阿爾茨海默病患者血液差異表達(dá)microRNA的生物信息學(xué)分析

董洪昌，王娜，黃瑾

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子832002）

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要以進(jìn)行性記憶損害、認(rèn)知功能下降、行為改變以及語言障礙為主要臨床表現(xiàn)，是老年癡呆中最常見的類型，主要病理改變是老年斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)的形成[1]。根據(jù)2016年《世界阿爾茨海默病報(bào)告》，截止到2016年，全球有四千七百萬人患有癡呆，而這一數(shù)字預(yù)計(jì)將會(huì)在2050年上漲到1.31億。該報(bào)告同時(shí)也指出，在阿爾茨海默病患者中，僅有40%-50%得到診斷，這主要與缺少廉價(jià)、高效、無創(chuàng)傷的診療手段相關(guān)。

MicroRNAs是一類由2123個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，不具有翻譯成蛋白質(zhì)的功能，由長度為6070個(gè)核苷酸的具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體microRNAs剪切而來。microRNAs主要功能是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，主要通過與其靶基因mRNA的3’-UTR端互補(bǔ)結(jié)合降解m RNA或是抑制mRNA的翻譯從而阻遏基因的表達(dá)[2]。作為一種小分子非編碼RNA，由于其片段短、分子量小，能夠正常通過體內(nèi)多種屏障結(jié)構(gòu)如血腦屏障，為腦等較封閉器官的功能研究、新標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)提供了新方向[3]。當(dāng)疾病發(fā)生時(shí)，病灶器官特異性microRNAs可大量釋放入血液，在多種疾病研究中都發(fā)現(xiàn)血液microRNAs含量較健康人群有明顯差異[4]。迄今為止，以基因組學(xué)方法為代表的新的科學(xué)技術(shù)手段為阿爾茨海默病的機(jī)制研究提供了大規(guī)模臨床數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)對(duì)這些臨床檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析，探討阿爾茨海默病發(fā)病特征及其機(jī)理，可為阿爾茨海默病的早期診斷、治療及實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)[5]。在本研究中，我們下載基因表達(dá)公共數(shù)據(jù)庫（GEODataSets）中一組利用高通量測序技術(shù)得到的阿爾茨海默病患者及其對(duì)照組microRNA表達(dá)譜。然后進(jìn)行了顯著表達(dá)差異的microRNAs篩選，探討可能成為診斷標(biāo)志物的microRNA及其在阿爾茨海默病中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1 材料與方法

1.1 阿爾茨海默病相關(guān)血液microRNA數(shù)據(jù)的獲取與差異表達(dá)篩選

我們在基因表達(dá)公共數(shù)據(jù)庫輸入關(guān)鍵詞“alzheimer disease[AllFields])ANDmicrorna[AllFields])AND("blood"[Subheadi ng]”，檢索得到表達(dá)譜 GSE46579。該表達(dá)譜包含48個(gè)阿爾茨海默病患者的樣本，由23名男性和25名女性，平均年齡（70.3±7.9）歲，簡易精神狀態(tài)檢查表（MMSE）評(píng)分18.7±3.5，22例對(duì)照組組樣本，由11名男性和11名女性，平均年齡（67.1±7.5）歲，MMSE評(píng)分29.3±1.2。利用R語言bioconduct or包進(jìn)行具有顯著性差異表達(dá)的microRNA 篩選（差異倍數(shù)≥1.5，P<0.05）[6]。

1.2 差異microRNA靶標(biāo)基因的預(yù)測

利用targetscan在線預(yù)測工具對(duì)所得到的差異microRNA進(jìn)行靶標(biāo)基因的預(yù)測[7]，以Cumulative weighted context++score≤-0.5為篩選標(biāo)準(zhǔn)獲得靶標(biāo)基因[8]。

1.3 差異microRNA靶標(biāo)基因GO分析以及KEGG通路分析

將1.2中所得靶標(biāo)基因上傳至DAVID在線工具，獲得所有基因的分子功能、細(xì)胞組分、生物學(xué)過程及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析結(jié)果。

