生物低溫在生物樣本庫(kù)中的應(yīng)用

張園園，李靈溪（金西盟低溫生物研究院，國(guó)際低溫生物協(xié)會(huì)，北京 100070）

歐美已經(jīng)有很多大規(guī)模的樣本庫(kù)，而生物樣本庫(kù)近幾年在中國(guó)也開(kāi)展得如火如荼。隨著生物和醫(yī)學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，建立一個(gè)專業(yè)、高效及管理有序的生物樣本庫(kù)以存儲(chǔ)和利用人類豐富的樣本資源已成為眾多國(guó)家保存人類遺傳多樣性的重要方式。

而生物低溫在樣本庫(kù)中的應(yīng)用非常廣泛。低溫生物學(xué)是研究低溫對(duì)生物體所產(chǎn)生的影響及其應(yīng)用的學(xué)科，樣本通過(guò)在低溫環(huán)境下長(zhǎng)期存儲(chǔ)，在被需要時(shí)可以得到很好地復(fù)蘇，從而實(shí)現(xiàn)儲(chǔ)存樣本的應(yīng)用意義。本文針對(duì)生物低溫在樣本庫(kù)中的應(yīng)用進(jìn)行了介紹。

生物樣本庫(kù)是指一個(gè)集中保存用于疾病的臨床治療和生命科學(xué)研究的各種人類生物材料的生物應(yīng)用系統(tǒng)。生物樣本庫(kù)涉及的樣本類型及相關(guān)信息主要包括健康和疾病生物體的生物大分子、細(xì)胞、組織和器官等。根據(jù)存儲(chǔ)的樣本類型，生物樣本庫(kù)可分為基因庫(kù)、細(xì)胞庫(kù)、組織庫(kù)及器官庫(kù)等［1］。

生物樣本庫(kù)按照其流程及功能，通常分為3個(gè)部分：樣品處理、樣品存儲(chǔ)及樣本庫(kù)的信息化管理。

1 生物低溫在樣本處理中的應(yīng)用

迄今為止，人們采用的低溫保存方法都是將細(xì)胞或組織置于含抗凍劑的水溶液中進(jìn)行降溫和復(fù)溫。在細(xì)胞內(nèi)部也富含多組分的水溶液，因此，研究在冷凍過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)部的變化以及抗凍劑在此過(guò)程中的作用為樣本處理提供了強(qiáng)有力的保障。

真正實(shí)現(xiàn)低溫保存是在1949年，當(dāng)時(shí)生物學(xué)家在偶然的情況下發(fā)現(xiàn)加甘油的精子可以經(jīng)歷低溫而不死亡［2］。在1980年，科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞在液氮溫度下保存12年復(fù)溫后，沒(méi)有發(fā)生任何生化和功能上的差異，從而在實(shí)踐上證明了生物材料可以在低溫下長(zhǎng)期存活，但生物體在降溫和復(fù)溫過(guò)程中極易遭受損傷而死亡。此過(guò)程中包括3個(gè)主要的物理化學(xué)過(guò)程，即液體溶液的固化過(guò)程、固化溶液的融化過(guò)程和水分通過(guò)細(xì)胞膜的滲透過(guò)程。由此引起的溶液冰晶形成和生長(zhǎng)、冰晶的再結(jié)晶、高滲壓應(yīng)力和溶液的高濃度毒性等因素均會(huì)損傷細(xì)胞。因此，若不進(jìn)行特殊的控制，絕大多數(shù)生物體在經(jīng)歷低溫和復(fù)溫時(shí)會(huì)因損傷而死亡［3-4］。

