新疆維吾爾族宮頸鱗癌組織人乳頭瘤病毒16型E6、E7基因變異分析

者湘漪 ，朱君玲 ，姜心雨 ，何鴻昌 ，潘貞貞 ,4，蔣琦偉 ，王媛 ，李洪濤 ，鄭威楠 ，潘澤民 *

（1新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室/石河子大學醫(yī)學院生物化學教研室，新疆 石河子 832002；2喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院病理科，新疆 喀什 844000；3石河子大學醫(yī)學院臨床醫(yī)學系，新疆 石河子 832002；4新疆兵團第四師醫(yī)院檢驗科，新疆 伊犁 835000）

宮頸癌在婦女最常見的惡性腫瘤中位居第三位，僅次于乳腺癌和結直腸癌。2012年全球宮頸癌新確診 527，624例，死亡 265，653例[1]。我國宮頸癌患病率高，尤其在新疆維吾爾族婦女中，宮頸癌的發(fā)病率高達527/100000[2]。宮頸癌的發(fā)生涉及諸多因素，其中持續(xù)性感染高危型人乳頭瘤病毒HPV16，已被公認為是引起宮頸癌，以及發(fā)展成為侵潤性宮頸癌最主要的因素[3]。

宮頸癌的發(fā)展和進展涉及多種因素，大多數(shù)HPV16感染會在感染后一到兩年內(nèi)自動被免疫系統(tǒng)清除，只有一小部分HPV病毒感染發(fā)展成為宮頸癌[4-6]。HPV16作為宮頸癌最常見的高危型人乳頭瘤病毒，促使發(fā)展成為宮頸癌的因素還不清楚。

基于HPV16E6基因區(qū)域單核苷酸多態(tài)性(SNPs)系統(tǒng)發(fā)育模式，可將HPV16定義為6個亞型：歐洲型(E)，亞洲型(As)，非洲 1 型（Af1），非洲 2 型（Af2），亞洲美洲型(AA)和北美型(NA)[7]。HPV16 譜系有地理區(qū)域集中分布現(xiàn)象，以及民族性差別。不同的HPV16亞型具有不同的致癌潛能，可能與某些重要序列位點突變有關[8-11]。然而，新疆維吾爾族宮頸癌HPV16亞型還鮮為人知。

人乳頭瘤病毒HPV16 E6，E7基因編碼的癌蛋白在HPV16介導的宮頸癌過程中持續(xù)表達，并且涉及多個信號通路[12]。已有研究表明，HPV16 E6，E7基因是研究HPV16疫苗很有前景的靶基因[13-14]。E6，E7基因多個位點突變影響HPV16病毒的抗原性，免疫原性以及易感性[5-6]。多項研究表明，非歐洲型的（non-European）病毒感染相比于歐洲型HPV16感染，更容易進展為高度鱗狀上皮病變(HSIL)[15]。

本研究通過分析維吾爾族婦女宮頸癌HPV16病毒 E6，E7基因核苷酸序列，研究本地區(qū)HPV16亞型突變情況和分布特點，探討HPV16E6，E7基因突變與新疆地區(qū)維吾爾族婦女宮頸癌高發(fā)的關系。

1 對象與方法

1.1 標本采集

采集喀什人民醫(yī)院和烏魯木齊自治區(qū)人民醫(yī)院2011-2014年維吾爾族婦女宮頸鱗癌手術或活檢樣本（經(jīng)病理檢測確定為宮頸鱗癌），用HPV16 E6引物篩選出43例感染HPV16病毒的宮頸鱗癌樣本。其中，20例為新疆南部維吾爾族婦女，23例為新疆北部維吾爾族婦女，患者均無外地長期居住史。樣本于-80℃凍存。

1.2 DNA制備和HPV16病毒鑒定

DNA提取采用SK1252基因組DNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)，步驟按照試劑盒說明書操作。設計HPV16 E6引物，用PCR方法對樣本進行HPV16病毒檢測。鑒定HPV16 E6引物序列 HPV16E6-F：5’-GACCCAGAAAGTTACCACAG-3’，HPV16 E6-R：5′-CACAACGGTTTGTTGTATTG-3′（F：正向引物；R：反向引物）。

1.3 PCR擴增和測序

HPV16 E6，E7基因片段通過PCR技術進行擴增，PCR體系50 μL包含上下游引物各20 pmoles，50 mmol/L KCl，2.5 mmol/L MgCl2，100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，0.1%TritonX-100，50 μmmol/L dNTP，1.8 U HotStar Taq polymerase和5 μL DNA模版。PCR反應條件均為：94℃ 5 min;30個循環(huán) 55℃ 45 s，72℃60 s，94 ℃ 15 s，55 ℃ 45 s；72 ℃ 5 min。測序引物見表1。