1.4 差異microRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的篩選

在1.2靶標(biāo)基因預(yù)測的基礎(chǔ)上，將數(shù)據(jù)輸入cytoscape軟件構(gòu)建 icroRNA與基因之間的關(guān)系拓?fù)鋱D，之后將靶標(biāo)基因上傳至string獲得蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)并將其輸入至cytoscape中[9]，最后將二者合并。篩選聯(lián)通度≥35的節(jié)點(diǎn)作為關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[10]。

2 結(jié)果

2.1 原始數(shù)據(jù)平衡結(jié)果

首先我們對(duì)下載的數(shù)據(jù)進(jìn)行了平衡，原始數(shù)據(jù)對(duì)比平衡后的數(shù)據(jù)見（圖1），平衡后的數(shù)據(jù)中位數(shù)大致相同，提示我們平衡后的數(shù)據(jù)可用于差異表達(dá)分析。

圖1 原始數(shù)據(jù)平衡結(jié)果Fig.1 Balance of raw data

阿爾茨海默病患者血液中的microRNA表達(dá)與正常對(duì)照組存在較大差異，按照差異倍數(shù)≥1.5，P≤0.05的標(biāo)準(zhǔn)（圖 2）。

圖2 AD患者差異microRNA篩選標(biāo)準(zhǔn)Fig.2 The standard of different expression miRNA in AD patients

圖3中紅色代表上調(diào)，綠色代表下調(diào)，在阿爾茨海默病患者血液中篩選出表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的microRNA 共 9個(gè) （表 1） 其中 miR-144、miR-148a、miR-101-1、miR-101-2、miR-17、miR-660、miR-144上調(diào)，miR-112、mir-1285下調(diào)。分層聚類分析結(jié)果提示差異譜結(jié)果可靠（圖3）。

表1 阿爾茨海默病病人血液差異Tab.1 MicroRANs differential expression micoroRNAs of blood in AD pafients

圖3 差異microRNA熱圖分析Fig.3 Heat-map displaying differential expression microRNAs

2.2 差異microRNA靶標(biāo)基因的預(yù)測及其靶標(biāo)基因的GO分析和KEGG通路分析結(jié)果

通過targetscan預(yù)測得到靶標(biāo)基因共220條，GO分析結(jié)果顯示：在分子功能上有8個(gè)基因富集在小GTP酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（P<0.01），其余富集的分子功能及詳細(xì)信息（圖4）。KEGG通路分析結(jié)果顯示:8個(gè)基因富集在了FOXO轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)通路中（P<0.01），其余富集的信號(hào)通路及其具體信息（圖5）。

圖4 差異表達(dá)microRNA靶標(biāo)基因分子功能富集統(tǒng)計(jì)Fig.4 Molecular function enrichment statistics of differentially expressed microRNA target genes

圖5 差異microRNA靶標(biāo)基因信號(hào)通路富集統(tǒng)計(jì)Fig.5 Enrichment and statistics of differential microRNA target gene signaling pathways

2.3 差異microRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過合并microRNA與基因以及蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖6），我們構(gòu)建了上述差異基因在阿爾茨海默病中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過調(diào)節(jié)聯(lián)通度來篩選關(guān)鍵的 microRNA，我們將篩選的連通度（degree）提高 至 35 時(shí) ， 其 中 microRNA-148（degree=117）、microRNA-17 （degree=42）、microRNA-660（degree=35）圖3中標(biāo)黃色部分引起了我們的注意，當(dāng)刪除這3個(gè)節(jié)點(diǎn)后，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)渙散。提示我們這3個(gè)microRNA可能在該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起到了關(guān)鍵作用。

圖6 差異microRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Fig.6 Construction of the differential microRNA regulation network

3 討論[l8]