不同的生物體要求不同的低溫處理程序，包括在保存溶液中加入和取走某些特殊的抗凍劑和特殊的降溫、復(fù)溫程序。目前，人們已經(jīng)能夠?qū)⑷梭w血液、精子、胚胎、胰島、角膜、皮膚、甲狀旁腺、白細(xì)胞及骨髓細(xì)胞等成功進(jìn)行低溫保存，但是基本都是簡(jiǎn)單的細(xì)胞，組織保存也是保存其中最主要的細(xì)胞，而對(duì)于更為復(fù)雜的細(xì)胞、組織和器官，甚至是人體等實(shí)現(xiàn)低溫保存，還需要更深入地研究低溫?fù)p傷機(jī)制，采用新的技術(shù)，探索新的保存程序。就如近期出現(xiàn)的國(guó)內(nèi)首例人體凍存的例子，1例49歲的癌癥患者死亡后，其遺體被程序降溫并用液氮凍存。這個(gè)案例在國(guó)內(nèi)引起了很大的轟動(dòng)，但據(jù)中科院專家表示，就目前的技術(shù)而言，凍存器官還未成功，凍存遺體可能很難實(shí)現(xiàn)。至于50年后，甚至100年后，該例患者是否會(huì)成功復(fù)活，卻為我們畫了一個(gè)問(wèn)號(hào)，也需要行業(yè)人士繼續(xù)對(duì)人體的凍存和復(fù)蘇有更加深入的研究。

1.1 低溫保存的兩種方法

1.1.1 慢速冷卻低溫保存法：到目前為止，成功的低溫保存大多采用“慢速冷卻”法，即程序降溫法。其具體步驟如下：先將細(xì)胞放在含有抗凍劑的溶液中進(jìn)行預(yù)處理，接著用程序降溫儀將上述細(xì)胞連同溶液以較慢的速度降溫；細(xì)胞外溶液中的水分結(jié)冰使溶液的濃度升高，胞內(nèi)的水分透過(guò)細(xì)胞膜向外滲出，細(xì)胞體積收縮，胞內(nèi)液體濃度提高；隨著溫度的下降，上述過(guò)程繼續(xù)進(jìn)行；到一定的低溫時(shí)，再快速降溫至液氮溫度，并長(zhǎng)期保存在此溫度下。

在這種慢速冷凍過(guò)程中，不同的細(xì)胞要求不同的最佳降溫速率。若降溫速度過(guò)快，則在胞內(nèi)形成冰晶，這些胞內(nèi)冰晶在復(fù)溫過(guò)程中會(huì)再結(jié)晶而使細(xì)胞受損；若降溫速率過(guò)慢，則細(xì)胞收縮過(guò)劇，細(xì)胞處在高濃度溶液中的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)引起損傷，這個(gè)過(guò)程是傳熱和滲透兩個(gè)因素的相互作用。最佳冷卻速率是指這兩個(gè)因素達(dá)到最好的配合［5］。不同類型細(xì)胞所需的冷卻速率也會(huì)有所不同。一般來(lái)說(shuō)，人體紅細(xì)胞在低濃度抗凍劑中的最佳冷卻速率約為100℃/min，哺乳類動(dòng)物胚胎的最佳降溫速率一般為0.2～0.8℃/min，而對(duì)于更大更復(fù)雜的細(xì)胞，則要求降溫速率更慢［6-7］。

1.1.2 玻璃化低溫保存方法：玻璃化是指液體轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)（玻璃態(tài)）的固化過(guò)程。玻璃化比普通的凍結(jié)固化方法引起的結(jié)構(gòu)變化要小，是一種比較理想的低溫保存途徑。

溶液玻璃化有兩個(gè)途徑：① 極大地提高冷卻速率；② 增加溶液濃度。如果將純水快速投入液氮，其降溫速率（103K/s）遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到將其實(shí)現(xiàn)玻璃化的降溫速率（109K/s），但在純水中加入溶質(zhì)，可升高玻璃化所需冷卻速率。當(dāng)抗凍劑溶液 （如甘油、DMSO和丙二醇等）濃度為40%～60%時(shí)，較容易形成玻璃態(tài)，但在室溫下，這樣高的濃度會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生劇烈損傷。因此，玻璃化研究的重點(diǎn)：① 尋求容易實(shí)現(xiàn)玻璃化并且對(duì)細(xì)胞損害較小的溶液；② 設(shè)法提高冷卻速率［1］。

1.2 低溫保存常用的抗凍劑和保存液：除了極簡(jiǎn)單的微生物、病毒和細(xì)菌等外，一般生物體在沒(méi)有添加抗凍劑的情況下經(jīng)歷低溫之后很難存活下來(lái)，所以生物體的低溫保存是離不開(kāi)抗凍劑的。合理選擇抗凍劑和配置合適的抗凍液，對(duì)低溫保存至關(guān)重要［8-9］。

