纈沙坦對心力衰竭家兔心肌細胞肌漿網(wǎng)蘭尼堿受體的影響

曲輔政，張曉錄，孫經(jīng)武，劉現(xiàn)亮，王東，史孟松，王秀花，曲愛燕，路新磊，周紅霞，程林，康浩飛，衣曉蕊，劉靜

基礎(chǔ)與實驗研究

纈沙坦對心力衰竭家兔心肌細胞肌漿網(wǎng)蘭尼堿受體的影響

曲輔政，張曉錄，孫經(jīng)武，劉現(xiàn)亮，王東，史孟松，王秀花，曲愛燕，路新磊，周紅霞，程林，康浩飛，衣曉蕊，劉靜

目的：探討家兔慢性心力衰竭(心衰)時心肌細胞肌漿網(wǎng)蘭尼堿受體（RyR2）表達及其釋鈣功能的改變以及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦長期干預(yù)的意義。

方法：27只家兔隨機分為三組：假手術(shù)組（n=9）、心衰組（n=9）和纈沙坦組（n=9），通過超容量負荷聯(lián)合壓力負荷建立家兔心衰模型，于術(shù)后7周觀察左心室結(jié)構(gòu)、血流動力學(xué)的變化及心肌細胞肌漿網(wǎng)RyR2的表達和功能的改變。

結(jié)果：與假手術(shù)組比較，心衰組左心室重量指數(shù)、左心室舒張末壓顯著升高（P＜0.05），左心室短軸縮短率及左心室射血分?jǐn)?shù)明顯降低（P＜0.05）；與心衰組比較，纈沙坦組左心室重量指數(shù)、左心室舒張末期壓力顯著降低（P＜0.05），左心室短軸縮短率及左心室射血分?jǐn)?shù)明顯升高（P＜0.05）；心衰組心肌細胞肌漿網(wǎng)RyR2表達和其釋鈣功能顯著低于假手術(shù)組（P＜0.05）；纈沙坦組心肌細胞肌漿網(wǎng)RyR2表達和其釋鈣功能顯著高于心衰組（P＜0.05）。

結(jié)論：長期應(yīng)用纈沙坦能夠改善心臟舒縮功能，可能與其增加心肌細胞肌漿網(wǎng)RyR2表達和其釋鈣功能有關(guān)。

心力衰竭；肌漿網(wǎng)；蘭尼堿受體鈣釋放通道

心力衰竭（心衰）是臨床常見的危重癥之一，死亡率高，嚴(yán)重威脅患者的生命。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）可選擇性作用于心臟AT1受體，逆轉(zhuǎn)心室和血管壁的重構(gòu)，促進心臟功能的恢復(fù)[1]。研究表明，心肌細胞肌漿網(wǎng)蘭尼堿受體（ryanodine receptor2，RyR2）的異常在心衰的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[2]。目前國內(nèi)鮮有關(guān)于心衰時心肌細胞肌漿網(wǎng)RyR2的變化以及纈沙坦進行長期干預(yù)對心功能影響的報道。本實驗通過用超容量負荷聯(lián)合壓力負荷建立家兔心衰模型，進而觀察纈沙坦對心肌細胞肌漿網(wǎng)RyR2表達和功能的影響，從而探討纈沙坦改善心功能的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物和材料

家兔27只，雌雄不限，體重2.0～2.2 kg，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。SCHILLER TM-7型有創(chuàng)血壓監(jiān)護儀產(chǎn)自瑞士，Taq DNA聚合酶及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為立陶宛Fermentas公司產(chǎn)品，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）引物均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，低溫離心機產(chǎn)自德國，PCR儀（Touchgene Gradient）產(chǎn)自英國，Bio Rad電泳轉(zhuǎn)印儀產(chǎn)自美國，KPL 蛋白免疫印跡法（western blot）試劑盒產(chǎn)自美國，BCA蛋白濃度測定試劑盒購于上海西唐生物公司，RyR2一抗購于美國ABR公司，β-肌動蛋白（β-actin）一抗購于美國Upstate公司, 二抗羊抗兔IgG購于上海西唐生物公司， Fura-2·pentapotassium salt購于瑞士Alexis公司，胡蘿卜內(nèi)酯和乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）購于德國Sigma公司，LAMBDADG-4 Ca2+濃度熒光測定儀購于美國，IX71倒置顯微鏡購于日本。

1.2心衰模型的建立

家兔經(jīng)心臟超聲檢查，排除器質(zhì)性病變后，隨機分為假手術(shù)組（n=9）、心衰組（n=9）、纈沙坦組（n=9）。心衰組、纈沙坦組家兔利用超容量負荷聯(lián)合壓力負荷建立心衰模型[3,4]，纈沙坦組家兔在主動脈關(guān)閉不全后第2天開始給予纈沙坦20 mg/（kg·d）。術(shù)后7周心臟超聲測定左心室短軸縮短率（LVFS）及左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）利用心導(dǎo)管術(shù)測定左心室收縮末期壓力（LVESP）、左心室舒張末期壓力（LVEDP）；然后處死家兔，取出心臟，剪下左心室心肌組織稱重，獲得左心室重量（LVW），計算左心室重量指數(shù)（LVMI），心肌組織于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）

