移植心臟病理學及其進展

王紅月，李莉（中國醫(yī)學科學院阜外醫(yī)院病理科， 北京 100037）

經頸靜脈心內膜心肌活檢術（endomyocardial biopsy， EMB）自20世紀70年代由美國斯坦福大學外科醫(yī)生Cave 和病理學家Billingham 發(fā)明以來，已成為標準的移植心臟排斥反應監(jiān)測方法并沿用至今［1］。雖然心臟移植總的生存率在不斷提高，但是移植物衰竭、惡性腫瘤和慢性移植心臟血管病等在死因構成中的位置仍高居不下［2］。人們對排斥反應尤其是抗體介導的排斥反應 （antibodymediated rejection， AMR）的認識還在逐步深入，諸多臨床診斷與管理問題還有待解決［3-4］。目前，心臟移植手術已成為終末期心臟病患者的有效治療方法［5-6］。心臟移植已不僅是一項高水平的外科手術， 而是一項包含病理醫(yī)生在內的、涉及多學科和多專業(yè)的復雜的治療過程。本文結合心臟移植相關臨床研究及國際心臟和肺移植學會（International Society for Heart and Lung Transplantation， ISHLT）有關共識及病理標準，就病理方面的進展及其面臨的挑戰(zhàn)作簡要的介紹。

1 急性細胞性排斥反應（acute cellular rejection，ACR）

ACR是人們最早認識的排斥反應，而且是主要依據(jù)活檢診斷的排斥反應。1990年，在Billingham等［7］的主持下根據(jù)斯坦福大學的經驗形成了國際統(tǒng)一的病理診斷標準（ISHLT 1990標準），2004年ISHLT對1990年標準進行了修訂［8］。

ISHLT 2004標準中有關的修訂主要體現(xiàn)在：① 簡化了ACR的病理分級（表1）；② 取消了ISHLT1990的ACR 2級，將其并入ACR 1R級，該級別是否保留存在一定爭議，因為部分移植中心把ACR 2級作為移植排斥反應的終點事件并給予強化免疫抑制治療等；③ 修改了關鍵的病理用詞，將原來的心肌損害和心肌壞死修訂為心肌損傷，并給出了明確的病理學定義。心肌損傷包含多種心肌形態(tài)改變，例如心肌被侵占、心肌細胞結構變形或脫失和其他可逆性或不可逆性的細胞損傷。之前的Banff會議也認為心肌實質性壞死較為罕見，而構筑改變才是心肌損傷的標志［9］。值得注意的是，2013年，ISHLT指出ACR的診斷仍要基于常規(guī)組織病理學的改變，當合并AMR時，應避免依據(jù)免疫病理學中CD3+T細胞和CD68+單核細胞的多少做出過高級別的診斷［10］。

表1 急性細胞性排斥反應的病理分級（ISHLT）［8］

好的診斷標準應是簡單的且可重復性較高的，ISHLT 2004標準也期望通過減少級別數(shù)量來減少觀察者之間的差異，提高病理分級的可重復性。但是近年的兩項研究發(fā)現(xiàn)，ACR相關炎癥和心肌損傷判定的主觀性限制了分級的高重復性和高可信度。一項評價ISHLT標準可重復性的歐洲多中心病理研究發(fā)現(xiàn)，2004年標準的Kappa值（可重復性指數(shù)）較1990年標準只有小量提升，在統(tǒng)計學上并無顯著性差異［11］。另一項臨床研究（CARGO Ⅱ）發(fā)現(xiàn)，雖然專家組與各移植中心的ACR診斷一致率達71%，但是多數(shù)為無排斥反應的0級，而≥2R診斷的一致率卻不足1/3。該研究質疑基于活檢的ACR，尤其是需要采取臨床治療決策的≥2R級的ACR病理診斷可信度，該研究提出了改進或者替代基于活檢的ACR診斷標準的必要性［12］。