1.2.1 低溫抗凍劑：目前的抗凍劑，按其能否滲透到細(xì)胞中可分為滲透性和非滲透型。① 滲透性抗凍劑：滲透性抗凍劑（甘油、二甲亞砜、乙二醇、乙酰胺和丙二醇等）多屬于低分子中性物質(zhì)，在溶液中易結(jié)合水分子，發(fā)生水合作用，使溶液的黏性增加，從而弱化了水的結(jié)晶過(guò)程，達(dá)到了保護(hù)的目的；② 非滲透型抗凍劑：非滲透型抗凍劑（聚乙烯吡咯酮、蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇、白蛋白和羥乙基淀粉等）能溶于水，但不能進(jìn)入細(xì)胞，使溶液呈過(guò)冷狀態(tài)，即可在特定溫度下降低溶質(zhì)濃度，從而起到保護(hù)作用。

1.2.2 保存液：為了保持立體細(xì)胞、組織和器官的活力，延長(zhǎng)其壽命，提供其所需的營(yíng)養(yǎng)和生活環(huán)境，研究人員模擬其體液和胞內(nèi)液，配制了各種各樣的保存液。此外，在低溫冷凍前的預(yù)處理中，還常常用保存液稀釋抗凍劑，形成所需的抗凍液濃度。

1.3 程序降溫儀及其應(yīng)用：在給樣本進(jìn)行降溫時(shí)，要考慮很多因素，如降溫速率、控溫的溫度范圍、控溫的準(zhǔn)確度及被冷卻樣品的數(shù)量和形狀等。因此，程序降溫儀應(yīng)運(yùn)而生。統(tǒng)一的冷卻速率是從室溫開(kāi)始每分鐘降1℃直到降至-80℃，再放入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期存儲(chǔ)，這適用于大多數(shù)細(xì)胞。

2 生物低溫在樣品存儲(chǔ)中的應(yīng)用

在生物樣本庫(kù)中，通常需要將樣本在低溫條件下存儲(chǔ)，其原因在于樣本自身生化反應(yīng)在低溫環(huán)境中大大降低，從而提高樣本中各種成分的穩(wěn)定性。但由于生物樣本種類繁多（主要分為五大類：組織樣本、血液樣本、核酸和蛋白質(zhì)樣本、凍存的細(xì)胞樣本、組織切片和組織芯片），因此儲(chǔ)存方法也不盡相同。

通常經(jīng)過(guò)甲醛溶液固定的石蠟包埋組織及組織切片可儲(chǔ)存于低于27℃的環(huán)境下，但要控制蟲患和濕度。

冰凍組織切片或者用于DNA和RNA提取的冰凍組織，液體樣品如全血、血清、血凝塊、非淋巴細(xì)胞和血漿樣本應(yīng)儲(chǔ)存在-80℃。而長(zhǎng)期儲(chǔ)存的新鮮冰凍組織和優(yōu)化的切片溫度（optimum cutting temperature， OCT）包埋冰凍組織、血沉棕黃層和白細(xì)胞等長(zhǎng)期儲(chǔ)存的細(xì)胞系應(yīng)儲(chǔ)存在液氮中［10］。

液氮罐一般可分為儲(chǔ)存罐和運(yùn)輸罐。儲(chǔ)存罐主要用于室內(nèi)液氮的靜置儲(chǔ)存，不宜在工作狀態(tài)下遠(yuǎn)距離運(yùn)輸使用。運(yùn)輸罐為了滿足運(yùn)輸?shù)臈l件，專門做了防震設(shè)計(jì)，除了可靜置儲(chǔ)存外，還可在充裝液氮狀態(tài)下運(yùn)輸使用，長(zhǎng)途運(yùn)輸樣本的液氮罐一般選用可以航空運(yùn)輸?shù)母墒竭\(yùn)輸罐。

