駝乳預(yù)防小鼠急性酒精性肝損傷的代謝組分析

明 亮，賽 娜，其布勒，郝世奇，吉日木圖*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特 010018 2 蘇尼特右旗畜牧工作站 內(nèi)蒙古錫林郭勒盟 011299）

酒精性肝病（Alcoholic liver disease，ALD）是由于短時(shí)間內(nèi)大量攝入酒精或長(zhǎng)期大量飲酒導(dǎo)致的中毒性肝損傷，是世界范圍內(nèi)發(fā)病率很高，甚至導(dǎo)致死亡的疾病之一。 ALD 臨床表現(xiàn)為酒精性肝損傷、酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌[1]。ALD 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要有乙醇及其毒性代謝物產(chǎn)物直接損害肝細(xì)胞[2]，體內(nèi)活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）的增加和/或抗氧化劑水平降低[3]，肝細(xì)胞中脂肪的積累[4]，Kupffer 細(xì)胞誘發(fā)炎癥等[5-6]，其中氧化應(yīng)激和炎性損傷被普遍認(rèn)為在ALD 的發(fā)生和進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用[7]。 目前使用的治療肝損傷藥物，常伴隨有副作用?；贏LD 的發(fā)病機(jī)制，探索抗炎、消除氧化應(yīng)激相關(guān)的功能性食品、天然奶源或活性肽提取物，進(jìn)而抑制酒精誘導(dǎo)的肝臟組織氧化應(yīng)激和炎性損傷，被認(rèn)為是有效緩解酒精性肝損傷的方法。

駝乳（Camel milk，CM）是戈壁荒漠地區(qū)牧民的主要乳源，富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且含有多種生物活性成分，具有保健功能而被廣泛食用。 目前，駝乳在游牧地區(qū)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，甚至在一些科學(xué)研究中被指出具有良好的保肝、護(hù)肝的作用。王朝霞等[8]研究表明，駝乳可減輕肝臟中的炎癥應(yīng)答，改善氧化損傷作用，并通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡來(lái)保護(hù)四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的肝損傷。 Ming 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，駝乳可通過降低乙醇對(duì)肝臟氧化損傷作用，緩解促炎因子介導(dǎo)的炎癥應(yīng)答，改善肝臟中脂質(zhì)蓄積和腸道微生態(tài)平衡，進(jìn)而對(duì)酒精性肝損傷起到保護(hù)作用。 Korish 等[10]研究表明，駝乳能夠減少高膽固醇飲食的大鼠肝臟內(nèi)脂肪的堆積和炎癥浸潤(rùn)，降低肝臟丙二醛（MDA）含量，增加肝臟內(nèi)谷胱甘肽（GSH）水平，對(duì)大鼠非酒精性肝損傷的發(fā)生具有預(yù)防保護(hù)作用。 Al-Fartosi 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，駝乳對(duì)撲熱息痛誘導(dǎo)的肝臟毒性具有保護(hù)作用。 此外，駝乳對(duì)于糖尿病大鼠的肝功能也具有有益作用[12]，能夠保護(hù)肝臟免受鋁、鎘等重金屬元素的毒性作用[13]。 然而，駝乳干預(yù)酒精性小鼠體內(nèi)代謝物的影響機(jī)制尚不清楚，缺乏相關(guān)的研究報(bào)道。本研究對(duì)小鼠一次性大劑量灌胃酒精，建立急性肝損傷模型，通過檢測(cè)血清和肝臟指標(biāo)，分析駝乳對(duì)酒精性肝損傷小鼠的預(yù)防作用。 通過測(cè)定小鼠肝臟組織代謝物，探究小鼠體內(nèi)因酒精作用發(fā)生變化的差異代謝物、代謝通路及其可能的作用機(jī)制，為天然保肝、護(hù)肝功能性駝乳制品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駝乳采自阿拉善右旗一牧場(chǎng)。 離心（3 500 r/min，40 min）除去上層乳脂，65 ℃水浴加熱30 min后，真空冷凍干燥，并置于-20 ℃冰箱密封保存，備用。

