淮山多糖超聲輔助提取及清除超氧陰離子自由基的作用

摘要：以無水乙醇為提取劑，采用超聲輔助提取淮山中的多糖，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，研究超聲功率、液料比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)淮山多糖提取率的影響，并通過分光光度法分析淮山多糖清除超氧陰離子自由基能力。結(jié)果表明，淮山多糖的最佳提取工藝為超聲功率800 W、液料比80 mL ∶[KG-*3]1 g、提取時(shí)間50 min、提取溫度60 ℃，在此條件下淮山多糖提取率高達(dá) 8.53%。結(jié)果還表明，淮山多糖具有較好的清除超氧陰離子自由基的能力，且其清除能力與多糖濃度有明顯的量效關(guān)系。

關(guān)鍵詞：淮山；多糖；超聲輔助提取；清除；超氧陰離子自由基

中圖分類號(hào)： TS201.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）04-0144-03

淮山別稱山藥、懷山藥，含有淀粉、多糖、尿囊素、膽堿等成分，藥用價(jià)值極高，是藥食兩用的食品[1]。近年來，淮山多糖已被確定具有抗氧化功能[2]，有提高人體免疫功能和抗病能力[3]。超氧陰離子自由基（O-2[KG-*2]· [KG-*3]）是活性氧之一，具有強(qiáng)烈的氧化能力[4]。O-2[KG-*2]· [KG-*3]產(chǎn)生異常會(huì)損壞細(xì)胞，直接或間接導(dǎo)致機(jī)體衰老、炎癥和癌癥等某些疾病，因此對(duì)O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除的研究在醫(yī)學(xué)保健中越來越重要[5]。

在淮山多糖提取方法中，最常見的有水提取法[6-7]、微波法[8-9]、酶解超聲輔助提取法[10]。用水提取山藥多糖成本低，不破壞生物活性，方便實(shí)用且安全性高，但耗時(shí)長(zhǎng)、提取率不高。利用微波提取山藥多糖具有高效快速的優(yōu)點(diǎn)，但微波功率較難控制。酶與超聲提取法使用的酶作為一種蛋白質(zhì)，其酶解效果受酶解溫度、pH值、底物濃度等多種因素影響，對(duì)提取會(huì)有干擾。超聲波提取法主要利用超聲波的空化作用產(chǎn)生熱效應(yīng)，機(jī)械作用加速細(xì)胞壁的破碎，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)多糖的溶出，達(dá)到縮短提取時(shí)間和提高多糖提取率的目的，還具有無需加熱的優(yōu)點(diǎn)。

本試驗(yàn)采用超聲輔助提取淮山多糖，研究淮山多糖的最佳提取工藝。此外，通過分光光度法研究淮山多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用，分析其體外抗氧化活性，旨在為淮山的深度加工和綜合開發(fā)利用提供一些參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

淮山購自賀州市陽光市場(chǎng)。所用化學(xué)試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為蒸餾水?？梢姺止夤舛扔?jì)為722型（上海光譜儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1淮山多糖的超聲輔助提取

將新鮮淮山洗凈、去皮切片，60 ℃烘干后粉碎。稱取干燥淮山粉末2.00 g，按設(shè)定試驗(yàn)條件進(jìn)行超聲波提取、離心，將上清液濃縮至15 mL，再加入60 mL乙醇，在冰箱冷藏室中放置24 h，離心，取沉淀，用乙[LM]醇洗滌后，再用蒸餾水溶解、稀釋到合適的濃度，測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算淮山多糖的提取率：

[JZ]提取率=C×V/m×100%。

式中：C為淮山多糖濃度，mg/mL；V為淮山多糖提取液的體積，mL；m為淮山粉末質(zhì)量，mg。

1.2.2最優(yōu)提取工藝條件的確定

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以超聲功率、液料比、提取時(shí)間和提取溫度為影響因素，以淮山多糖的提取率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）的正交試驗(yàn)（表1）確定最優(yōu)提取工藝。首先，分別稱取5份2.00 g淮山粉末，固定液料比為60 mL ∶[KG-*3]1 g，超聲時(shí)間為30 min，超聲溫度為60 ℃，分別研究400、600、800、1 000、1 200 W超聲功率對(duì)淮山多糖提取率的影響。其次，在確定最佳超聲波功率后，分別稱取5份 2.00 g 淮山粉末，超聲時(shí)間為30 min，固定超聲功率為 800 W，超聲溫度為60 ℃，研究40 mL ∶[KG-*3]1 g、60 mL ∶[KG-*3]1 g、80 mL ∶[KG-*3]1 g、100 mL ∶[KG-*3]1 g、120 mL ∶[KG-*3]1 g的液料比對(duì)淮山多糖提取率的影響。在確定最佳超聲波功率、液料比后，稱取5份2.00 g淮山粉末，固定超聲功率為800 W，液料比為80 mL ∶[KG-*3]1 g，超聲溫度為60 ℃，研究30、40、50、60、70 min提取時(shí)間對(duì)淮山多糖提取率的影響。在確定最佳超聲波功率、液料比、提取時(shí)間后，分別稱取5份 2.00 g 淮山粉末，固定超聲功率為800 W，液料比為80 mL ∶[KG-*3]1 g，提取時(shí)間為50 min，研究40、50、60、70、80 ℃提取溫度對(duì)淮山多糖提取率的影響。

1.2.3多糖含量的測(cè)定

稱取0.100 0 g無水葡萄糖于燒杯中溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶?jī)?nèi)，加水至刻度處，得 1.00 mg/mL 葡萄糖溶液。分別取0.40、0.60、0.80、1.00、120、1.40 mL 葡萄糖溶液于比色管中定容至25 mL，各取200 mL于試管內(nèi)，加入1.00 mL 5%苯酚、5.00 mL濃硫酸，振蕩，靜置30 min，以試劑空白作為參比，于490 nm處測(cè)定吸光度D490 nm，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=9.483x+0.005，n=5，r=0.998 5。

