稀釋液中添加L—半胱氨酸對(duì)雞精液室溫保存的影響

趙萬(wàn)樂(lè) 李艷玲++朱松波 陳二平 +張兆旺

摘要：利用安卡紅種公雞新鮮精液，在A、B等2種稀釋液稀釋后分別添加不同濃度的L-半胱氨酸，測(cè)定精子活率和精子畸形率，比較不同濃度的半胱氨酸對(duì)雞精液在常溫保存下的效果。結(jié)果表明，在常溫下保存，在A稀釋液中添加1.0 mmol/L L-半胱氨酸的雞精液的各項(xiàng)指標(biāo)值均比不添加和添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸的好（P<0.05），且保存效果較為理想。在B稀釋液中添加1.0、5.0 mmol/L L-半胱氨酸的精子有效存活時(shí)間極顯著高于對(duì)照組（P<001）；隨著L-半胱氨酸添加量的增多，生存指數(shù)值變大，且以添加5.0mmol/L L-半胱氨酸最高，但與添加 1.0 mmol/L L-半胱氨酸間差異不顯著（P>0.05）。但是，2種稀釋液中是否添加L-半胱氨酸對(duì)精子畸形率影響不大（P>0.05）。

關(guān)鍵詞：稀釋液；雞；精液；L-半胱氨酸；室溫保存；精子活率；畸形率

中圖分類號(hào)： S831.3+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）03-0131-03

收稿日期：2015-12-25

作者簡(jiǎn)介：趙萬(wàn)樂(lè)（1987—），男，山西晉城人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事動(dòng)物繁殖技術(shù)方面的研究。E-mail：503587578@qq.com。

[JP2]精液保存會(huì)隨著時(shí)間的推移而使精子活力以及受精能力降低[1]，即使是使用一些比較好的稀釋液。精子在呼吸代謝過(guò)程中能產(chǎn)生活性氧族（ROS），攜帶有氧自由基，造成過(guò)氧化損傷，這是受精能力下降的重要原因之一。因此，在精液稀釋液中添加抵抗自由基的成分是很有必要的[2]。近些年，過(guò)氧化作用對(duì)精子的不良影響得到研究者的普遍重視，[JP]但是由于物種和抗氧化劑作用機(jī)理的不同，抗氧化劑在精液保存中的添加量和作用效果報(bào)道不盡相同。本試驗(yàn)根據(jù)雞精液的氧化原理和L-半胱氨酸的作用機(jī)理，在稀釋液中添加不同濃度的L-半胱氨酸，觀察精液在常溫下的保存效果，現(xiàn)報(bào)道如下。[JP]

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

選用15羽健康、繁殖性能好的安卡紅種公雞，供采精用。供試驗(yàn)雞的飼料配方見表1。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1稀釋液配方根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康呐渲?種基礎(chǔ)稀釋液A、B（表2）各250 mL，然后各取3份，均為30 mL，編號(hào)為A0、A1、A2，B0、B1、B2，以A0、B0為空白對(duì)照組，然后在控制A、B稀釋液滲透壓和pH值基本不變的基礎(chǔ)上分別向其中添加不同濃度的L-半胱氨酸，制成A1、A2、B1、B2等4種稀釋液，其中A1、B1中1.0 mmol/L L-半胱氨酸添加量為 3.6 mg，A2、B2中5.0 mmol/L L-半胱氨酸添加量為 18.2 mg。

1.2.2精液采集用腹背部聯(lián)合按摩法采集公雞精液，將采得的雞精液用紗布過(guò)濾，注意在采集過(guò)程中減少糞便、血液、尿酸鹽等的污染。然后將集精瓶用毛巾包好迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，運(yùn)送過(guò)程中，且盡量避免振蕩。

1.2.3精液的稀釋和保存分別用稀釋液A0、A1、A2、B0、B1、B2在室溫下將雞精液按照體積比1 ∶[KG-*3]3進(jìn)行稀釋，稀釋后迅速檢查精子活率，然后置于室溫（試驗(yàn)進(jìn)行期間最高室溫27 ℃，最低室溫24.5 ℃）下進(jìn)行保存。測(cè)定精子生存指數(shù)和總存活時(shí)間，即每隔4 h觀察1次活率，直到精子的活率為0時(shí)終止，每個(gè)處理重復(fù)4次。精子生存指數(shù)為相鄰2次精子活率平均數(shù)與間隔時(shí)間乘積的總和，總存活時(shí)間為從觀察開始至精子活率為0時(shí)的累計(jì)時(shí)間和。此外，本試驗(yàn)結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際情況測(cè)定有效生存指數(shù)和有效存活時(shí)間，即指精子的活率為0.6時(shí)的生存指數(shù)和精液保存時(shí)間。

1.2.4精子畸形率精子畸形率是通過(guò)用龍膽紫染液染色后的精液抹片在顯微鏡1 000倍油鏡下觀察300個(gè)精子中畸形精子所占的比例。分2次觀察，第1次為在剛稀釋完后即行抹片觀察，第2次為等精子全部死亡時(shí)。

