高效液相色譜法測定土壤中麥角固醇的含量

喬潔 +張春丹+畢利東+堯水紅+趙英

摘要：麥角固醇是真菌和一些藻類細胞膜中的主要固醇類物質(zhì)，真菌死亡后迅速分解，因此它的含量能夠用來表征土壤真菌的活性。由于麥角固醇受土壤真菌種類及其生長環(huán)境的影響顯著且較易被分解，因此建立一種簡單、快速、準確的測定麥角固醇含量的方法尤為重要。比較KOH-醇溶液提取法和正己烷-異丙醇提取法2種不同測定方法發(fā)現(xiàn)，不通過皂化處理不但不會影響測定的準確率，而且還會大大縮短提取時間，減小提取過程中麥角固醇的損失，從而顯著提高回收率。同時，麥角固醇測定方法的回收率被證實與土壤樣品水土比之間存在顯著的負相關(guān)關(guān)系（r=-0943，P<0.05）。

關(guān)鍵詞：土壤；真菌；麥角固醇；高效液相色譜；測定方法；KOH-醇溶液提取法；正己烷-異丙醇提取法

中圖分類號： S154.3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）04-0153-03

現(xiàn)在用以描述土壤微生物生物量的相關(guān)方法很多，但大多用于估計總土壤微生物生物量（如熏蒸浸提法、底物誘導(dǎo)呼吸法）或者用作表征土壤微生物功能多樣性（如Biolog微平板法[1]）。而傳統(tǒng)的微生物平板純培養(yǎng)方法測定的土壤微生物類群數(shù)量只占到土壤中實際存在微生物總數(shù)的1%～10%[2]。此外，磷脂脂肪酸分析方法（PLFA方法）雖然可以根據(jù)微生物細胞膜磷脂酸的種類和數(shù)量來判定微生物的多樣性，并定量反映可繁殖或有潛在繁殖能力的不同類群微生物生物量和總生物量[3]，但是此方法最適合作總微生物群分析，而非專一的微生物種類的研究[4]，且其對特殊儀器設(shè)備的要求和復(fù)雜的試驗方法限制了它的應(yīng)用[5]。麥角固醇是大多數(shù)子囊菌類、擔(dān)子菌類等真菌細胞膜中的重要組成成分[6]，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。由于真菌死亡后麥角固醇迅速分解，從而其相對含量可以作為真菌活性的優(yōu)良指標[7-12]，該方法對儀器設(shè)備要求不高、試驗步驟簡單，利用麥角固醇表征真菌活性優(yōu)于傳統(tǒng)的微生物平板計數(shù)法，它能更方便、快速、真實地反映真菌活性[13-16]。本研究是探討土壤中麥角固醇含量的測定方法，篩選出2種較為合理的測定方法，并通過這2種測定方法的比較以期為研究土壤真菌提供技術(shù)手段。

1材料與方法

供試土樣采自江西省紅壤研究所（116°26′E、28°37′N）

[FK（W9][TPQJ1.tif][FK）]

內(nèi)的水稻地，土樣采集深度為0～10 cm的耕層土壤，用自封袋密封帶回實驗室，挑去植物殘根和石塊，過2 mm篩，4 ℃冰箱保存，供分析用。

1.1測定方法一

KOH-醇溶液提取法。

1.1.1儀器

高效液相色譜儀（島津，日本）、紫外檢測器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.1.2試劑

甲醇（色譜級）、乙醇（分析純）、環(huán)己烷（分析純），麥角固醇標準樣品。

1.1.3色譜條件

色譜柱為CLC-ODS反相柱（150 mm×6 mm），流動相為100%甲醇，流速為1.5 mL/min，檢測波長為283 nm，采用外標法按峰面積進行定量。

1.1.4樣品處理

根據(jù)土壤有機質(zhì)含量稱取1～3 g鮮土，加入20 mL KOH-醇溶液（甲醇 ∶[KG-*3]乙醇=1 ∶[KG-*3]3），漩渦振蕩，然后在水浴鍋中75 ℃皂化1 h，冷卻至室溫，再加入5 mL雙蒸水，離心，上清液轉(zhuǎn)入分液漏斗中，加25 mL環(huán)己烷，萃取、分液，將上層環(huán)己烷溶液轉(zhuǎn)移至濃縮瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 40 ℃ 條件下蒸干，用甲醇洗濃縮瓶并定容于1 mL容量瓶中待測。