2.1 液氮液相儲(chǔ)存（-196℃）：液態(tài)氮能使樣本維持在-196℃的低溫，是目前技術(shù)條件下能達(dá)到的最佳樣本庫(kù)保存溫度。液氮容器內(nèi)可裝滿液氮，儲(chǔ)存更多樣本，但對(duì)盛裝樣本的凍存管等耗材也有嚴(yán)格要求。與液氮?dú)庀鄡?chǔ)存相比，液態(tài)氮更易實(shí)施，但由于液態(tài)氮能滲透到凍存管內(nèi)，采用液相液氮罐儲(chǔ)存樣本時(shí)，在使用前必須對(duì)凍存管進(jìn)行嚴(yán)格的測(cè)試。

2.2 液氮?dú)庀鄡?chǔ)存（-180℃）：一般來(lái)說(shuō)液氮的氣相儲(chǔ)存優(yōu)于液相儲(chǔ)存，因?yàn)闅庀嗄軌驅(qū)囟染S持在玻璃化溫度以下（-136℃），又避免了液相儲(chǔ)存中固有的安全問(wèn)題，1995年英國(guó)血庫(kù)曾發(fā)生過(guò)轟動(dòng)一時(shí)的液氮凍存中破裂的血袋之間乙型肝炎病毒交叉污染事件。液氮?dú)庀嗍歉軓V泛認(rèn)可的方法。美國(guó)國(guó)家癌癥協(xié)會(huì)、美國(guó)血庫(kù)協(xié)會(huì)、樣本庫(kù)協(xié)會(huì)等機(jī)構(gòu)的樣本庫(kù)操作規(guī)范文件中均推薦使用液氮?dú)庀嚅L(zhǎng)期儲(chǔ)存組織樣本。液氮?dú)庀嗍窃谝旱萜髦屑尤胍欢恳旱?，而樣本?chǔ)存在容器中不與液氮直接接觸。液氮容器內(nèi)氣相區(qū)間的溫度最高（容器口處）不高于-140℃（一般可達(dá)到-180℃）。較少的樣本使用提桶存儲(chǔ)，樣本量大時(shí)盡量使用適配凍存盒。氣相液氮罐監(jiān)控要求嚴(yán)格，但由于其具有取放樣本便捷和樣本不易落入液氮罐發(fā)生交叉污染的特點(diǎn)，研究人員越來(lái)越多地采用了此類液氮罐。

國(guó)際上氣相液氮罐廠家不多，有美國(guó)的MVE CHART和GOLD SIM，法國(guó)的AIR LIQUIDE（圖1）等，均是氣相液氮罐的良好選擇。當(dāng)然，還有一些全自動(dòng)液氮罐的廠家，比如BioArchive和Askion等，但這些廠家的最高產(chǎn)品溫度在-150℃以上，且不能對(duì)樣品進(jìn)行單管提取，會(huì)對(duì)樣品的存儲(chǔ)溫度造成隱患，還會(huì)在提取樣品時(shí)對(duì)目標(biāo)樣品之外的樣品造成反復(fù)凍融，因此也不是樣本儲(chǔ)存的理想選擇。仍需研制出全自動(dòng)化單管提取的氣相液氮罐，既保證樣本儲(chǔ)存溫度，也確保了提取樣本時(shí)不會(huì)反復(fù)凍融，保證樣本的生物活性。

圖1 氣相液氮罐

樣本庫(kù)中的樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，樣本反復(fù)凍融會(huì)加快生物大分子物質(zhì)的降解，嚴(yán)重影響樣本質(zhì)量。

在普通的氣相液氮罐存取樣品時(shí)，整個(gè)凍存架會(huì)被取出暴露在常溫下，目的樣品之外的其他樣品在高溫下復(fù)溫，凍存架被再次放入液氮罐中時(shí)，樣品又一次冷凍。樣品幾次反復(fù)凍融，樣品質(zhì)量堪憂。因此在凍存前，最好將樣本裝成小份進(jìn)行儲(chǔ)存，以便單次樣本取用。另外，也可使用液氮操作平臺(tái)來(lái)確保操作過(guò)程中凍存架中所有樣本的環(huán)境溫度（圖 2）。

圖2 液氮操作平臺(tái)