SPF 級(jí)ICR 雄性小鼠（許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006），體質(zhì)量21～23 g，購(gòu)買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；生化指標(biāo)測(cè)定試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （Alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase，AST）、 過氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、甘油三酯 （Triglycerides，TG）、 膽固醇（Cholesterol，TC），上海酶聯(lián)生物科技有限公司；乙腈，Merck；乙酸銨，Sigma；甲醇、氨水，F(xiàn)isher；色譜柱，沃特世（Waters）。

1.2 儀器與設(shè)備

AB Triple TOP 600 質(zhì)譜儀，AB SCIEX；Agilent 1290 Infinity LC 超高壓液相色譜儀，Agilent；2014-181Ab 真空冷凍干燥機(jī)，上海東富龍科技股份有限公司；高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppencbrf 公司；Bio Tack 酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；各型號(hào)微量加樣器，德國(guó)Eppencbrf 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 分組及急性酒精性肝損傷模型的建立 ICR 雄性小鼠（n=24，6～8 周齡）飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室IVC動(dòng)物實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)內(nèi)，環(huán)境溫度和濕度分別控制在（22±2）℃和50%～60%。 小鼠自由進(jìn)食和飲水，12 h 晝夜循環(huán)；適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為空白組（NC，n=8）、模型組（ET，n=8）和駝乳組（ET+CM，n=8）。 NC 組和ET 組灌胃滅菌ddH2O，ET+CM 組灌胃脫脂駝乳粉溶液（按照6 g/kg bw 的計(jì)量復(fù)原[14]）。灌胃體積和造模參照Ming 等[9]研究。 灌胃體積均為0.3 mL，每日灌胃2 次，連續(xù)灌胃2 周；最后一次灌胃結(jié)束后，所有小鼠禁食、不禁水6 h，ET 組和ET+CM 組分3 次（間隔1h）按照7.3 g/kg bw 的計(jì)量灌胃體積分?jǐn)?shù)50%的酒精溶液，建立急性酒精性肝損傷模型[15-16]；同時(shí)，NC 組小鼠灌胃等體積ddH2O。 造模結(jié)束后繼續(xù)禁食、不禁水6 h 后，異氟烷麻醉小鼠，眼球采血，并解剖取小鼠肝臟。

1.3.2 血清ALT、AST、SOD 和GSH 指標(biāo)的檢測(cè)新鮮血液常溫下靜置4～6 h 后，離心分離血清（4℃，3 000 r/min，20 min），按照說(shuō)明書測(cè)定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、過氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）的含量。

1.3.3 肝組織TG 和TC 含量的測(cè)定 取約0.1 g肝組織置于勻漿儀上冰浴勻漿（速度2.90 m/s，時(shí)間15 s），并進(jìn)行離心（4 ℃，3 000 r/min，20 min）制備肝組織勻漿液。 取上清按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)并計(jì)算肝組織中甘油三酯（TG）和膽固醇（TC）含量。

1.4 小鼠肝臟組織液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 （LCMS）代謝組測(cè)定

1.4.1 小鼠肝臟樣本的處理 取出預(yù)先分裝保存的小鼠肝臟樣本，在4 ℃冰箱中緩慢解凍；剪取適量肝臟樣本加入預(yù)冷的甲醇/乙腈/水溶液（2∶2∶1，V/V），利用漩渦混合器充分混合，再離心（14 000×g，4 ℃離心15 min）取上清液備用。

1.4.2 色譜條件 樣品采用超高效液相色譜系統(tǒng)（UHPLC）HILIC（親水色譜）色譜柱進(jìn)行分離。流動(dòng)相A 和B 分別是水+25 mmol/L 乙酸銨+25 mmol/L氨水和乙腈。 色譜柱溫為25 ℃，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量選擇2 μL。 梯度洗脫[φ（B）]：0～0.5 min/95% ，0.5～7 min/95%～65% ，7～8 min/65%～40%，8～9 min/40%，9～9.1 min/40%～95%，9.1～12 min/95%。 檢測(cè)過程中設(shè)定QC（Quality control）樣品，進(jìn)而監(jiān)測(cè)整個(gè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

