紅景天苷對(duì)糖尿病腎病大鼠的治療作用及其機(jī)制探討

樸敏虎，王程瑜，李香丹，楊莎莎，崔逢德，許東元

(1延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉133002；2延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

紅景天苷對(duì)糖尿病腎病大鼠的治療作用及其機(jī)制探討

樸敏虎1，王程瑜2，李香丹2，楊莎莎2，崔逢德2，許東元2

(1延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉133002；2延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

目的 觀察紅景天苷對(duì)糖尿病腎病(DN)大鼠的治療作用，并探討其作用機(jī)制。方法 將24只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、DN組和治療組，每組8只。治療組和DN組腹腔注射鏈脲佐菌素制備DN模型，造模成功后分別給予紅景天苷及等量生理鹽水灌胃；對(duì)照組腹腔注射等量檸檬酸緩沖液，并給予等量生理鹽水灌胃。連續(xù)灌胃10周后，腹主動(dòng)脈采血檢測(cè)血糖、血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)；處死后取腎組織，采用分光光度法檢測(cè)腎組織中的SOD和MDA，免疫印跡法檢測(cè)腎組織中磷酸化的蛋白激酶B(Akt) 和糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)蛋白。結(jié)果 與對(duì)照組相比，DN組血糖、BUN、Scr、IL-1β、TNF-α水平和腎組織中MDA活性升高，而腎組織中SOD活性及Akt、GSK-3β蛋白磷酸化水平降低(P均<0.05)；與DN組相比，治療組血糖、BUN、Scr、IL-1β、TNF-α水平和腎組織MDA活性降低，而腎組織中SOD活性及Akt、GSK-3β蛋白磷酸化水平增加(P均<0.05)。結(jié)論 紅景天苷可能通過活化Akt/GSK-3β信號(hào)通路，控制血糖、炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而對(duì)DN發(fā)揮治療作用。

糖尿病腎病；紅景天苷；蛋白激酶B；糖原合成酶激酶3β；炎性因子；氧化應(yīng)激；大鼠

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，是糖尿病患者主要死因之一。糖尿病患者由于胰腺功能障礙或胰腺損傷引起胰島素的缺乏，導(dǎo)致血糖增高，組織缺氧，進(jìn)而誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子釋放，激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而造成細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致腎小球硬化、腎功能不全[2]。蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β(Akt/GSK-3β)是調(diào)控炎性反應(yīng)的重要通路，其磷酸化程度可表示其活性高低。最近研究調(diào)查表明，30%的1型糖尿病患者和20%的2型糖尿病患者可發(fā)展成DN導(dǎo)致終末期腎病(ESRD)，而我國(guó)糖尿病患者中2型糖尿病DN患病率達(dá)34.7%[2,3]。紅景天苷是紅景天的一種主要成分，可以降低血糖[4]、抗炎、抗氧化[5]，對(duì)糖尿病有一定的治療作用。2014年12月～2016年6月，我們制備DN大鼠模型，觀察紅景天苷對(duì)DN的治療作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD雄性大鼠24只，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)于延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，清潔級(jí)，常規(guī)室溫分籠飼養(yǎng)，自由飲水。鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自Sigma 公司；紅景天苷和細(xì)胞裂解緩沖液(RIPA)購(gòu)自北京索來寶生命科學(xué)公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司。Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、β-actin兔抗鼠一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)于Santa Cruz公司。主要儀器有血糖儀(強(qiáng)生Sure Step Plus)、全自動(dòng)生化分析儀和F50型酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與給藥處理 將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、DN 組、治療組，每組8只。其中治療組和DN組腹腔注射STZ 60 mg/kg(溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液)以誘導(dǎo)DN，對(duì)照組給予等量檸檬酸緩沖液，并收集24 h尿液。72 h后，通過尾靜脈采血，測(cè)量血糖，并檢測(cè)24 h尿蛋白。大鼠血糖水平均﹥16.7 mmol/ L、尿蛋白≥30 mg/(kg·d)，確認(rèn)DN模型成功。治療組大鼠用紅景天苷100 mg/(kg·d)灌胃10周，剩余兩組給予等量生理鹽水灌胃，治療期間實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供給基本飲食。

1.2.2 血糖、腎功能及血清炎癥因子檢測(cè) 治療10周后，腹主動(dòng)脈取血，15 000 r/min離心10 min，取血清，按照試劑盒操作方法利用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血糖、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)；按照ELISA檢測(cè)試劑盒操作說明,通過酶標(biāo)儀測(cè)定血清IL-1β和TNF-α水平。

1.2.3 腎組織氧化應(yīng)激標(biāo)記物檢測(cè) 采血后處死大鼠，摘取腎組織，部分甲醛固定，部分凍存。取部分腎組織，勻漿后以3 000 r/min離心15 min，取上清液，按試劑盒操作說明利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定MDA含量和SOD的活性，。

