液。裝量為50 mL/250 mL，200 r/min 37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)20 h。將種子液按10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中。200 r/min 37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)。

1.2.2培養(yǎng)基單因素試驗

單因素試驗是通過研究碳源、氮源和無機鹽種類，對培養(yǎng)基濃度進行響應(yīng)面分析。

以玉米粉、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油、麥芽糖、麥芽糊精代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖作為碳源，以胰蛋白胨、蛋白胨、大豆蛋白胨、大豆餅粉、豆粕、牛肉浸膏、酵母浸粉、硫酸銨作為氮源，以0.05%的KH2PO4·2H2O、NaH2PO4·2H2O、MnSO4·H2O、FeSO4·5H2O、MgSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、CaCl2·2H2O、ZnCl2作為發(fā)酵培養(yǎng)基的無機鹽，進行單因素試驗。

1.2.3培養(yǎng)條件單因素試驗

分別從pH值、種齡、裝量3個方面進行單因素試驗。

2結(jié)果與分析

2.1不同碳源對菌株芽孢形成的影響

分別以玉米粉、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油、麥芽糖、麥芽糊精代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖作為碳源，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中其他成分不變，200 r/min 37 ℃搖床培養(yǎng)，取樣觀察芽孢生成情況。

2.2不同氮源對芽孢形成的影響

分別以胰蛋白胨、蛋白胨、大豆蛋白胨、大豆餅粉、豆粕、牛肉浸膏、酵母浸粉、硫酸銨作為氮源，其他成分不變。在 37 ℃、200 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)，取樣觀察，從表2可得出，培養(yǎng)72 h時，大豆餅粉作氮源時N43菌株的芽孢形成率達到87.73%，故以大豆餅粉為最佳氮源。

2.3不同無機鹽對芽孢形成的影響

CaCl2·2H2O、ZnCl2作為發(fā)酵培養(yǎng)基的無機鹽，搖振蕩床培養(yǎng)。取樣觀察，計算芽孢形成率。從表3中可以看出，MnSO4·H2O 和FeSO4·5H2O為N43菌株的最佳無機鹽。

2.4培養(yǎng)基濃度響應(yīng)面法分析

在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合試驗設(shè)計原理，以芽孢形成率為指標，選取玉米粉、大豆餅粉、FeSO4·5H2O、MgSO4·7H2O 4個因素，分別以A、B、C、D表示，每個自變量3水平分別以-1、0、1進行編碼，試驗因素及水平編碼見表4，數(shù)據(jù)用Design-Expert軟件統(tǒng)計，確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基濃度。

由表5可知，根據(jù)回歸方差的分析顯著性檢驗，該模型的P值<0.05，說明模型是顯著的。失擬項誤差為0.399 9，不顯著，r2=90.75，說明該模型與實際試驗有良好的擬合性，交互項AC的偏回歸系數(shù)最小，說明玉米粉和FeSO4交互項對產(chǎn)芽孢率影響顯著。

基于回歸模型方差分析，用軟件做出AC交互作用對產(chǎn)芽孢率的影響的等高線及響應(yīng)面圖（圖1）。

由上述分析可知，適當(dāng)濃度的玉米粉、大豆餅粉、FeSO4和MgSO4等試驗因素有利于芽孢的形成，因此可以采用軟件優(yōu)化功能得到最佳試驗條件，優(yōu)化出的最終結(jié)果為玉米粉05%、大豆餅粉2.5%、FeSO4 0.5%、MgSO4 0.05%時產(chǎn)芽孢率可達最高。

為檢驗響應(yīng)面分析法的可靠性，采用上述最優(yōu)條件進行驗證，實際測得產(chǎn)芽孢率達到95%。因此，基于響應(yīng)面法所得到的最佳配方準確可靠。