2 抗體介導性排斥反應

2.1 概念與檢出率：AMR舊稱體液性排斥反應或血管性排斥反應，是約40年前由美國猶他大學病理醫(yī)生Hammond首先觀察到并命名的病理現(xiàn)象，在無ACR的毛細血管壁上觀察到抗體和補體沉積［13］。其發(fā)生與常規(guī)免疫抑制治療無關，是導致ACR（即當時所謂“活檢陰性”）的移植心臟功能衰竭的主要原因（約占10%～20%）［14］。20世紀90年代報道的AMR檢出率差別巨大（3%～85%）與采用的不同診斷標準有關。當血管壁C4d沉積作為唯一標準時，AMR的檢出率可達35%～71%，當采用臨床〔移植心功能衰竭和血清供者特異性抗體（donor specific antibody，DSA）陽性〕與活檢病理學相結合的ISHLT 2004標準時，AMR檢出率下降到3%［4］。

2.2 AMR的病理診斷：ISHLT在2004年建議統(tǒng)一采用AMR的名稱，并制定了診斷標準，該標準提出了臨床移植心功能衰竭和血清DSA陽性對于AMR診斷的必要性，并定義了AMR的組織病理學和免疫病理學發(fā)現(xiàn)，確定以“AMR 0”和“AMR 1”分別表示無和有AMR的診斷［8，15］。但是，ISHLT 2004標準發(fā)表后，陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)無癥狀（無移植心功能衰竭）而活檢證實的AMR與后續(xù)的死亡和較重的慢性移植心血管病密切相關，而且由于供者心臟的吸附作用和非人類白細胞抗原（human leukocyte antigen， HLA）抗體的存在，AMR不總是伴有血清DSA的升高。ISHLT最終在2011年重新定義了AMR，并在2013年推出了新的AMR病理診斷及其分類方案（表 2，表 3）［10，16］。

表2 心臟AMR的組織病理學標準（2013年ISHLT）［10］

表3 心臟AMR的病理診斷分類方案（2013年ISHLT） ［10］

ISHLT 2011年有關AMR共識中最突出的變化是將原2004標準中有關臨床移植心功能衰竭和血清DSA陽性從AMR診斷的必要條件中刪除，強調了基于活檢的組織病理學和免疫病理學標準的重要性［16］。ISHLT 又于2013年提出“病理學的抗體介導性排斥反應”（pAMR）的概念，并細化了pAMR的分類（表3）。ISHLT還在病理技術和活檢判讀方面提出了規(guī)范性建議，如免疫病理學必須在陽性和陰性對照中進行抗體驗證試驗；強調C4d判讀必須在完整的心肌組織中進行，須排除那些在小靜脈、小動脈或微動脈內皮細胞、Quilty病變和心肌瘢痕中的血管、心內膜下結締組織和壞死心肌上的C4d沉積；在免疫病理中明確了分別以50%和10%為判斷C4d和CD68陽性與否的半定量標準，同時對于C4d為10%～50%的局灶表達視為陰性，但應提醒臨床密切隨訪［10］。

2.3 AMR的臨床分期：AMR的臨床表型多樣，既可出現(xiàn)急性和嚴重的移植心功能異常，也可為隱匿的亞臨床表現(xiàn)而進展成移植心臟血管?。╟ardiac allograft vasculopathy， CAV）即慢性排斥反應。AMR臨床過程可分為四期，即亞臨床期、 臨床前期、 急性臨床期和慢性期，各期具有不同的臨床和病理特點（表4）［4］。研究表明，臨床前AMR是晚期移植心功能衰竭的主要原因，并與CAV密切相關，臨床前的AMR可發(fā)生在移植心功能衰竭數(shù)年前，提示早期的監(jiān)測和預防的重要性［17］。另外，有研究注意到心臟移植1年以后發(fā)生的AMR（又稱晚期AMR），尤其是無癥狀的晚期AMR預后較差，3個月病死率為40%，其中突發(fā)性CAV較為常見［18］。AMR的臨床分期在幫助我們認識AMR的臨床多樣性的同時，也對如何將血清學和臨床表現(xiàn)與活檢發(fā)現(xiàn)相結合來診斷AMR提出了挑戰(zhàn)［4］。近幾年，Coutance等［18］提出了應用移植心功能異常/衰竭、DSA陽性和組織學證據(jù)3項標準中至少滿足2項來診斷AMR的新模式，它不同于ISHLT 2004或ISHLT 2013 AMR標準，將促進對AMR的認識［19］。

