X染色體Amelogenin基因座片段擴增峰圖異常1例及熒光定量分析

時永勝 胡錫階 周單華 萬衛(wèi)紅 余 艦 章 濤 劉祖林余麗梅＊

1．遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院，貴州省細胞工程重點實驗室（563003）；2．遵義醫(yī)學院法醫(yī)學鑒定中心

AMEL基因座（amelogeni，AMEL牙釉基因座）是法醫(yī)學在進行親子鑒定和個體識別中性別確認時常用的基因座，是X、Y染色體上的同源染色體基因，位于X染色體的Xp22．1－Xp22．3和Y染色體的Yp11．2，編碼牙釉質蛋白［1］。不同試劑盒擴增，這一基因的產(chǎn)物長度有所不同［2］。以往采用IdentifilerTM、PowerPlex 16等不同 PCR 擴增試劑盒進行親權鑒定時，對AMELX、AMELY等位基因座丟失進行了 報 道［3－11］。美國 Applied Bioystems公司生產(chǎn)的人類熒光標記短串聯(lián)序列（STR）復合擴增檢測試劑盒（華夏白金試劑盒）是針對中國人的基因頻率變化在IdentifilerTM試劑盒基礎上除性別染色體STR 外，增 加 Penta E、D2S441、D22S1045、D6S1043、D10S1248、D1S1656、D12S391、Penta D八個基因座，以提高親權鑒定的準確性，兩種試劑盒模板DNA含量的線性范圍均為0．5～1．25ng／25 μl。但實際工作中，發(fā)現(xiàn)個別微量樣本檢測時，兩種試劑盒擴增后的測序檢測結果存在一定差異，由此可想，在遇到AMEL基因片段擴增缺失時，也需審慎分析，為此，本研究在二聯(lián)體親權鑒定中，就華夏白金試劑盒與IdentifilerTM試劑盒檢測父親AMELX等位基因座擴增丟失進行了對比分析。

1 對象與方法

受檢者為爭議父親（37歲，WJ2016－0552－3）和女兒（7歲，WJ2016－0552－2）。檢材為二者的EDTA－K2抗凝靜脈血，第一次檢測時采用FTA卡制血斑，華夏白金試劑盒（AB公司，美國）進行復合PCR擴增，用3500DX遺傳分析儀（AB公司，美國）進行毛細管電泳，并用GeneMapper軟件進行圖譜分析。確認實驗用Generation Capture Column試劑盒固相提取DNA（Qiagen公司，德國），Identifiler試劑盒（ABI公司，美國）進行PCR復合擴增，3100 Avant遺傳分析儀進行毛細管電泳分離，并通過Gene Scan Software V3．7 軟 件、Genotyper SoftwareV3．7軟件進行數(shù)據(jù)采集與STR基因分型。

2 結果

2．1 華夏白金和Identifiler TM試劑盒等位基因分型

華夏白金試劑盒等位基因分型結果包括24個STR基因座（表1），累積非父排除率（CPE）＞0．999 9，計算累積父權指數(shù)（CPI）為 40 242 160 823．630 1，累積相對父權機會（RCP）為0．999 999 999 975 15，支持疑父為該女兒的生物學父親。IdentifilerTM試劑盒結果除無前所述8個基因座外，其余基因座分型結果同華夏白金試劑盒等位基因分型結果，也同樣支持疑父和女兒的生物學父女關系。

2．2 AMEL基因座分型圖譜

在華夏白金試劑盒擴增檢測圖譜中，與分型標準無比對，WJ2016－0552－3樣本 Y染色體上的AMEL基因座峰圖明顯可見（圖1），而未見X染色上的AMEL基因座峰圖。采用IdentifilerTM試劑盒擴增圖譜（圖2）也與圖1相似，即未見爭議父X染色體的AMEL基因座峰圖，僅存在Y染色體AMEL基因座峰圖。而通常二聯(lián)體親子鑒定中，兩個試劑盒擴增的圖譜分別如圖3（華夏白金試劑盒擴增）、圖4（IdentifilerTM試劑盒擴增）所示，在X、Y兩條染色體上均可見明顯的AMEL基因座峰圖。

表1 STR基因座中不同染色體上的短串聯(lián)序列重復次數(shù)

圖1 華夏白金試劑盒擴增父基因后的基因分型圖譜

圖2 Identifiler試劑盒擴增父基因后的基因分型圖譜

圖3 華夏白金試劑盒擴增后正常對照的X、Y染色體AMEL基因座峰

圖4 Identifiler TM試劑盒擴增后正常對照的X、Y染色體AMEL基因座峰

2．3 熒光定量結果及比值分析

對于IdentifilerTM試劑盒擴增樣本的分型圖譜，最大擴增產(chǎn)物＜350bp，擴增容易，峰高均一。對本案例進行峰高、峰面積分析結果顯示，正常男性X／Y染色體AMEL等位基因座峰高峰面積比值約為1，疑父與正常男性的Y染色體AMEL等位基因座峰高峰面積比值也約為1。本檢案中父親X染色體沒有AMEL等位基因座峰，女兒的X染色體AMEL等位基因座峰高、峰面積均約為正常對照者的一半（表2、表3）。