表1 引物信息Tab.1 Information of primers

1.4 HPV16變異株進化學分析

PCR產(chǎn)物用SAP (Promega)和Exo I(Epicentre)進行純化后，通過ABI Big-DyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit DNA分析儀(ABI3130XL，上海天昊生物醫(yī)藥科技有限公司)進行測序，用Polyphred軟件對測序結果進行單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析，以及和HPV16歐洲標準株 (GenBank:NC_001526.2)以及其它典型的HPV16變異株進行比較 (GenBank:AF472508;HQ644238)，AA (GenBank:AF402678) 和AA1(GenBank:HQ644247)。進化樹通過軟件MEGA 6構建（圖 1）。

圖1 HPV16 E6進化學分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of HPV16 E6 gene

1.5 GenBank登錄號

本研究 HPV16 E6，E7基因測序序列在網(wǎng)站NCBIGenBank的登錄號分別為E6:KT959524-KT959566，E7:KT966608-KT966650。

2 結果

2.1 HPV16 E6和E7基因的突變分析

43例患者全長的HPV16 E6，E7基因完成測序后序列與歐洲標準株相比較，基因變異位點（表2）。

表2 HPV16 E6,E7基因變異位點Tab.2 Nucleotide sequence variations in HPV16 of E6,E7

在E6，E7的測序結果中，共發(fā)現(xiàn)6個突變位點，4個為錯義突變位點，2個為無義突變位點，分布在 E6基因的錯義突變位點分別為T178G，T295G，T350G，A647G 位于E7基因，引起氨基酸改變分別為天冬氨酸→谷氨酸(D25E)，天冬氨酸→谷氨酸(D64E)，亮氨酸→纈氨酸(L83V)，天冬酰胺→絲氨酸(N29S)。兩個無義突變均在E6基因，分別為nt 131，A →C，nt 96，G→A。HPV16 E6 最常見的突變位點是 T350G(34/43，79.1%)和 T295G(6/43，14.0%)。其中，T295G為一個新的突變位點，從未見報道。值得注意的是，6例T295G樣本均存在T350G突變。與E6相比較，E7基因更保守，僅在一例樣本的測序中發(fā)現(xiàn)A131C，T178G和A647G。

2.2 HPV16E6和E7的核苷酸序列進化樹分析

E6進化學分析表明（圖1），43例樣本當中，只有XJ-5屬于亞洲株，其余屬于歐洲株，其中，有6例獨立成一個分支，這與E6 T295G突變有關。E7進化學分析結果與E6的結果一致，只有XJ-5屬于亞洲株，其余均為歐洲株（圖2）。

圖2 HPV16 E7進化學分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of HPV16 E7 gene

3 討論

流行病學資料表明，相同的HPV類型的不同突變型具有生物學差異，可能會導致不同的致病風險[4]。因此，了解地區(qū)的HPV16變體的序列特征具有重要意義。多個研究報道，HPV16亞型在中國漢族女性中的分布高度相似，大多數(shù)為HPV16亞洲和歐洲型亞型[9，16-18]。但是，在維吾爾族婦女中HPV16亞型的分布還不清楚。我們的研究表明，新疆HPV16亞型最為普遍是歐洲株。相比之下，亞洲株普遍存在中國的其他地區(qū)，我們的結果沒有觀察到美洲-亞洲，中美洲，非洲亞型，維吾爾族婦女中亞洲株較少，這可能是因為維吾爾人的種族特征有關。結果提示，新疆維吾爾族婦女浸潤性宮頸癌的感染和發(fā)展可能和歐洲株有關。43例樣本包括HPV16歐洲原始株350T 8 例（8/43，18.6%），HPV16歐洲變異株 350G（L83V）34例（34/43，79.1%），亞洲變異株 1例（1/43，2.3%）。研究表明，HPV16 E6 L83V變種在摩洛哥婦女高度宮頸損傷中普遍存在，并且與宮頸癌的進展密切相關[19];該變體比HPV16歐洲原始株E6350T在宮頸疾病持續(xù)感染HPV16的婦女中以及宮頸癌的惡性進展中更為普遍[20-21]。此外，我們在HPV16歐洲株當中發(fā)現(xiàn)了6例新的核苷酸變異HPV16 E6T295G，以及350G共突變。我們的研究結果提示，T350G-T295G可能可以作為是HPV16歐洲變異株新疆變種對中國新疆HPV16變異型進行劃分。

研究表明，E7與E6相比更保守[22-23]。我們發(fā)現(xiàn)只有一例A647G（N29S）突變，這是一個熱點突變點，在亞洲女性中很常見。研究顯示，韓國婦女宮頸癌中常見E7 N29S，并且增加了患宮頸癌的風險[17，24]。

我們的研究結果顯示，在新疆維吾爾族婦女宮頸癌中HPV16歐洲變異株是最常見的類型，明顯不同來自中國其他地方。未來的研究在擴大樣本量的基礎上結合細胞功能學實驗來研究HPV16變體在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

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