表4 AMR的臨床分期（AHA 2016）

2.4 AMR活檢時機與臨床處理指證：過去面對多樣的AMR臨床表型，缺乏統(tǒng)一的診斷和治療指南。美國心臟協(xié)會（American Heart Association， AHA）在2016年發(fā)布的科學聲明中提出了AMR活檢時機的循證醫(yī)學建議：術后前90天或臨床懷疑AMR時，必須活檢行C4d和/或C3d免疫病理學評價；而術后3個月、6個月和12個月常規(guī)活檢監(jiān)測、發(fā)現(xiàn)AMR陽性后隨訪、術后任何時間臨床懷疑AMR而無ACR證據(jù)，均可行活檢C4d和/或C3d的免疫病理學評價。同時，AHA 還提出了啟動AMR治療的建議：移植物功能衰竭無論有無病理學發(fā)現(xiàn)、pAMR 2合并DSA陽性但缺乏移植物衰竭、 pAMR 3合并無論移植心功能狀況和DSA陽性與否［4］。從中可以看出，明確的病理診斷或明顯的心功能受損是臨床啟動治療的關鍵。

2.5 C4d陰性的AMR：C4d陰性的AMR是一種與DSA有關但不依賴補體激活的微血管炎病變，是NK細胞和/或巨噬細胞介導的新的免疫損傷機制［20］。移植腎活檢中首先觀察到C4d陰性的AMR，表現(xiàn)為腎小球炎和腎小管周毛細血管炎。研究發(fā)現(xiàn)，腎移植中C4d陽性與C4d陰性的AMR組織病理學改變相似，且均可發(fā)生于移植術后不同時期，雖然這種排斥類型占AMR的比例不足20%，但是2013年的Banff會議已決定將腎移植C4d陰性的AMR納入修訂后的Banff標準［21］。而在心臟移植方面，2013年的Banff會議并未急于將pAMR1 （H+）等同于C4d陰性的AMR，因為有關于pAMR1 （H+）的研究有限，其病理機制與臨床意義尚不清楚。會議提醒病理學專家在診斷移植心臟AMR時仍要重視C4d等免疫病理結果，無論DSA和/或移植物衰竭存在與否［21］。

3 CAV

3.1 發(fā)病率及影響因素：CAV是移植心臟慢性排斥的主要表現(xiàn)，是一種發(fā)生在移植心臟血管的進行性內膜增厚疾病，可導致管腔狹窄或閉塞，是晚期移植心衰竭和受者死亡的主要原因。心臟移植術后1年、2年和4年通過冠狀動脈血管造影的CAV檢出率分別為11%、22%和45%［22］，雖然免疫抑制策略的改進已使ACR明顯減少，但是近年報道的CAV檢出率并未降低［2］。中國臺灣一項病例研究發(fā)現(xiàn)移植術后4年CAV累積的檢出率僅為2%，推測其低檢出率可能與該組較低的種族異質性和較少的HLA錯配有關［23］。CAV的病理機制包含免疫因素和非免疫因素，前者主要是供受體之間HLA的兼容性、細胞性排斥反應和體液性排斥反應；后者包括老年供者、缺血/再灌注損傷、高脂血癥和巨細胞病毒感染等［24］。