根據(jù)Genebank的序列，并參考相關(guān)文獻，分別設(shè)計RyR2及內(nèi)參照β-actin的引物序列。RyR2正義引物：F-AACACATGCCCAACGACAC，反義引物：AAGTAAACCCTCTCGATGCGT；β-actin正義引物：F-CTTCTCCTTGATGTCCCGCACGAT，反義引物：R-GTGCTGTCCCTGTACGCCTCTGG 。 用Trizol提取心肌的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成ucDNA，-20℃保存。PCR反應(yīng)體積為50 μl，含RT產(chǎn)物2 μl，10×buffer 5 μl,上下游引物各0.5 μmol/L，dNTP200 μmol/L，MgCl21.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶2.5 U。反應(yīng)程序為93℃ 預(yù)變性3 min，然后進入PCR循環(huán)，93℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次再延伸7 min。RyR2與β-actin擴增片段長度分別為130、231 bp。RT-PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，用Bio Rad凝膠成像系統(tǒng)quantity one軟件分析條帶灰度，計算RyR2與β-actin擴增條帶灰度比。

1.4蛋白表達的測定

蛋白提?。喝∽笮氖壹〗M織標(biāo)本100 mg，剪碎，置于離心管中，加入細胞裂解液及蛋白酶抑制劑，用高速勻漿器打碎，4℃離心800 g，5 min；取上清液置于超速離心管中，4℃離心12 000 g，1 h；棄上清，沉淀物為膜蛋白，用BCA法測定蛋白濃度[5]，-70℃保存。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：取含20 μg總蛋白的樣本，于100℃煮沸5 min，用非連續(xù)梯度SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白（RyR2分子量為565 kD，分離膠濃度為6%，濃縮膠濃度為3%）；首先電壓100 V、15 min直到樣品在濃縮膠底部成一直線，然后電壓200 V、180 min至溴酚藍到達分離膠底部。

Western blot：在冰水中將凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，電壓110 V、75 min；然后硝酸纖維膜置于封閉液中，室溫溫育1 h；再加入一抗（RyR2抗體滴度為1：500、β-actin抗體滴度為1：1000）封閉，4℃冰箱過夜。次日用洗液漂洗；再加入1：10000二抗（二抗為羊抗兔IgG），溫育1 h；然后用洗液漂洗。最后將顯色劑LumiGLO A液和B液1:1混合，直接加到硝酸纖維膜上；1 min后將顯色液用吸水紙吸干，放入暗盒，加蓋一層透明薄膜，曝光2 min。

蛋白表達半定量分析：將膠片掃描至計算機內(nèi)，應(yīng)用UVIDoc成像儀進行蛋白條帶灰度分析；RyR2與β-actin灰度比值表示蛋白表達半定量水平。

1.5心肌細胞肌漿網(wǎng)提取步驟：

參照改良的Jones等[6]的方法制備肌漿網(wǎng)。（1）取液氮中黃豆至花生米大小的心肌組織，剪碎后置入離心管中，加入5倍體積的緩沖液A[30 mmol/L Tris-馬來酸緩沖液，0.3 mol/L蔗糖，0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF），2 mmol/L二硫蘇糖醇（DTT），3 mmol/L MgCl2，0.1mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），pH=7.2]，用勻漿器將它們勻漿，然后用2層和4層紗布分別過濾1次；（2）4℃，3 800 g離心20 min；（3）取上清液，移入新離心管中，4℃，14 000 g離心20 min；（4）取上清液，移入新離心管中，4℃，45 000g離心60 min；（5）棄上清液，收集沉淀，用緩沖液B（30 mmol/L Tris-馬來酸緩沖液，0.3 mol/L蔗糖，0.1mmol/L PMSF，2 mmol/L DTT，0.5 mol/L KCl，pH=7.0）1 ml懸浮，用勻漿器打勻，4℃，45 000 g離心60 min；（6）收集沉淀，用緩沖液C（30 mmol/L Tris-馬來酸緩沖液，0.3 mol/L蔗糖，0.1 mmol/L PMSF，2 mmol/L DTT，pH=7.0）1 ml懸浮，用勻漿器充分混勻以形成肌漿網(wǎng)囊泡，蛋白含量的測定采用BCA法。

1.6RyR2釋鈣功能的測定[7]