1.3數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007對(duì)原始數(shù)據(jù)作初步整理，然后采用SPSS 170生物統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異顯著標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。[JP]

2結(jié)果與分析

2.1生存指數(shù)和總存活時(shí)間

試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，在添加相同濃度L-半胱氨酸的情況下，用B 稀釋液保存雞精液的精子總存活時(shí)間和生存指數(shù)均顯著高于A稀釋液（P<0.05）。就某一個(gè)稀釋液而言，在A中添加1.0 mmol/L L-半胱氨酸時(shí)，生存指數(shù)均顯著高于不添加和添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸等2個(gè)試驗(yàn)組（P<0.05），但總存活時(shí)間以添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸最長(zhǎng)，且顯著長(zhǎng)于對(duì)照組和添加1.0 mmol/L L-半胱氨酸試驗(yàn)組（P<0.05）。而在B液中添加1.0、5.0 mmol/L L-半胱氨酸的生存指數(shù)顯著高于未添加組，且以添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸的效果最好（P<0.05），總存活時(shí)間表現(xiàn)出與A 稀釋液相同的趨勢(shì)。

2.2有效生存指數(shù)和有效存活時(shí)間

試驗(yàn)結(jié)果（表4）表明，添加相同濃度半胱氨酸的情況下，用B稀釋液保存雞精液的精子有效存活時(shí)間和有效生存指數(shù)均顯著高于A稀釋液（P<0.05）。在A稀釋液中添加10、5.0 mmol/L 半胱氨酸時(shí)，有效生存指數(shù)均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），但2組間無(wú)顯著差異（P>0.05）；有效顯存活時(shí)間以添加1.0 mmol/L最長(zhǎng)，且顯著的高于其他2組（P<005）。而在B稀釋液中無(wú)論是否添加L-半胱氨酸，其有效生存指數(shù)差異不顯著（P>0.05），但對(duì)于有效存活時(shí)間來(lái)說(shuō)，添加1.0、5.0 mmol/L均顯著高于未添加組（P<0.05）。

2.3保存前后2個(gè)時(shí)期精子畸形率

本試驗(yàn)將巨型精子、短頭精子、雙頭或雙尾精子、頂體膨脹或脫離、精子頭部殘缺或尾部分離等各種精子異常類型均視為畸形，試驗(yàn)結(jié)果（表5）表明，添加相同濃度L-半胱氨酸的情況下，第1次觀察用B 稀釋液保存的雞精液時(shí)，其精子畸[CM（25]形率顯著低于A稀釋液（P<0.05），而第2次兩者之間差異不顯著（P>0.05）。同一種稀釋液而言，2種稀釋液在不添加L-半胱氨酸和添加1 mmol/L L-半胱氨酸時(shí)精子畸形率差異均不顯著（P>0.05），第1次觀察時(shí)A、B等2種稀釋液在不添加L-半胱氨酸和添加1 mmol/L L-半胱氨酸時(shí)精子畸形率顯著低于添加5 mmol/L L-半胱氨酸時(shí)的精子畸形率（P<0.05）；第2次觀察時(shí)，A稀釋液精子畸形率差異均不顯著（P>0.05），B稀釋液在不添加L-半胱氨酸和添加 1 mmol/L L-半胱氨酸時(shí)精子畸形率顯著低于添加5 mmol/LL-半胱氨酸精子畸形率（P<0.05）。