液氮操作平臺(tái)是一個(gè)縮小版的氣相液氮罐（圖2），溫度可保持在-180℃以下。當(dāng)樣本所在的樣品凍存架從氣相液氮罐中取出時(shí)，可將整個(gè)凍存架立刻放入液氮操作平臺(tái)中，在操作平臺(tái)內(nèi)部進(jìn)行樣本操作。相比于常規(guī)的常溫環(huán)境操作，液氮操作平臺(tái)確保了所有樣本的操作溫度，避免了樣本的反復(fù)凍融。

生物樣本庫(kù)的最終目的是樣品的實(shí)際應(yīng)用，因此，樣品能否在長(zhǎng)期儲(chǔ)存后恢復(fù)其生物活性是樣本庫(kù)儲(chǔ)存樣品的最終意義。使用樣本時(shí)，需要采取必要的融化和復(fù)蘇。儲(chǔ)存的溫度越低，所需的時(shí)間越長(zhǎng)。當(dāng)從冷凍狀態(tài)中解凍的時(shí)候，過(guò)程不宜太長(zhǎng)，復(fù)溫速度越快越好，最好的方式是37℃水浴，于1～2分鐘內(nèi)完成復(fù)蘇。目前的復(fù)溫方法包括水浴和金屬浴。近年來(lái)，研究人員開(kāi)始摸索利用微波加熱爐作為復(fù)溫工具，直接在生物材料內(nèi)部進(jìn)行加熱，便于溫度控制。但也帶來(lái)許多新問(wèn)題，如生物體內(nèi)部的局部過(guò)熱造成細(xì)胞死亡或微波對(duì)所保存的生物材料有無(wú)不利影響等。這些問(wèn)題仍未解決，需要進(jìn)一步研究。細(xì)胞復(fù)蘇后經(jīng)過(guò)一些處理即可通過(guò)二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)進(jìn)行擴(kuò)增，最終用于實(shí)驗(yàn)。

3 生物低溫在樣本庫(kù)的信息化管理中的應(yīng)用

樣品在進(jìn)行程序降溫后放入氣相液氮罐中進(jìn)行長(zhǎng)期存儲(chǔ)的過(guò)程中，需對(duì)樣本庫(kù)進(jìn)行不間斷地監(jiān)控，包括儲(chǔ)存室的溫度、濕度、氧氣濃度、二氧化碳培養(yǎng)箱的溫度、二氧化碳濃度、超低溫冰箱的溫度以及液氮罐的溫度和液位等，以確保樣本儲(chǔ)存的溫度安全以及樣本庫(kù)的環(huán)境安全，我們稱之為中央控制系統(tǒng) （圖3）。當(dāng)溫度和液位等參數(shù)超出設(shè)定范圍時(shí)，中央控制系統(tǒng)會(huì)給樣本庫(kù)管理人員發(fā)送短信、電話和郵件等報(bào)警以提醒管理人員。

中央控制系統(tǒng)是樣本庫(kù)最重要的監(jiān)控手段，保證樣本庫(kù)的所有儀器有條不紊，同時(shí)也大大保障了樣本的安全性。另外，生物樣本庫(kù)還可選用全自動(dòng)細(xì)胞工廠來(lái)進(jìn)行細(xì)胞的儲(chǔ)存和制備，確保細(xì)胞的批量一致性，并確保樣本的安全有效無(wú)污染。如需在潔凈條件下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行操作，也可選擇GMP移動(dòng)車間，無(wú)需在原有樓層中進(jìn)行無(wú)菌管道設(shè)計(jì)，在GMP移動(dòng)車間內(nèi)完成所有細(xì)胞無(wú)菌操作和制備，節(jié)省樣本庫(kù)裝修運(yùn)營(yíng)成本。

4 小 結(jié)

圖3 中央控制系統(tǒng)

本文主要論述了生物低溫在生物樣本庫(kù)主要流程中的應(yīng)用以及所需設(shè)備的原理和適用范圍。生物樣本庫(kù)為生物樣本提供一個(gè)穩(wěn)定安全的儲(chǔ)存環(huán)境，生物低溫幫助我們探索生物的無(wú)限可能性。當(dāng)然，目前對(duì)生物低溫的研究還是冰山一角，只針對(duì)于基礎(chǔ)的細(xì)胞和一些簡(jiǎn)單的組織器官，對(duì)于復(fù)雜的系統(tǒng)，甚至人體的研究仍需廣大同仁更深一步的研究。