3.2 病理特征：CAV病變彌漫，可累及從心表冠狀動脈到心壁心肌內的冠狀動脈終末分支。有研究將心表冠狀動脈及其較大的心壁內血管受累稱大血管病，而將較小的心壁內血管受累稱微血管病。CAV的主要病理改變包含內膜纖維肌性增生、血管炎和動脈粥樣硬化3種類型，CAV有別于通常的動脈粥樣硬化，病理上類似于支架內再狹窄改變［25］。CAV的微血管病不同于心表冠脈改變，是一種免疫損傷，病理可見內膜纖維細胞性增生、中膜平滑肌細胞增生或肥厚、內膜炎［26-28］。在部分病例中，CAV僅累及較小的心壁內冠狀動脈分支，冠脈造影與血管內超聲多不可及，但這卻可由EMB予以早期診斷［24］。隨著對AMR研究的深入，AMR相關的微血管炎癥及其在CAV病理發(fā)生和臨床診斷中的作用已引起重視［27］。

3.3 活檢的診斷價值：CAV的臨床診斷和分級主要依賴于心表冠狀動脈血管造影和心功能評價結果，目前還缺乏評價微血管病的方法或技術［29］。移植術后常規(guī)EMB自然成為診斷移植物微血管病的候選工具，但是研究發(fā)現(xiàn)EMB診斷CAV的敏感度有限，活檢組織中微血管偏小偏少，而CAV典型的增生性改變極少出現(xiàn)在100 μm以下的微血管［24］。另外，一項大樣本的EMB回顧性研究顯示，以中膜肥厚為主的微血管狹窄或微血管病與移植術后總生存率和致死性心臟事件發(fā)生率有關，但是卻與心表冠狀動脈CAV無相關性，微血管病似乎是一種獨立病變［26］。EMB中心肌缺血性改變也是反映CAV的指標之一，但是研究表明CAV極少出現(xiàn)較大片心肌梗死，對照尸檢或再移植病理發(fā)現(xiàn)，EMB檢出CAV相關心肌缺血的敏感度僅為21%［24］。鑒于微血管病尚無統(tǒng)一定義，相關病變缺乏特異性（部分正常血管也可出現(xiàn)類似改變），EMB診斷的敏感性和重復性也有明顯的限制，所以ISHLT 2010有關CAV共識中并未將EMB微血管改變納入CAV及其嚴重程度的判別標準［29］。

4 原發(fā)性移植心功能衰竭

移植心功能衰竭是當今心臟移植面臨的最大威脅，占術后早期死亡數(shù)量的66%，也占中晚期死亡的20%～30%［2］。研究推測移植心功能衰竭多數(shù)為無明確或單一病因學發(fā)現(xiàn)的原發(fā)性移植心功能衰竭，排除了肺動脈高壓、超急性排斥反應及外科手術并發(fā)癥等常見原因［30］。心肌缺血/再灌注損傷、心肌壞死和多灶心肌水腫出血是其主要尸檢發(fā)現(xiàn)，而ACR和AMR不足10%。臨床實踐中，原發(fā)性移植心功能衰竭多依靠影像學和血流動力學數(shù)據(jù)診斷，一般不借助病理學檢查結果。對于術后48小時內發(fā)生的早期移植心功能衰竭，往往由于病情危急，不適宜EMB診斷，除非免疫學和影像學高度懷疑超急性排斥反應［30］。原發(fā)性移植心功能衰竭涉及供者、受者和外科手術操作等多方面的危險因素。其中，供心不合格與原發(fā)性移植心功能衰竭關系密切，而臨床對供者心臟結構和功能的準確判斷困難，供心短缺和邊緣心的應用又會增加不合格的風險。供心活檢和廢棄供心的病理檢查可指導臨床更好地進行供體選擇。另外，不同病種的受者有不同的移植心功能衰竭發(fā)生率，加之復發(fā)性疾病也影響長期生存，有報道顯示，心臟移植病例術前臨床診斷與術后病理診斷有30%的不符合率也提醒我們可選擇性開展移植術前活檢［30-31］。

5 無創(chuàng)檢查可否替代活檢監(jiān)測

EMB在了解移植心臟的排斥反應機制和提高生存率方面的作用巨大、無可非議。但是也面臨活檢陰性或無需處理的排斥增多和無創(chuàng)檢查快速發(fā)展的挑戰(zhàn)。