表2 Identifiler TM試劑盒AMEL等位基因座熒光定量分析結果

表3 女兒與正常女性、疑父與正常男性性染色體熒光定量比值分析（%）

3 討論

檢案中華夏白金試劑盒擴增后，AMEL基因座分型圖譜發(fā)現(xiàn)，雖然疑父Y染色體上的AMEL基因明顯可見，但出現(xiàn)了X染色體上AMEL基因丟失，與以往研究報道父親或兒子AMEL X等位基因丟失相似，所用PCR擴增的Identifiler、Goldeneyes 20A 、GlobalFilerTM和 PowerPlex 16試劑盒不同，產(chǎn)物長度存在差異［2，11－12］，中國人群 X 染色體和 Y染色體中AMEL等位基因總突變率為0．045%，男性群體中的突變率為0．085%［12］。進而采用Identifiler試劑盒擴增，取得了與華夏白金試劑盒擴增一致的AMEL基因座分型圖譜，試驗結果也證明父親X染色體存在AMEL基因的擴增丟失。而女兒的AMEL基因座峰高和峰面積為正常對照的一半（正常情況下與正常對照的峰高和峰面積應大約相等），女兒的其中一條X染色體遺傳于父親，父親無峰圖，說明女兒出現(xiàn)這種峰圖的最大可能是由于在擴增時由于引物區(qū)突變或真正缺失AMEL基因導致峰圖異常。遺憾的是后期因血樣不足，提取DNA剩余血樣送華大基因測序無法得出結果，也即無法證實AMEL基因座擴增缺失是基因缺失，還是引物區(qū)發(fā)生變異導致。

AMEL X等位基因的缺失或突變會可能為X－連鎖遺傳或新發(fā)突變，可引起牙釉質發(fā)育不全［13］。理論上疑父的AMEL基因缺失會遺傳給女兒，可能在女兒表現(xiàn)出牙釉質發(fā)育不全的臨床表型，女兒X染色體上AMEL峰應為單源峰，即只來源于母親。若定量分析，如克氏綜合征（XXY）的峰圖［13］，就有兩個相同的X染色體AMEL等位基因，其峰高、峰面積約為單X染色體AMEL等位基因峰圖的兩倍。正常女性AMEL基因座純合子期望峰高、峰面積應約為雜合子的兩倍或接近兩倍［2］。

華夏白金試劑盒，因采用直擴方式，未定量DNA濃度，受血卡上血樣厚薄差異及打血卡大小等影響，難以準確進行AMEL缺失者與正常對照者AMEL峰高、峰面積的比較分析。這也提示，在采用華夏白金試劑盒擴增時或缺乏分型標準比對情況下，若出現(xiàn)了Y染色體AMEL基因缺失的個體識別中，或采用常用華夏白金試劑對非整倍體染色體疾病進行DNA遺傳分析檢測時，應改用先抽提基因組DNA，定量檢測DNA含量，確保DNA濃度高于試劑盒的最低檢測線，或采用IdentifilerTM等其他試劑盒進行驗證，避免性別錯判，或因峰高、峰面積錯誤分析，出現(xiàn)對克氏綜合征或21－三體綜合征等病癥的遺漏。

［1］ Xie J，Shao C，Xu H，et al．Deletion mapping of the regions with AMELY from two Chinese males ［J］．Legal medicine（Tokyo，Japan），2014，16（5）：290－292．

［2］ 張彩虹，張艷萍，金孝華，等．親子鑒定中牙釉質基因擴增X片段缺失1例報告 ［J］．中國計劃生育學雜志，2016，24（5）：350－351．

［3］ Ma Y，Kuang JZ，Zhang J，et al．Y chromosome interstitial deletion induced Y－STR allele dropout in AMELY－negative individuals［J］．International journal of legal medicine，2012，126（5）：713－724．

［4］ Ou X，Chen W，Chen H，et al．Null alleles of the X and Y chromosomal amelogenin gene in a Chinese population［J］．International journal of legal medicine，2012，126（4）：513－518．

［5］ Borovko S，Shyla A，Korban V，et al．Amelogenin test abnormalities revealed in Belarusian population during forensic DNA analysis ［J］．Forensic science international Genetics，2015，15：98－104．

［6］ Chen W，Wu W，Cheng J，et al．Detection of the deletion on Yp11．2in a Chinese population［J］．Forensic science international Genetics，2014，8（1）：73－77．

［7］ Tozzo P，Giuliodori A，Corato S，et al．Deletion of amelogenin Y－locus in forensics：literature revision and description of a novel method for sex confirmation［J］．Journal of forensic and legal medicine，2013，20（5）：387－391．

［8］ 嚴愛貞，鄭德柱，林宇翔，等．產(chǎn)前診斷中羊水個體Amelogenin基因座X片段缺失一例 ［J］．中國優(yōu)生與遺傳雜志，2015，（10）：40－41．

［9］ 梁燕，梁鰍雙，翚蕓，等．牙釉質蛋白基因Y缺失1例 ［J］．刑事技術，2014，（3）：56－57．

［10］ 羅毅，楊罕，劉翠蘭，等．Amelogenin基因座X片斷變異1例［J］．刑事技術，2011，（1）：69－70．

［11］ 高波，姜富學，王成，等．Amelogenin等位基因丟失的研究現(xiàn)狀 ［J］．中國公共安全（學術版），2016，（2）：108－110．

［12］ 陳愛萍，陳勇，王會品，等．中國人群Amelogenin基因的突變頻率和突變類型 ［J］．中華醫(yī)學遺傳學雜志，2007，6（24）：615－619．

［13］ 胡錫階，劉祖林，章濤，等．親子鑒定中Amelogenin基因熒光定量分析檢出克氏綜合征1例 ［J］．第三軍醫(yī)大學學報，2011，（7）：759－760．