1.4.3 Q-TOF（四極桿-飛行時(shí)間）質(zhì)譜條件 樣品通過色譜系統(tǒng)分離后進(jìn)行質(zhì)譜分析（Triple TOF 6600 質(zhì)譜儀，AB SCIEX）。 電噴霧電離（ESI）設(shè)置參數(shù)如下： 霧化氣輔助加熱氣1 和2 （Gas1 和Gas2）均為60。 一級(jí)質(zhì)荷比檢測(cè)范圍：60～1 000 u，二級(jí)子離子質(zhì)荷比檢測(cè)范圍：25～1 000 u； 一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜掃描累積時(shí)間分別是0.20 s/spectra 和0.05 s/spectra；每次掃描采集10 個(gè)碎片圖譜。

1.5 代謝物分析

采用XCMS 軟件對(duì)檢測(cè)獲得的質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)譜峰對(duì)齊、保留時(shí)間統(tǒng)計(jì)和峰面積提取，并借助SIMCA 14.1 軟件完成多元統(tǒng)計(jì)分析，包括主成分分析（PCA）、最小二乘法判別分析（PLD-DA）和正交最小二乘法判別分析（OPLD-DA）。 利用代謝物鑒定及查詢的數(shù)據(jù)庫(kù)，如Metlin、HMDB、KEGG、MetaboAnalyst 5.0 等，篩選、鑒定差異代謝物并完成代謝通路分析。 以條件VIP>1 和P<0.05篩選顯著性差異的代謝物并分析代謝物互作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)血清及肝臟生化指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析； 所有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示。P<0.05 為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異。 統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算得出的圖、 表采用Graphpad 6.01 軟件制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 駝乳對(duì)急性肝損傷小鼠血清ALT 和AST 的影響

酒精性肝損傷會(huì)導(dǎo)致血清轉(zhuǎn)氨酶升高，常用的血清轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)是ALT 和AST。ALT 與AST 主要分布在肝細(xì)胞內(nèi)，參與機(jī)體的氨基酸代謝。肝臟受損時(shí)，肝細(xì)胞發(fā)生炎癥和壞死，使ALT 和AST釋放到血液中。 ALT 和AST 水平的升高是目前最常用的肝功能檢測(cè)指標(biāo)。 由圖1 可知，與NC 組相比，ET 組小鼠血清中ALT 和AST 水平顯著增加（P＜0.05）； 其中ET 組血清ALT 和AST 含量分別是NC 組的2.78 倍和2.36 倍，表明酒精的攝入使小鼠的肝細(xì)胞受損，且通過短時(shí)間灌胃大量酒精的方式可以成功復(fù)制急性酒精性肝損傷模型。 與ET 組比較，ET+CM 組小鼠血清中ALT 和AST 含量均顯著降低（P＜0.05），且與NC 組之間無(wú)顯著差異（P>0.05），說(shuō)明駝乳能夠在一定程度上保護(hù)小鼠肝臟免受酒精的損傷作用。 這與前人研究結(jié)果一致[9，17]。

2.2 駝乳對(duì)急性肝損傷小鼠氧化損傷的保護(hù)作用

研究發(fā)現(xiàn)，短時(shí)間內(nèi)大量攝入酒精，機(jī)體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生過量的活性氧 （Reactive oxygen species，ROS），導(dǎo)致氧化應(yīng)激，即打破氧化與抗氧化防御系統(tǒng)的平衡，被認(rèn)為是酒精性肝損傷發(fā)生與發(fā)展的重要機(jī)制之一[18]。 SOD 和GSH 是衡量機(jī)體氧化損傷的主要指標(biāo)，體內(nèi)過量的ROS 作用于SOD 和GSH 等抗氧化酶，導(dǎo)致抗氧化酶活性降低[19]。 為了探索駝乳對(duì)酒精誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠抗氧化能力的影響，檢測(cè)了血清中SOD 和GSH 的含量 （圖1）。 ET 組小鼠血清中SOD 和GSH 的含量與NC組相比具有顯著下降的趨勢(shì)（P<0.05）；ET+CM 組小鼠血清內(nèi)SOD 和GSH 的含量較ET 組顯著增加（P＜0.05），基本恢復(fù)到正常水平，與NC 組無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明駝乳能夠清除活性氧自由基，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化的防御機(jī)制。

圖1 駝乳對(duì)小鼠血清ALT、AST、SOD 和GSH 的影響Fig.1 Effect of camel milk on serum ALT，AST，SOD and GSH in mice