1.2.4 腎組織Akt/GSK-3β通路磷酸化水平測(cè)定 取凍存的腎組織約100 mg，添加RIPA和苯甲磺酰氟(PMSF)后充分勻漿，并在4 ℃環(huán)境下靜置30 min。然后經(jīng)100 ℃煮沸5 min變性，迅速轉(zhuǎn)移到4 ℃ 環(huán)境中靜置1～2 min，再離心10 min(13 000 r/ min，4 ℃)。取離心后的上清液，用BCA試劑通過比色法進(jìn)行蛋白定量。提取的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAEG膠分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，加相關(guān)一抗Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、β-actin 4 ℃孵育過夜，再經(jīng)相應(yīng)的辣根過氧化物酶孵育2 h。最后通過ECM試劑盒在暗室曝光，所顯示的條帶經(jīng)IPP軟件測(cè)量其灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以目的蛋白與β-actin灰度值比值表示目的蛋白表達(dá)量，以p-Akt/Akt、p-GSK-3 /GSK-3 表示Akt/GSK-3β通路磷酸化水平。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖及腎功能比較 見表1。

表1 各組大鼠血糖及腎功能比較±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與DN組比較，#P<0.05。

2.2 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平及腎組織MDA、SOD活性比較 見表2。

表2 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平及腎組織MDA、SOD活性比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與DN組比較，#P<0.05。

2.3 各組大鼠腎組織Akt/GSK-3 通路磷酸化比較 見表3。

3 討論

糖尿病患者的主要死因是多個(gè)組織器官的并發(fā)癥，其中包括DN。DN是以腎小球小動(dòng)脈硬化為主要病變，而氧化應(yīng)激與糖尿病微血管病變有關(guān)。糖尿病患者體內(nèi)自由基清除系統(tǒng)明顯受損，機(jī)體產(chǎn)生大量氧自由基[6]。有研究表明，氧化應(yīng)激時(shí)過多產(chǎn)生的活性氧簇通過多種信號(hào)通路介導(dǎo)炎癥因子、趨化因子及黏附因子的釋放，作用于腎臟細(xì)胞繼而發(fā)生DN[7]。

表3 各組大鼠腎組織Akt/GSK-3 通路磷酸化水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與DN組比較，#P<0.05。

紅景天苷是紅景天的主要有效成分，具有降血糖、抗炎、抗氧化等多種藥理作用[4,5]。本研究通過STZ誘導(dǎo)制備的DN大鼠模型，觀察紅景天苷的抗炎和抗氧化作用機(jī)制。結(jié)果顯示，紅景天苷明顯降低血糖水平，這與之前的研究結(jié)果基本一致[8，9]。TNF-α、IL-1是兩個(gè)重要的促炎細(xì)胞因子，是促進(jìn)炎癥反應(yīng)的兩大主要物質(zhì)[10]。TNF-α主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，并通過特定的細(xì)胞膜受體發(fā)揮作用。IL-1是由有核細(xì)胞產(chǎn)生，包括IL-1α和IL-1β。IL-1β和抗原呈遞細(xì)胞共同刺激T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖、分化，并誘導(dǎo)全身性炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，紅景天苷能降低血清IL-1β、TNF-α的水平，表明紅景天苷具有抗炎作用。SOD是一種清除生物體內(nèi)超氧陰離子自由基的抗氧化酶；而MDA是氧自由基和膜不飽和脂肪酸的過氧化產(chǎn)物，可破壞細(xì)胞膜，改變其流動(dòng)性和膜滲透性。本研究中我們觀察到紅景天苷可以提高活性氧的清除能力，提高SOD活性，降低MDA的產(chǎn)生。PI3K/Akt信號(hào)通路是一個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)合成、葡萄糖運(yùn)輸、血管生成和其他重要的生理功能的調(diào)節(jié)[11～13]。GSK-3β在調(diào)控促炎因子與抗炎因子生成的平衡中起重要作用[14]，Akt激活后可以磷酸化GSK-3β，進(jìn)而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子CREB、NF-κB與cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白的能力，最終調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子的合成。已有研究表明，紅景天能夠通過激活PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路，增加脂肪組織Akt和GSK-3β磷酸化，進(jìn)而降低血糖。本研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷治療后可以使DN大鼠腎組織中GSK-3β和Akt磷酸化增加，表明紅景天苷能夠通過激活A(yù)kt/GSK-3β通路引起Akt的磷酸化水平升高，進(jìn)而磷酸化GSK-3β，從而抑制炎癥因子的生成和氧化應(yīng)激反應(yīng)，起到減輕腎組織損傷的治療作用。

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國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460056)。

許東元(E-mail： dyxu@ybu.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.10.010

R587.1

A

1002-266X(2017)10-0034-03

2016-11-12)