新疆棉花黃萎病菌生理型鑒定

陳民志 +張海萍++曲延英 +朱荷琴++葉武威++馬前程++劉莎++聶夢(mèng)穎++顧愛(ài)星

摘要：通過(guò)分離、培養(yǎng)新疆南疆、北疆若干地點(diǎn)采集棉株中的黃萎病菌，對(duì)不同抗病性的棉花有效接種黃萎病菌，采用鑒別寄主法和特異性引物PCR檢測(cè)技術(shù)來(lái)確定棉花黃萎病菌的類型。得出菌株44-138在30個(gè)棉花品種上均表現(xiàn)強(qiáng)的致病力。

關(guān)鍵詞：棉花黃萎??；生理型；培養(yǎng)性狀；鑒定法

中圖分類號(hào)：S435.621.2+4文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）04-0070-03

棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae Kleb.）是一種典型的土傳植物維管束病害，在世界各主要植棉區(qū)均有發(fā)生，并呈日益蔓延的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響我國(guó)主產(chǎn)區(qū)新疆棉花的產(chǎn)量與安全[1]。姚耀文等研究表明，新疆和田及車排子菌，生理型2號(hào)，致病力最弱[2]。2000年前，新疆沒(méi)有落葉型黃萎病菌菌系的報(bào)道[3]。2004年，張莉等從南北疆各主要植棉區(qū)采樣進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在南北疆已存在落葉型菌系，但數(shù)量很少[4]。2004年，段維軍等采用營(yíng)養(yǎng)親和群和分子生物學(xué)的方法，再次證實(shí)新疆存在落葉型黃萎病菌菌系[5]。根據(jù)2008—2009年對(duì)棉花枯萎病、黃萎病的調(diào)查，近年來(lái)，棉花黃萎病的發(fā)生日益嚴(yán)重，重病田明顯增多，急性枯死型癥狀不斷出現(xiàn)，給當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)極其嚴(yán)重的損失[6]，培育抗病品種是目前防治棉花黃萎病的有效措施，抗病育種需要明確棉花黃萎病菌的生理型、致病性分化和簡(jiǎn)易、準(zhǔn)確的鑒定方法。

本研究通過(guò)分離、培養(yǎng)新疆南疆、北疆若干地點(diǎn)采集棉株中的黃萎病菌，對(duì)不同抗病性的棉花有效接種黃萎病菌，鑒定棉花黃萎病抗病性，探明棉花黃萎病菌生理型的簡(jiǎn)易、準(zhǔn)確鑒定方法，為棉花抗病性研究提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1棉花品種

共30份抗病性不同的棉花品種（系）?？共∑贩N（系）：新海16號(hào)、新陸早26號(hào)、中棉所35號(hào)、中棉所12號(hào)、中棉所17號(hào)、愛(ài)字棉、軍海1號(hào)、新海20號(hào)、中棉所19號(hào)、新陸早12號(hào)；耐病品種（系）分別為新陸早48號(hào)、遼棉18號(hào)、新陸早11號(hào)、冀668、川737、新陸中42號(hào)、新陸早42號(hào)；感病品種（系）分別為新陸早1號(hào)、新陸早36號(hào)、大鈴棉、老炮臺(tái)、108夫、F2、碩豐1號(hào)、新陸早13號(hào)、蘇K202、新陸早35號(hào)、新陸早16號(hào)、新陸早50號(hào)。對(duì)照為感病品種軍棉1號(hào)。所有棉花品種（系）均來(lái)自新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物育種系。

1.1.3供試棉花黃萎病菌

以落葉型棉花黃萎病菌株V76、V991為對(duì)照，對(duì)照菌株由美國(guó)南部平原棉花研究所及南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.2方法