阿爾茨海默病作為一種慢性退行性疾病，尚缺乏有效診療手段，對(duì)其早發(fā)現(xiàn)早治療成為了亟待解決的難題。目前臨床對(duì)阿爾茨海默病的診斷主要依據(jù)患者臨床癥狀或表現(xiàn)、神經(jīng)心理學(xué)量表及影像學(xué)技術(shù)[11]。而用于輔助診斷的分子標(biāo)志物也大多集中在蛋白質(zhì)領(lǐng)域，例如腦脊液中的aβ42蛋白和血液Tau蛋白等指標(biāo)[11，12]，但由于血腦屏障對(duì)大分子物質(zhì)具有高度選擇性，蛋白質(zhì)能否跨過血腦屏障進(jìn)入血液循環(huán)存疑，而且目前腦脊液采集困難，因而限制了其在診斷阿爾茨海默中的作用。而microRNA因其分子片段短小，可調(diào)控多種基因表達(dá)的特點(diǎn)越來越多的受到人們的重視。

在本研究中，我們利用生物信息學(xué)技術(shù)篩選出AD病人樣本中9種可能作為診斷阿爾茨海默癥分子標(biāo)志物的microRNA，并對(duì)其靶基因進(jìn)行了聚類分析，發(fā)現(xiàn)這些靶基因與小G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控、心臟小梁形態(tài)、活性氧依賴性反應(yīng)、蛋白復(fù)合物的組裝、細(xì)胞鐵離子穩(wěn)態(tài)以及血管生成等功能相關(guān)。進(jìn)而預(yù)測了該類microRNA在人體中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和可能的機(jī)制。例如FoxO已經(jīng)被證實(shí)可以促進(jìn)Aβ蛋白造成的斑塊沉積[13-14]，而在本研究中miR-148a可能通過調(diào)控sos1、sos2等基因的表達(dá)從而調(diào)控FOXO信號(hào)通路以及ras信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)了阿爾茨海默病病理變化。其余包括Ras信號(hào)途徑、過氧物酶體轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、促性腺激素釋放激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、非小細(xì)胞肺癌、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等多種信號(hào)通路可能也參與了對(duì)阿爾茨海默病的調(diào)節(jié)，與血液中差異microRNA共同組成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證。

為了進(jìn)一步探討哪些microRNA在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，我們通過調(diào)節(jié)cytoscape中的節(jié)點(diǎn)連通度篩選到三條發(fā)揮核心作用的microRNA，即microRNA-148、microRNA-17、microRNA-660，這 將 對(duì)以后的驗(yàn)證及研究工作產(chǎn)生借鑒意義值得進(jìn)一步深入研究。microRNA-148和microRNA-660的研究主要是集中在癌癥領(lǐng)域，其中microRNA-148可能作為判斷癌癥腫瘤預(yù)后及進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)志物[15]，表明microRNA-148作為分子標(biāo)志物的可行性，但尚無研究表明二者在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用。已有研究顯示，microRNA-17可以通過靶向調(diào)控mTOR信號(hào)通路促進(jìn)軸突生長[16]。MicroRNA-148以及micro RNA-17均在炎癥的發(fā)生發(fā)展中具有非常重要的作用[17，18]，這提示阿爾茨海默病的發(fā)生可能與炎癥反應(yīng)有著密切的聯(lián)系。由于篩選方法的不同，本研究通過生物信息學(xué)篩選到的核心microRNA與該數(shù)據(jù)之前的篩選結(jié)果不同。但是我們應(yīng)用的bioconductor包是目前國際上公認(rèn)的篩選差異表達(dá)的常用工具，且我們對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了嚴(yán)格的質(zhì)量控制包括：平衡數(shù)據(jù)以及補(bǔ)缺等[19]。

總而言之，我們通過生物信息學(xué)篩選首次提出了microRNA-148等9種microRNA可能作為血液中阿爾茨海默癥的分子標(biāo)志物[l9]，同時(shí)也提出了microRNA-148、microRNA-17、microRNA-660 這 3 種microRNA可能作為核心microRNA參與了阿爾茨海默癥的發(fā)生發(fā)展，可作為AD診斷的候選標(biāo)志物。

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