2.5培養(yǎng)條件分析

3討論與結(jié)論

生物除臭技術(shù)是通過微生物的生理代謝活動利用惡臭物質(zhì)，將其氧化成無臭、無害終產(chǎn)物，達到除臭的目的[3]。發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)利用具有生物除臭功能的微生物菌株，資源合理配置，有利于綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展。芽孢桿菌具有抗逆性強、營養(yǎng)需求簡單、繁殖快、易存活，生長過程中產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)增強對病害的抵抗能力等諸多優(yōu)點[4]，成為微生態(tài)制劑的首選菌種。

芽孢的形成受營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境因素雙重影響[5-6]。本研究結(jié)果表明，影響芽孢形成的主要因素是培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件。甄靜等對枯草芽孢桿菌-1產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化試驗結(jié)果表明，培養(yǎng)基的氮源、碳源和無機鹽的配比均對芽孢形成有影響[7]，這與本研究結(jié)果一致。孫梅等對納豆芽孢桿菌芽孢形成的研究結(jié)果表明，葡萄糖濃度對菌體生長和芽孢形成均有影響，濃度低時，提高葡萄糖濃度能提高菌體量，但是芽孢形成幾乎不受影響；過高的葡萄糖濃度抑制菌體生長，且芽孢形成率降低[8]。液體裝量直接影響通氣量即溶氧，裝量小即通氣量大，可促進菌體的生長，提高芽孢形成率。Karim等對球形芽孢桿菌（B.sphericus）溶解氧與芽孢形成關(guān)系進行了研究，結(jié)果表明隨著溶解氧濃度升高，芽孢形成率也隨之上升[9]。這與本研究結(jié)果不完全一致，可能與菌株有關(guān)。宋卡魏等報道pH值7.0時芽孢產(chǎn)量最大[10]；路程等的研究表明，中性或偏酸的培養(yǎng)基起始pH值會促進芽孢的形成，而偏堿性會抑制芽孢的形成[11]。本研究在pH值75時， 產(chǎn)芽孢率最大，可能與菌體本身的特性有關(guān)。本研究對枯草芽孢桿菌N43的發(fā)酵產(chǎn)芽孢條件進行了優(yōu)化，達到了較高的芽孢濃度，為進一步的小試及中試生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]仇煥廣，廖紹攀，井月，等. 我國畜禽糞便污染的區(qū)域差異與發(fā)展趨勢分析[J]. 環(huán)境科學(xué)，2013，34（7）：2766-2774.

[2]蔣建明，閆俊書，白建勇，等. 微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬模式的關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（9）：173-176.

[3]劉勝洪，程駒，郭長江，等. 微生物除臭菌對改善畜禽養(yǎng)殖場環(huán)境的應(yīng)用初探[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，17（4）：25-27.

[4]張保全，朱年華. 芽孢桿菌在畜牧業(yè)中應(yīng)用的研究進展[J]. 江西畜牧獸醫(yī)雜志，2007（1）：2-3.

[5]郭榮君，王步云，李世東. 營養(yǎng)對生防菌株BH1芽孢產(chǎn)量的影響研究[J]. 植物病理學(xué)報，2005，35（3）：283-285.

[6]Lu X Y，Li S Z，Ma P，et al. Isolation and partial purification of an ext racellular metabolite from a Bacillus subtilis strain NCD-2 active against Verticillium dahliae[J]. Shandong Science，2005，18（3）：22-25.

[7]甄靜，郭直岳，謝寶恩，等. 枯草芽孢桿菌-1產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28（27）：146-151.

[8]孫梅，匡群，施大林，等. 培養(yǎng)條件對納豆芽孢桿菌芽孢形成的影響[J]. 飼料工業(yè)，2006，27（8）：19-24.

[9]Karim M，Lucas R J，Osborne K J，et al. The effect of oxygen on the sporulation and toxicity of Bacillus sphericus 2362[J]. Biotechnology Letters，1993，15（1）：47-50.

[10]宋卡魏，王星云，張榮意. 培養(yǎng)條件對枯草芽孢桿菌B68芽孢產(chǎn)量的影響[J]. 中國生物防治，2007，23（3）：255-259.

[11]路程，周長海，于紅梅，等. 凝結(jié)芽孢桿菌T50產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化的研究[J]. 中國釀造，2009（7）：93-95.