（1）取反應(yīng)液（Tris-HCl 20 mmol/L，KCl 100 mmol/L，MgCl25 mmol/L，NaN35 mmol/L，草酸鉀 5 mmol/L，CaCl20.1mmol/L，pH=6.8）2 ml與肌漿網(wǎng)囊泡蛋白15 μg/ml、Fura-2 2 μm/L，室溫下避光在玻璃培養(yǎng)皿放置5 min；（2）把玻璃培養(yǎng)皿放在倒置顯微鏡下，打開LAMBDADG-4 Ca2+濃度熒光測定儀，激發(fā)波長設(shè)為340 nm和380 nm，發(fā)射波長設(shè)為510 nm，然后分別以340 nm和380 nm的波長激發(fā)，510 nm發(fā)射，在避光條件下記錄熒光強度的變化以及R值（340 nm熒光強度/380 nm熒光強度比值）的變化；（3） 熒光強度平穩(wěn)后加入ATP-2Na 4 μm/ml觸發(fā)反應(yīng)，測定R比值；（4）再加入1 μm/L肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑毒胡蘿卜內(nèi)酯（thapsigargin）和1 mmol/L EGTA誘導(dǎo)鈣釋放，15 s后再測定R值；（5）RyR2釋鈣能力的計算：[Ca2+]=Kd×（Rt-Rmin）/（Rmax-Rt） ×Sf2/Sb2（Kd為Fura-2對Ca2+的離解常數(shù)，Rt為Fura-2在t時間的熒光強度比值，Rmin為Fura-2在沒有Ca2+的游離時的熒光強度比值，Rmax為Fura-2在飽和Ca2+的熒光強度比值，Sf2/Sb2為380 nm處游離時Fura-2與飽和Fura-2熒光強度比值）。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1三組家兔血流動力學(xué)和心功能比較（表1）

家兔飼養(yǎng)過程中，心衰組有3只不明原因死亡，纈沙坦組有2只死亡，發(fā)生在3周左右；假手術(shù)組無死亡，各組取6只作比較。心衰組解剖時可見皮下、胸腔、腹腔大量積水，而假手術(shù)組、纈沙坦組無以上表現(xiàn)；術(shù)前3組家兔手術(shù)前血流動力學(xué)和心功能比較無明顯差別。術(shù)后7周，與假手術(shù)組相比，心衰組LVW、LVMI、心率、LVEDD、LVESD、LVEDP、LVESP顯著升高，LVFS及LVEF明顯降低；纈沙坦組的LVW、LVMI、心率、LVEDP、LVESP、LVEDD、LVESD顯著低于心衰組，LVFS及LVEF明顯高于心衰組。

表1 三組家兔術(shù)前、術(shù)后7周血流動力學(xué)和心功能指標(biāo)比較

表1 三組家兔術(shù)前、術(shù)后7周血流動力學(xué)和心功能指標(biāo)比較

注：LVW：左心室重量；LVMI：左心室重量指數(shù)；LVEDD：左心室舒張末期內(nèi)徑；LVESD：左心室收縮末期內(nèi)徑；LVEDP：左心室舒張末期壓力；LVESP：左心室收縮末期壓力；LVFS：左心室短軸縮短率；LVEF：左心室射血分?jǐn)?shù)。與假手術(shù)組比*P＜0.05；與心衰組比△P＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa

指標(biāo) 假手術(shù)組 (n=6) 心衰組 (n=6) 纈沙坦組 (n=6)術(shù)前LVW (g) 2.43±0.12 2.45±0.15 2.40±0.14 LVMI (g/kg) 1.30±0.07 1.33±0.05 1.35±0.02心率 (次/min) 244.80±10.90 242.00±5.40 247.67±3.78 LVEDD (mm) 14.52±1.42 15.80±2.47 15.70±1.04 LVESD (mm) 8.56±0.78 10.10±1.96 8.98±0.86 LVEDP (mmHg) -1.00±0.89 -1.17±0.75 -0.50±1.05 LVESP (mmHg) 113.17±4.75 111.17±2.64 112.83±4.17 LVFS (%) 41.35±3.75 37.50±3.41 41.86±2.67 LVEF (%) 74.22±2.97 76.57±2.82 74.70±2.36術(shù)后7周LVW (g) 2.48±0.15 7.15±0.59* 4.82±0.21△LVMI (g/kg) 1.32±0.06 3.61±0.09* 2.07±0.14△心率 (次/min) 244.67±9.39 270.50±2.88* 252.67±3.50△LVEDD (mm) 13.33±1.79 21.40±2.53* 17.58±1.96△LVESD (mm) 8.3±11.43 17.17±2.14* 11.53±0.99△LVEDP (mmHg) -0.50±1.05 23.00±2.37* 2.17±0.72△LVESP (mmHg) 112.67±3.78 139.50±3.08* 122.17±0.75△LVFS (%) 37.83±3.58 17.38±3.13* 33.83±2.85△LVEF (%) 71.92±4.56 38.50±6.07* 64.45±3.66△