1.2.4多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除

以分別加入 4.50 mL Tris-HCl緩沖溶液（0.05 mol/L，pH 值8.2）、2.00 mL H2O、0.20 mL HCl溶液（0.01 mol/L，pH值 8.2）的混合液作為參比溶液，以加入4.50 mL Tris-HCl緩沖溶液（0.05 mol/L，pH值8.2）、2.00 mL H2O、0.20 mL鄰苯三酚溶液（0.05 mol/L）的混合液為空白溶液，以加入4.50 mL Tris-HCl 緩沖溶液（0.05 mol/L，pH值8.2）、不同濃度多糖溶液和0.20 mL鄰苯三酚溶液（0.05 mol/L）的混合液作為樣品液，振蕩，最后加入1滴6 mol/L HCl終止反應(yīng)，在37 ℃下加熱10 min，冷卻10 min至室溫，在325 nm處測(cè)定吸光度D325 nm。計(jì)算多糖對(duì) O-2[KG-*2]· [KG-*3]的清除率：清除率 =（D325 nm（0）-D325 nm（樣））/D325 nm（0）×100%。式中：D325 nm（0）代表空白管所測(cè)的吸光度；D325 nm（樣）代表不同濃度樣品液所測(cè)得的吸光度。

2結(jié)果與分析

2.1超聲功率對(duì)淮山多糖提取率的影響

在800 W功率范圍內(nèi)，淮山多糖提取率隨著超聲功率的增大而提高，在800 W時(shí)出現(xiàn)最高值，多糖提取率達(dá)8.5%；之后隨著功率進(jìn)一步增大，多糖提取率呈平穩(wěn)下降趨勢(shì)（圖1）。這可能是超聲功率的增加，加速了提取液的流動(dòng)，使物料在超聲場(chǎng)中停留的時(shí)間縮短，破壁作用減弱，胞內(nèi)多糖溶出速率減緩，使多糖提取率降低[11]。因此，綜合考慮最適宜的超聲功率為800 W。

2.2液料比對(duì)淮山多糖提取率的影響

淮山多糖的提取率隨液料比的增大而升高，當(dāng)液料比為80 mL ∶[KG-*3]1 g時(shí)，淮山多糖的提取率基本達(dá)到最高值，之后隨著液料比的增加提取率升高不明顯（圖2）。因此，最佳液料比為 80 mL ∶[KG-*3]1 g。

2.3提取時(shí)間對(duì)淮山多糖提取率的影響

淮山多糖的提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸提高，當(dāng)提取時(shí)間為50 min時(shí)，提取率基本達(dá)到最高值，之后隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)提取率變化不明顯（圖3）。因此，最佳提取時(shí)間為50 min。

2.4提取溫度對(duì)淮山多糖提取率的影響

淮山多糖的提取率隨提取溫度的升高而提高，當(dāng)提取溫度超過60 ℃后，提取率升高不明顯，可能因?yàn)檫^高溫度會(huì)造成多糖黏稠，不易分離（圖4）。因此，綜合考慮認(rèn)為適宜提取溫度為60 ℃。

2.5正交試驗(yàn)

采用表1的L9（34）因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以淮山多糖提取率為指標(biāo)。由表2可知，影響淮山多糖提取率因素的順序?yàn)锳（超聲功率）>D（提取溫度）>B（液料比）>C（提取時(shí)間），即超聲功率的影響最大，提取時(shí)間的影響最小?；瓷蕉嗵亲顑?yōu)提取因素水平的組合為A2B3C2D1，即超聲功率 800 W、液料比80 mL ∶[KG-*3]1 g、提取時(shí)間50 min、提取溫度60 ℃。

2.6驗(yàn)證試驗(yàn)

在最佳提取工藝條件下，即超聲功率800 W、液料比 80 mL ∶[KG-*3]1 g、提取時(shí)間50 min、提取溫度60 ℃，用相同方法提取5個(gè)樣品，測(cè)定多糖提取率分別為8.52%、8.51%、853%、8.54%、8.55%，平均提取率為8.53%，表明該最佳提取工藝穩(wěn)定可靠。

2.7本試驗(yàn)方法與其他方法的比較

通過與與其他提取淮山多糖方法（傳統(tǒng)水提法、微波法、復(fù)合酶法）的比較，發(fā)現(xiàn)采用超聲輔助提取淮山多糖的提取率最高，且提取時(shí)間比其他方法短（表3）。

2.8淮山多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

當(dāng)向鄰苯三酚氧化體系中加入不同濃度的淮山多糖溶液時(shí)，吸光度會(huì)有所降低，由此可知淮山多糖能催化O-2[KG-*2]·與H+結(jié)合，從而降低體系中的超氧陰離子自由基含量。在反應(yīng)過程中淮山多糖對(duì)O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率越高，表明對(duì)O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除作用越強(qiáng)。此外，淮山多糖具有較好的清除超氧陰離子自由基的能

3結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定淮山多糖的最優(yōu)超聲輔

助提取工藝：超聲功率800 W、液料比80 mL ∶[KG-*3]1 g、提取時(shí)間50 min、提取溫度60 ℃，在此條件下多糖提取率高達(dá) 8.53%，比傳統(tǒng)水提法、微波法、復(fù)合酶法高，且提取時(shí)間也比這些方法短。因此，本試驗(yàn)結(jié)果將為淮山多糖提取及淮山多糖抗氧化作用研究提供理論參考，有望促進(jìn)淮山資源的開發(fā)利用。

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