2.3 駝乳對(duì)急性肝損傷小鼠肝組織TG 和TC 的影響

一般情況下，肝臟可利用糖、甘油和脂肪酸作為原料，通過磷脂酸途徑合成甘油三酯。肝細(xì)胞約含4%～7%的脂類物質(zhì)，其中甘油三酯約占1/2，甘油三酯含量過高會(huì)引起脂肪肝。 酒精代謝過程中可誘導(dǎo)脂肪變性，導(dǎo)致脂肪沉積在肝細(xì)胞中，造成肝組織中TG 和TC 的水平異常[20]。 與NC 組相比，ET 組小鼠肝組織中TG 和TC 的含量顯著升高（P＜0.05），表明ET 組小鼠的肝臟出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的脂肪變性 （圖2）。 與ET 組相比，ET+CM 組的TG 和TC 含量顯著降低 （P＜0.05）；NC 和ET+CM組之間TG 的含量無(wú)顯著差異（P>0.05），而TC 含量在兩組間差異顯著（P＜0.05）（圖2）。以上結(jié)果表明駝乳能夠有效降低急性酒精性肝損傷小鼠肝臟內(nèi)甘油三酯和總膽固醇的含量，并提高肝臟內(nèi)膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。

圖2 駝乳對(duì)小鼠肝組織TG 和TC 的影響Fig.2 Effect of camel milk on liver TG and TC in mice

2.4 小鼠肝臟代謝組數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)價(jià)

UHPLC-QTOF-MS 的穩(wěn)定性對(duì)測(cè)試樣本差異代謝物的檢測(cè)極其重要，因此檢測(cè)過程中的質(zhì)量控制樣本（Quality control，QC）是體現(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性以及檢測(cè)方法重復(fù)性的重要指標(biāo)。 從圖3結(jié)果可知，正、負(fù)離子模式下QC 樣本緊密聚集在一起，表明測(cè)序重復(fù)性良好，不存在分散現(xiàn)象，可保證測(cè)定數(shù)據(jù)的可靠性（3a，3b）。對(duì)各組樣本采用OPLD-DA 分析，發(fā)現(xiàn)NC 組和ET 組，ET 組和ET+CM 組之間明顯分離，表明代謝組圖譜存在明顯差異。

圖3 正、負(fù)離子模式總體樣本的PCA 分析（a 和b）和OPLS-DA（c 和d）得分圖Fig.3 PCA （a，b） of positive and negative ion mode and OPLS-DA （c，d） score plot

2.5 差異代謝物的篩選

為提高代謝物的鑒定覆蓋率，每組小鼠肝組織的代謝物經(jīng)HILIC 分離后，分別用正、負(fù)離子化方式檢測(cè)，并采用公共數(shù)據(jù)庫(kù)和中科新生命本地自建標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫(kù)[in-house database （Shanghai Applied Protein Technology）]搜庫(kù)[21-22]、結(jié)構(gòu)鑒定、人工二次核對(duì)，最終共鑒定到2 156 種代謝物，其中正負(fù)離子模式分別鑒定到了1 145 和1 011 個(gè)代謝物。

進(jìn)一步，為了獲得兩兩組之間的差異代謝物，本研究基于OPLS-DA 分析的VIP>1 和ANOVA分析P 值<0.05 作為篩選條件，在正負(fù)離子模式下進(jìn)行了差異代謝物的分析。由圖4 可知，在正離子模式下，篩選到ET+CM 組與ET 組的差異表達(dá)代謝物總數(shù)為19 個(gè)，其中15 個(gè)上調(diào)，4 個(gè)下調(diào)；ET 組與NC 組的差異表達(dá)代謝物總數(shù)為68 個(gè)，其中36 個(gè)上調(diào)，32 個(gè)下調(diào)。 在負(fù)離子模式下，篩選到ET+CM 組與ET 組的差異表達(dá)代謝物總數(shù)為21 個(gè)，其中9 個(gè)上調(diào)，12 個(gè)下調(diào)；ET 組與NC 組的差異表達(dá)代謝物總數(shù)為149 個(gè)，其中64 個(gè)上調(diào)，85 個(gè)下調(diào)。在ET 組和NC 組以及ET 組和ET+CM組中的差異代謝物主要涉及脂質(zhì)代謝、 有機(jī)酸代謝和有機(jī)氧化合物類別中，說(shuō)明酒精能引起小鼠肝臟代謝的改變，尤其是部分氨基酸和有機(jī)化合物的改變。

