抗BP5—BSA多克隆抗體的制備及鑒定

王嘉偉+張巫凡+張聰+王臣

摘 要：本研究設計將BP5與BSA偶聯(lián)制備成免疫原。制定免疫程序，用此免疫原免疫家兔，收集兔抗BP5-BSA血清，并分離純化動物血清，使之能大批量生產制備。用間接ELISA測定兔抗BP5-BSA多抗血清的抗體效價。用硫酸銨鹽析法對多抗血清中的蛋白質進行粗提純，并檢測其含量，為進一步建立BP5-BSA的ELISA檢測方法奠定實驗基礎。

關鍵詞：法氏囊；法氏囊活性五肽；多克隆抗體；ELISA；效價

法氏囊活性五肽 （Bursopentin，BP5） 是從法氏囊中分離所得的一種活性小肽，氨基酸序列為CKDVY（Cys-Lys-Asp-Val-Tyr）。多克隆抗體是采用傳統(tǒng)的免疫方法，將抗原物質經不同的途徑注入動物體內，經數(shù)次免疫后采取動物血液，分離出血清，獲得的抗血清。本研究以間接ELISA測定兔抗BP5-BSA多抗血清的抗體效價并分離純化動物血清，使之能大批量生產制備，多克隆抗體在實驗動物生產的主要意義是獲得高滴度實驗或高親和力的抗血清，用于實驗或診斷測試，為進一步研究法氏囊BP5小肽在體內分布奠定實驗基礎，并為新型疫苗佐劑的研究開發(fā)奠定基礎。

一、材料與方法

1.實驗材料

2只雄性家兔（約2公斤重）購于洛陽市塔灣村養(yǎng)殖戶；將BS5與BSA偶聯(lián)制備免成疫原，委托上?？齐纳锟萍加邢薰旧a。

2.實驗動物免疫

將2只家兔分為A對照組、B實驗組兩組。A組用PBS溶液進行免疫，B組用抗原（BP5-BSA）進行免疫，待家兔適應兩天后進行首次免疫，首免14 d后進行二次免疫，二次免疫14 d后進行三次免疫。

3.兔抗BP5-BSA多抗血清采集

首免第7 d，第14 d，二免第7 d，二免第14 d分別對A，B兩組的家兔耳緣靜脈采血1 mL/只。37℃恒溫箱內放置3h后，置于臺式離心機中，以4000r/min的速度離心6min，吸取血清于EP管中，做好標記，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＜彝萌夂蟮? d，對A、B兩組的家兔進行心臟采血，分離出動物血清，保存于-20℃冰箱中備用。

4.兔抗BP5-BSA多抗血清的抗體含量變化

用間接ELISA的方法分別測出兔抗BP5-BSA多抗血清7 d，14 d，21 d，28 d、35 d在450 nm的波長下各孔的吸光度（OD）值。

5.硫酸銨鹽析法測兔抗BP5-BSA多抗血清中IgG的含量

取1 mL血清于試管中，加入1 mL生理鹽水，混勻，然后于攪拌下逐滴加入2 mL飽和硫酸銨溶液，此時硫酸銨溶液的終飽和度為溶液50%。室溫下，放置20 min，3000 r/min離心10 min，棄去上清液，用1 mL的生理鹽水將沉淀溶解，再逐滴加入硫酸銨溶液0.5 mL，此時硫酸銨溶液的終飽和度為33%。室溫下，放置20 min，重復上述第二步過程1～2 次，末次離心后所得沉淀為蛋白質。在最終沉淀物中加入5 mL生理鹽水做5 倍稀釋。再從稀釋品中取1 mL，加9 mL生理鹽水做10 倍稀釋，最終所沉淀的蛋白質的稀釋度50，分光光度計上讀出OD值，用生理鹽水調零。

蛋白含量（mg/mL）=（1.45×OD280-0.74×OD260） ×稀釋度

二、結果與分析

1.兔抗BP5-BSA多克隆抗體效價動態(tài)變化

采集免疫家兔第7 d，第14 d，第21 d，第28 d，第 35d的血液，經離心后取其血清，用間接ELISA的方法在酶標儀檢測其在450 nm的吸光度值。在酶標儀上對酶標板進行檢測，所讀的OD450值變化如圖1所示，家兔BP5-BSA多克隆抗體的量隨免疫天數(shù)的增多而逐漸增加，首免后的2 周多克隆的含量較少，而二免后的2 周家兔BP5-BSA多克隆抗體的產生速率增加，大約是首免后的二倍。對照組多克隆抗體的量則基本沒有變化。實驗組與對照組相比較說明，免疫過BP5-BSA的家兔，家兔體內抗體的含量增加，說明BP5-BSA具有良好的免疫原性。

2.硫酸銨鹽析法測兔抗BP5-BSA多抗血清中IgG質含量

取硫酸銨鹽析法所鹽析出的IgG，做50 倍稀釋，在紫外分光光度計上，讀出OD值計算得：

三、討論

本次試驗通過人工合成BP5-BSA（血藍蛋白）作為免疫原，并制定免疫程序，經過首免、二免及三免后獲得兔抗BP5-BSA多克隆抗體；通過間接ELISA的方法測定兔抗BP5-BSA多克隆抗體的效價，間接ELISA實驗結果表明，血清中兔抗BP5-BSA多克隆抗體的量隨免疫天數(shù)的增加而增多；用硫酸銨鹽析對兔抗BP5-BSA多抗血清中的IgG進行提純，用紫外分光光度計檢測血清中兔抗BP5-BSA多克隆抗體含量為5.73 mg/mL。該研究設計為進一步建立BP5-BSA的ELISA檢測方法奠定實驗基礎。

參考文獻：

[1] 李德元，陳溥言.法氏囊五肽的分離鑒定及其免疫調節(jié)和抗過氧化應激機理的研究[D].2010.2～10.

[2] 王明俊.獸醫(yī)生物制品學.北京：中國農業(yè)出版社，1997.

作者簡介：王嘉偉（1994—），男，河南焦作人，本科學歷。

王臣（1979—），男，安徽六安人，博士學歷，教授，研究方向：動物分子病原學與免疫學。