EMB檢出的排斥逐年下降，臨床獲益減少，目前的應用比例也有減少的趨勢。最近的ISHLT心臟移植注冊數(shù)據(jù)顯示，由于免疫抑制藥物和策略的改進，術后1年ACR總檢出率已從心臟移植早期的70%下降到如今的25%［2］。較重的ACR 3R檢出率僅為2.49%，而臨床無癥狀患者的排斥反應檢出率僅為1.74%［32-33］。國人最大組心臟移植活檢病理也有類似的低檢出的報道［34］。另外，無癥狀的活檢排斥反應是否需要強化治療還有爭議，還缺乏抗排異治療改善移植物功能的組織學證據(jù)［35］。加之活檢的有創(chuàng)性、活檢診斷的主觀性和較低的診斷一致性導致部分移植中心開始重新評估EMB的必要性，尋找可替代活檢的無創(chuàng)檢查手段［12，32，36］。

心臟磁共振顯像是無創(chuàng)檢查中最具潛力的檢測手段。2015年，Butler等［37］采用聯(lián)合參數(shù)和閾值分析方法獲得良好的預測活檢證實的急性排斥反應結果，其較高的敏感度和較好的陰性預測值引人注目。由于磁共振的無創(chuàng)、無輻射及可重復多次檢查的優(yōu)勢，極有可能取代EMB成為移植術后排斥反應的主要監(jiān)測方法。但是與活檢病理診斷相比，磁共振具有較低的特異性（78%比98%）和較低的陽性預測值（59%比93%），是其臨床應用的最大限制。

血清DSA水平、臨床血流動力學和心肌活檢病理學是AMR診斷的三大指標，血清DSA水平還與CAV和受者存活率密切相關［38］。最新的研究顯示DSA升高預測AMR的敏感度和陰性預測值高達92.6%和98.5%，但是DSA的診斷特異性僅為62.2%，陽性預測值更是低至24.0%［39］。AHA 2016年的科學聲明認為，血清DSA強度測定和解釋標準還需要進一步驗證，DSA單項陽性不能診斷AMR，只有同時存在C4d補體沉積和移植物功能衰竭才能支持AMR的診斷［4］。

基因表達譜測試（gene expression profiles，GEP）是針對ACR中炎癥因子設計的。兩項應用商品化GEP工具（AlloMap，美國CareDx公司）的研究發(fā)現(xiàn)，GEP較低的陽性預測值和較高的陰性預測值導致ACR的檢出偏低，研究者認為GEP可作為良好的ACR排除工具［40］。最近，基于活檢組織的GEP分析和驗證試驗發(fā)現(xiàn)NK細胞/內皮活化/巨噬細胞γ-干擾素相關基因的轉錄水平與活檢診斷的AMR相關，并與微血管損傷程度和疾病活動性有關，顯示出了GEP的更廣泛的應用前景［41］。另外，一項基于單核苷酸多態(tài)性的供者來源的無細胞 DNA（donor-derived cell-free DNA， dd-cfDNA）與EMB對比的前瞻性研究顯示，dd-cfDNA對AMR診斷尤其是早期診斷的具有一定作用［42］。

無創(chuàng)檢查由于特異性較低，且不能揭示具體的病因，目前尚不能替代EMB。有研究建議，對于無癥狀的患者，可通過敏感性較高的GEP、dd-cfDNA、超聲心動圖和磁共振顯像篩查，并作為選擇性EMB的依據(jù)。對于有癥狀的患者，推薦立即進行EMB，而無創(chuàng)檢查可作為重要的隨訪工具［43］。

6 總 結

目前，EMB仍然是臨床診斷ACR和AMR的主要手段和金標準。無創(chuàng)檢查的高敏感性和活檢診斷的高特異性結合是臨床監(jiān)測排斥反應的方向。應認識到AMR診斷的復雜性，重視臨床前AMR及C4d陰性AMR的研究。心臟移植病理學除針對術后活檢監(jiān)測外，還應在術前受者原發(fā)病診斷和供者選擇方面發(fā)揮作用，進一步降低CAV和移植心功能衰竭的發(fā)生率，提高移植心臟和受者的長期生存率。