1.2.1分離棉花黃萎病菌的方法

挑出發(fā)病棉株，留莖下部，洗凈去皮，擦干，切成1～3 mm小塊，用于無(wú)菌操作；在超凈工作臺(tái)，將切好的病棉小塊材料先后置于2%的次氯酸鈉、75%乙醇和無(wú)菌水中各泡1～2 min，用無(wú)菌紙拭干，移入含0.01%鏈霉素的PDA培養(yǎng)基，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)；待菌株長(zhǎng)出，進(jìn)行純化、鏡檢、培養(yǎng)性狀觀察；置于-4 ℃冰箱中待用。

1.2.2鑒別寄主法

1.2.2.1棉苗培育

挑選飽滿的棉種進(jìn)行催芽處理，待種芽長(zhǎng)度達(dá)到1 cm時(shí)播種[7]。將催芽后的棉花種子種植在裝有滅菌土的無(wú)底塑料缽中，每缽種植6粒種子，每個(gè)品種10缽，播種后將營(yíng)養(yǎng)缽置于托盤內(nèi)，托盤中灌滿清水，放置在人工氣候箱中培養(yǎng)，光照12 h，溫度27 ℃；黑暗12 h，溫度 22 ℃[8]。棉種出苗后，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽中留棉苗3株，待2張真葉展平時(shí)接菌[9]。

1.2.2.2接種黃萎病菌孢子液的制備

將分離培養(yǎng)的菌種在PDA平板上活化3 d后，用打孔器在菌落上打孔，挑取5～6塊菌絲塊放置液體PDA培養(yǎng)基中，于26 ℃下靜置培養(yǎng)3 d后，挑取液體培養(yǎng)基表面的菌絲。轉(zhuǎn)接到營(yíng)養(yǎng)較少的液體PDA培養(yǎng)基中，放在20 r/min、26 ℃的搖床里培養(yǎng)，7 d后用4層紗布過(guò)濾，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板將孢子濃度調(diào)至 2×107個(gè)/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。本研究采用營(yíng)養(yǎng)較少的PDA培養(yǎng)基配方為馬鈴薯50 g、蔗糖5 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2.2.3棉苗接種

采用接種方法為切根蘸菌法，用滅菌后的剪刀在塑缽的底部將棉苗的須根剪掉，然后放在盛有 30 mL 孢子懸液的培養(yǎng)皿中泡10 min，然后放回托盤中。7月19日挑選飽滿的棉種，用30%的H2O2沖洗3次，最后1次浸泡5 h后，用無(wú)菌水沖洗2～3遍，最后用無(wú)菌水浸泡12 h，將土于高壓蒸汽鍋中滅菌；7月20日播種于直徑10 cm、高 10 cm 的有底塑料缽中，土下3～5 cm位置，7月27日長(zhǎng)出2片真葉，每缽留3株，將棉花黃萎病菌孢子濃度調(diào)至 2×107個(gè)/mL，將棉株剪去底根放入其中泡10 min，然后放回托盤中，每2 d澆水1次、記錄1次，15 d后開(kāi)始零星發(fā)病，9月10日調(diào)查。

1.2.2.4抗病性鑒定

當(dāng)感病對(duì)照的病情指數(shù)達(dá)50左右時(shí)，按全國(guó)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查不同品種的發(fā)病情況。采用相對(duì)病情指數(shù)來(lái)劃分抗病類型。先用50.0除以本期感病對(duì)照實(shí)際病情指數(shù)，計(jì)算校正系數(shù)K值。為保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，要求K值范圍0.75～1.25。然后將供試品種實(shí)際病情指數(shù)乘以K值，即為相對(duì)病情指數(shù)（表2）

計(jì)算公式：

[JZ]發(fā)病率=病苗總數(shù)/調(diào)查總數(shù)苗×100%。

病情指數(shù)=ε（發(fā)病級(jí)值×該級(jí)病葉數(shù)）/（最高發(fā)病級(jí)值×調(diào)查總?cè)~數(shù)）×100%。

[JZ]相對(duì)病情指數(shù)（In）=K×鑒定品種的實(shí)際病指[2]。

K值的計(jì)算：

[JZ]K=50.00/DI。

式中：K表示校正系數(shù)；50.00表示感病對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)綜合評(píng)價(jià)病情指數(shù)；DI表示本次鑒定感病對(duì)照綜合評(píng)價(jià)病情指數(shù)。