3結(jié)論與討論

從表3、表4可看出，總的趨勢(shì)是添加組的保存效果好于未添加組，且添加量或稀釋液不同，試驗(yàn)結(jié)果也不同。在A稀釋液中，生存指數(shù)以添加1.0 mmol/L時(shí)最高，2個(gè)試驗(yàn)組間的有效生存指數(shù)無(wú)顯著差異，但顯著高于對(duì)照組。說(shuō)明在精液保存前期（精子活率將至60%以前）L-半胱氨酸濃度對(duì)精子機(jī)能影響不大，后期會(huì)有較大影響，在B稀釋液中也表現(xiàn)出類似結(jié)果。造成這一結(jié)果的具體原因還不清楚，須進(jìn)一步研究。精子的存活時(shí)間和稀釋液的氧化還原指數(shù)相關(guān)，精子在氧化還原指數(shù)為0，即在高度無(wú)氧的保護(hù)液中保存時(shí)間最長(zhǎng)；在純氧環(huán)境中，精子幾乎不能生存，抗游離氧自由基能力很弱。另外，生物氧化、輻射、污染物侵害、細(xì)胞內(nèi)酶促反應(yīng)等過(guò)程中釋放的自由基對(duì)生物分子，尤其是對(duì)脂質(zhì)和核酸有很大的損傷作用，但保護(hù)性酶和抗氧化劑可防止自由基的損害作用[3]。所以，在稀釋液中添加含巰基抗氧化劑的一個(gè)主要目的就是能夠及時(shí)清除精子代謝和外界因素產(chǎn)生的自由基，以達(dá)到對(duì)精子的保護(hù)作用。L-半胱氨酸是一種含有巰基的小分子量氨基酸，是細(xì)胞間谷胱甘肽（GSH）的前體，極易滲入細(xì)胞膜，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外GSH的生物合成，進(jìn)而清除了自由基而保護(hù)了膜內(nèi)的脂類和蛋白質(zhì)。精子在常溫保存過(guò)程中會(huì)進(jìn)行緩慢的呼吸代謝活動(dòng)而產(chǎn)生活性氧族，所攜帶的氧自由基氧化性很強(qiáng)，能氧化精子質(zhì)膜的不飽和脂肪酸，干擾精子的代謝，造成過(guò)氧化損傷，這就是精子受精能力下降的重要原因[4]。Ravie等報(bào)道，雞和火雞精子中含有多不飽和脂肪?；鵞5]，而且雞和火雞精子的體外保存都起過(guò)氧化反應(yīng)、精子脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，對(duì)精子具有中毒效應(yīng)[6-7]。Fujihara 等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)會(huì)降低精子活率[8]。從對(duì)火雞精子的研究來(lái)看，精子中的抗氧化性沒(méi)有足夠高，因此不能夠抑制精子脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，這可以解釋本試驗(yàn)中添加L-半胱氨酸后精液的保存效果明顯好于不添組。

本試驗(yàn)雖未得出對(duì)于A、B等2種稀釋液添加L-半胱氨酸的準(zhǔn)確量，但隨著L-半胱氨酸濃度的增加，保存效果開始變得不明顯，但在不同的稀釋液中這種變化不同，具體來(lái)說(shuō)，在A 稀釋液中添加5 mmol/L L-半胱氨酸時(shí)，除總存活時(shí)間外其他3個(gè)指標(biāo)均有所下降；B稀釋液在同等情況下雖有所上升，但不明顯，說(shuō)明抗氧化劑的添加量只有在合適的濃度下才能發(fā)揮效果。Blesbois等試驗(yàn)證明，維生素C濃度低時(shí)才具有抗氧化作用，而高濃度的維生素C具有促氧化作用[9]。孫琪證明，在向稀釋液中添加2、4 mmol/L 半胱氨酸均能提高豬精子各項(xiàng)指標(biāo)，更可以維持8 d 60%以上的活率，其中2 mmol/L 半胱氨酸效果更顯著，添加8 mmol/L 半胱氨酸效果則較為不明顯[10]。覃永長(zhǎng)等證明，在250 mL基礎(chǔ)稀釋液中添加0.1 g（在本試驗(yàn)中相當(dāng)于3.3 mmol/L）L-半胱氨酸保存豬精液8 d時(shí)，精子活率還保持在50%以上[11]。李大吉等在冷凍稀釋液中添加1 mmol/L N-乙酰半胱氨酸+0.1 mg/mL L-半胱氨酸（在本試驗(yàn)中相當(dāng)于1.0 mmol/L），解凍后豬精子的平均路徑速度、平均側(cè)擺幅度和平均鞭打頻率最高，運(yùn)動(dòng)的線速度最低，但對(duì)膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)沒(méi)有影響，但 0.1 mg/mL L-半胱氨酸處理組可以明顯降低丙二醛（MDA）含量[12]。雖然有很多試驗(yàn)已經(jīng)證明L-半胱氨酸可以有效地保護(hù)精子，降低精子畸形率，但在本試驗(yàn)中可以看出，是否添加L-半胱氨酸對(duì)精子畸形率似乎并沒(méi)有多大的改變，這可能是由試驗(yàn)條件造成的，精液來(lái)源于不同物種以及稀釋液溶質(zhì)。

本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定雞精液保存過(guò)程中精子的生存指數(shù)及有效存活時(shí)間可知，在A稀釋液中添加1.0 mmol/L L-半胱氨酸效果較好，但添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸時(shí)保存效果會(huì)有所下降；在B稀釋液中添加 1.0 mmol/L L-半胱氨酸與添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸的保存效果差異不顯著，但均高于空白對(duì)照組，這種差異可能是由稀釋液的不同造成的。綜上可知，在本試驗(yàn)中影響精子體外存活時(shí)間和有效存活時(shí)間的因素不是某一個(gè)因素造成的，B稀釋液比A稀釋液好，可能是由于B稀釋液中某些成分和L-半胱氨酸共同作用才表現(xiàn)出對(duì)雞精液的體外保存效果，可能是增加了抗氧化劑的作用，但具體機(jī)制還須要進(jìn)一步分析。在進(jìn)行雞精液體外常溫保存時(shí)，添加L-半胱氨酸可以明顯延長(zhǎng)保存時(shí)間，但不同濃度保存效果不相同。

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