圖4 正離子模式下（a）和負(fù)離子模式下（b）的差異代謝物Venn 圖Fig.4 Venn diagram of differential metabolites in positive ion mode （a） and negative ion mode （b）

進(jìn)一步，在NC 組、ET 組和ET+CM 組3 組中最終篩選鑒定出28 個(gè)差異代謝物（表1）。 由表1可知，與NC 組相比，灌胃酒精會(huì)降低肝臟中乙酰膽堿、甘氨酸、亞油酸、磷脂酰膽堿等含量；而灌胃駝乳會(huì)對(duì)以上代謝物有緩解作用。 ALD 小鼠肝臟中甘氨酸的含量降低說(shuō)明酒精性肝損傷的形成，與生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果相一致； 而在ET+CM 組中，代謝物甘氨酸的含量有顯著上升趨勢(shì)。研究表明，甘氨酸與機(jī)體的炎癥、免疫調(diào)節(jié)等相關(guān)，且甘氨酸的保肝作用與氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)[23-24]。磷脂酰膽堿（Phosphorylcholine）是人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為人體提供豐富的多不飽和脂肪酸、 甘油和乙酰膽堿等生物活性物質(zhì)； 同時(shí)也是甲基和膽堿的良好來(lái)源，參與肝臟解毒及其它生化過程[25]。 它的含量變化提示酒精可能引起膽堿攝取受阻，并導(dǎo)致甲基供應(yīng)不足，加重了酒精性肝病的程度。駝乳干預(yù)下小鼠肝臟中甘氨酸和磷脂酰膽堿水平的變化，說(shuō)明駝乳通過氧化應(yīng)激作用調(diào)節(jié)體內(nèi)的代謝異常。

表1 NC、ET 和ET+CM 三組小鼠肝臟差異代謝物Table 1 Differential liver metabolites in NC，ET and ET+CM groups of mice

2.6 差異代謝物KEGG 富集分析

差異代謝物的KEGG 富集分析結(jié)果顯示，ET和NC 組差異代謝物主要富集在膽堿代謝（Choline metabolism）、 礦物質(zhì)吸收 （Mineral absorption）、氨基酸生物合成（Biosynthsis of amino acid）、蛋白質(zhì)消化吸收（Protein digestion and absorption）、氨酰tRNA 生物合成（Aminoacyl-tRNA biosynthesis）、 甘油磷脂代謝（Glyceropholipid metabolism）以及ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC transporter）等通路（圖5a）。 ET+CM 組和ET 組差異代謝物富集的通路包括膽堿代謝 （Choline metabolism）、甘油磷脂代謝（Glyceropholipid metabolism）、氨基酸生物合成（Biosynthsis of amino acid）以及ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC transporter）等通路（圖5b）。 由此可見，膽堿代謝、甘油磷脂代謝和ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是ET 組和NC 組以及ET 組和ET+CM 組中共有的差異代謝通路，是駝乳對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠預(yù)防作用機(jī)制中發(fā)揮著重要作用的代謝通路。

圖5 差異代謝物KEGG 通路富集分析Fig.5 Enrichment analysis of differential metabolite KEGG pathway

3 結(jié)論

本研究對(duì)小鼠一次性大劑量灌胃酒精，建立急性肝損傷模型，通過血清和肝臟生化指標(biāo)檢測(cè)分析駝乳對(duì)小鼠進(jìn)行酒精性肝損傷的預(yù)防作用；進(jìn)一步，基于UHPLC-QTOF-MS 技術(shù)的代謝組學(xué)分析方法探究駝乳的護(hù)肝功效作用機(jī)制。 通過灌胃駝乳可有效抑制小鼠血清中ALT 和AST 的水平，顯著增加GSH 和SOD 的活性，且緩解小鼠肝臟中TG 和TC 的水平。 通過代謝組的分析，在NC組、ET 組和ET+CM 組3 組中最終篩選鑒定出28個(gè)差異代謝物，其中ET+CM 組小鼠肝臟中甘氨酸、亞油酸、磷脂酰膽堿等含量顯著增加；且差異代謝物主要富集在膽堿代謝、 甘油磷脂代謝和ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路中，說(shuō)明駝乳可以通過氧化應(yīng)激作用調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)的代謝異常。