接種后每隔2 d記錄1次感病情況，播種50 d后，將棉苗全部削莖檢查，根據(jù)病情，分級(jí)記載（表3）。

1.2.3PCR鑒別方法

1.2.3.1DNA的提取

各供試菌系在PDA平板上25 ℃培養(yǎng)15 d，采用天澤基因工程有限公司生產(chǎn)的柱式土壤DNA out試劑盒，按照說(shuō)明書操作提取DNA，將其保存在-20 ℃冰箱中備用。

1.2.3.2引物合成

PCR特異性引物選用Pérez-Artés等設(shè)計(jì)的檢測(cè)棉花黃萎病菌落葉型（D1/D2）、非落葉型（ND1/ND2）的2對(duì)特異性引物[14]，擴(kuò)增片段大小分別為 550、1 500 bp。

1.2.3.3PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件

PCR反應(yīng)體系：10×buffer（含Mg2+）2.5 μL、200 μmol/L dNTP、0.5 umol/L各引物、1 U Taq DNA polymerase、模板1 μL，總體積25 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸 2 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.3.4PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后將瓊脂糖凝膠置于含有0.5 μg/mL EB的染液中染色15 min，然后置于凝膠成像儀上觀察并掃描于計(jì)算機(jī)軟件中保存。

1.2.3.5統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，然后利用SPSS 18.0軟件分析黃萎病相對(duì)病情指數(shù)與產(chǎn)量性狀指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系。

2結(jié)果與分析

2.1分離得到的棉花黃萎病菌

定出棉花黃萎病的致病性，對(duì)病情的防治有著重要意義。關(guān)于棉花致病性常見(jiàn)的檢測(cè)方法有溫室致病性測(cè)定、菌落培養(yǎng)性狀比較和分子檢測(cè)等方法，棉花黃萎病菌生理型的鑒定主要通過(guò)接種病原菌后的鑒別寄主抗感反應(yīng)型進(jìn)行劃分[15]。本試驗(yàn)通過(guò)鑒別寄主法得到棉株對(duì)菌株44-138的平均相對(duì)感病系數(shù)為41.4。郭景紅等對(duì)近5年新疆審定通過(guò)的新陸早系列棉花品種抗黃萎病進(jìn)行鑒定，新審定棉花品種抗黃萎病性較弱，僅有28%的品種鑒定抗病，32%的品種鑒定感病[16]；邰紅忠對(duì)近幾年新疆南部棉區(qū)示范和試種棉花品種進(jìn)行了黃萎病抗病性鑒定，耐病品種占黃萎病鑒定材料的2143%，沒(méi)有抗病材料[17]。本試驗(yàn)通過(guò)鑒別寄主法得到30個(gè)棉花品種（系）對(duì)菌株44-138僅有20%的品種（系）鑒定耐病，80%品種（系）鑒定感病，與前人研究結(jié)果一致。2004年，張莉等從南疆、北疆主要植棉區(qū)采樣進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在南疆、北疆已存在落葉型菌系，但數(shù)量很少[4]。本試驗(yàn)驗(yàn)證了該結(jié)論?，F(xiàn)在南疆、北疆都存在落葉型菌系，具體分布、致病力、生理型都不明確，還有待進(jìn)一步研究分析。

從南疆、阿克蘇16團(tuán)采樣地點(diǎn)的感病棉株中分離出 N-2、AKS16菌株，分離率分別為40.0%、12.5%。北疆石河子122團(tuán)、132團(tuán)分離出了81-4、44-138菌株，分離率分別為50%、25%。從中選出44-138菌株進(jìn)行鑒別寄主法鑒定，得出棉株平均相對(duì)感病系數(shù)為41.4，且每個(gè)棉株的相對(duì)感病系數(shù)都大于30.1，所以44-138菌株屬?gòu)?qiáng)致病力菌系，生理型屬生理I型。

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