1.2測定方法二

正己烷-異丙醇提取法。

1.2.1儀器

高效液相色譜儀（島津，日本）、紫外檢測器。

1.2.2試劑

甲醇、乙醇、正己烷、異丙醇，所有試劑均為色譜級。

1.2.3色譜條件

色譜柱為Phenomenex Luna silica正相柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為正己烷和異丙醇混合物（體積比98 ∶[KG-*3]2）、流速為1.5 mL/min，檢測波長282 nm，采用外標法按峰面積進行定量。

1.2.4樣品處理

根據(jù)土壤有機質(zhì)含量稱取相當于0.2 g干土的鮮土于2 mL離心管中，加入400 μL甲醇和乙醇的混合液（體積比4 ∶[KG-*3]1 ），放在4 ℃條件下培養(yǎng)2 h，再加入1 mL正己烷和異丙醇的混合液（體積比98 ∶[KG-*3]2），漩渦振蕩，13 000 r/min 離心 2 min，將上層溶液過0.2 μm微孔濾膜，轉(zhuǎn)入進樣瓶中，上機前保存在-20 ℃冰箱中。

2結(jié)果與分析

2.1標準曲線

2.1.1方法一的標準曲線

精確稱取100 mg麥角固醇對照品，用無水乙醇溶解并稀釋至刻度，作為標準貯備液。用標準貯備液分別配制0.000 8、0.002、0.004、0.008、0.02、0.04 mg/mL 等6份標液，在已建立的色譜條件下進樣 10 μL，以峰面積A為橫坐標、標準樣品濃度C為縱坐標作標準曲線，進行回歸處理（圖4）。

[CM（24]由圖4可以看出，方法一測定的土壤中麥角固醇含量的

標準曲線相關(guān)性很好（r2=0.999，P<0.05），因此用該方法測得的土壤中麥角固醇含量的數(shù)據(jù)是可信的。

2.1.2方法二的標準曲線

精確稱取100 mg麥角固醇對照品，用無水乙醇溶解并稀釋至刻度，作為標準貯備液。用標準貯備液分別配制0.001、0.002、0.0034、0.006、0.008、0.01 mg/mL 等6份標液，在已建立的色譜條件下進樣1 μL，以峰面積A為橫坐標、標準樣品濃度C為縱坐標作標準曲線，進行回歸處理（圖5）。

[CM（24]由圖5可以看出，方法二測定的麥角固醇含量的標準曲

線相關(guān)性很好（r2=0.999，P<0.05），因此用該方法測得的土壤中麥角固醇含量的數(shù)據(jù)是可信的。

2.2回收率

精確移取0.002、0.008 mg/mL麥角固醇標準樣品1 mL于相當于0.2 g干土的鮮土樣品中，然后按提取步驟操作，并采用外標法按峰面積計算出總麥角固醇質(zhì)量m和土壤樣品中麥角固醇質(zhì)量的本底值，然后按照下面的計算方法得出回收率：

[JZ]回收率=[SX（]m-m0C×V[SX）]×100%。

式中：m為總的麥角固醇質(zhì)量，mg；m0為土壤樣品中麥角固醇質(zhì)量的本底值，mg；C為麥角固醇標準樣品的濃度，mg/mL；V為移取麥角固醇標準樣品的體積，mL。

由表1可以看出，利用方法二測定的土壤中麥角固醇含量的回收率比方法一高約105%，且相對標準差（RSD）比方法一低。因此，利用方法二測定土壤中麥角固醇含量更合理。

2.3麥角固醇含量與土壤樣品的水土質(zhì)量比之間的關(guān)系

由于麥角固醇容易分解，所以在測定樣品時須要同時計算回收率。由圖6可以看出，麥角固醇含量與樣品的水土質(zhì)量比之間呈顯著負相關(guān)關(guān)系（r=-0.943，P<0.05）。

2.42種方法優(yōu)劣分析

由于方法一的提取過程包括皂化、萃取、濃縮3個步驟，皂化過程需時較多，用分液漏斗萃取和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮不僅用時多，而且麥角固醇容易損失掉，這是該方法最大的缺點。方法二則省去了皂化和濃縮過程，大大縮短了提取時間，提高了回收率，且相對標準差較??；但是，該方法色譜柱用的是正相柱，基線不容易穩(wěn)定。

3結(jié)論與討論

經(jīng)反復(fù)測定，方法二提取步驟簡單、耗時短、回收率高、同一樣品測定值穩(wěn)定，比方法一更適用。這是因為方法二省去了皂化和濃縮過程，從而大大縮短了提取時間；而且由于麥角固醇極易分解，縮短了提取時間，這也會減小提取過程中麥角固醇的損失。提取過程中需要注意的是，由于麥角固醇容易分解，提取時避免讓樣品長時間暴露在空氣中，盡量隨時提取隨時上機測定，并在測定樣品的同時測定回收率。

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