2.2三組家兔心肌細胞肌漿網(wǎng)RyR2 mRNA水平比較（圖1）

與假手術(shù)組相比，心衰組的RyR2 mRNA水平顯著下降（灰度比：0.86±0.12 vs 0.70±0.06，P＜0.05），而纈沙坦組的RyR2 mRNA水平明顯高于心衰組（灰度比：0.70±0.06 vs 0.50±0.03，P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析家兔手術(shù)7周后心肌細胞肌漿網(wǎng)RyR2 mRNA表達的電泳圖

2.3三組家兔心肌細胞肌漿網(wǎng)RyR2蛋白的比較（圖2）

心衰組心肌RyR2蛋白表達顯著低于假手術(shù)組（灰度比：0.73±0.03 vs 0.90±0.02，P＜0.05），纈沙坦組顯著高于心衰組（灰度比：0.90±0.02 vs0.46±0.01，P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 3組家兔心肌細胞肌漿網(wǎng)RyR2蛋白印跡結(jié)果

2.4三組家兔心肌細胞肌漿網(wǎng)RyR2釋鈣功能的比較

用肌漿網(wǎng)外液加入胡蘿卜內(nèi)酯和EGTA后Ca2+濃度升高的百分比表示心肌細胞肌漿網(wǎng)RyR2攝鈣能力，心衰組肌漿網(wǎng)RyR2釋鈣功能明顯低于假手術(shù)組 [（20.16±1.28）% vs （45.32±1.92）%， P＜0.05]，纈沙坦組肌漿網(wǎng)RyR2釋鈣功能顯著高于心衰組[（33.51±2.13）% vs（20.16±1.28）%， P＜0.05]。

3 討論

RyR是一種鈣離子釋放通道，根據(jù)不同的組織分布，RyR分為三類: RyR1、RyR2和RyR3，在心肌細胞中分布的主要是RyR2。大量證據(jù)表明，鈣循環(huán)異常在心衰的發(fā)展中起著重要作用[8]。鈣循環(huán)主要包括肌漿網(wǎng)鈣釋放、鈣回攝及鈣儲存三個過程。鈣釋放是由肌漿網(wǎng)RyR2完成。心肌細胞膜除極化，引起電壓依賴性L型通道開放，少量鈣離子內(nèi)流入細胞質(zhì)，成為肌漿網(wǎng)鈣離子釋放觸發(fā)器。cAMP依賴的蛋白激酶A（PKA）或鈣/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）對RyR2磷酸化，激活RyR2通道，使與其緊密結(jié)合的通道穩(wěn)定蛋白（Calstabin2，F(xiàn)KBP12.6，F(xiàn)K506結(jié)合蛋白）解離，肌漿網(wǎng)內(nèi)的鈣離子大量釋放，鈣離子與肌鈣蛋白結(jié)合，引起心肌收縮。大多研究顯示心衰時RyR2的表達和活性是降低的[9]。RyR2表達及活性降低將直接導(dǎo)致肌漿網(wǎng)釋放鈣減少，心肌收縮下降，進而導(dǎo)致心衰。

本研究顯示，7周后心衰組家兔均表現(xiàn)為不同程度的進食和活動減少，呼吸頻率增快；LVW、LVMI、LVEDP明顯增加；LVFS及LVEF明顯降低；解剖時可見皮下、胸腔、腹腔大量積水。以上結(jié)果表明，心衰組家兔在超容量負荷及壓力負荷的影響下，結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為心室重構(gòu)，功能上表現(xiàn)為收縮功能降低，最終發(fā)展為左心衰竭。與假手術(shù)組相比，心衰組RyR2的表達和活性顯著降低，肌漿網(wǎng)的釋鈣能力下降，與以往的報道一致[10]。

國外研究表明血管緊張素Ⅱ可以引起心衰心肌的RyR2表達和功能降低[11-13]。國內(nèi)姚艷等[14]研究氯沙坦長期干預(yù)心衰，能夠改善心臟舒縮功能,可能與其上調(diào)肌漿網(wǎng)的鈣調(diào)控蛋白 SERCA2、RyR2、PLB 的基因表達有關(guān)。

本實驗研究表明纈沙坦長期干預(yù)心衰，可明顯增加RyR2的表達和活性，提高肌漿網(wǎng)的釋鈣能力，顯著改善血流動力學(xué)，緩解心室肥厚。纈沙坦作為一種ARB類藥物，主要通過與AT1受體結(jié)合，競爭性抑制血管緊張素Ⅱ的生物學(xué)效應(yīng)而發(fā)揮作用。具體機制可能包括以下因素：（1）纈沙坦作為血管擴張劑降低了心臟的前后負荷，降低了室壁的張力，改善了促使心室重構(gòu)的血流動力異常；（2）抑制了心肌細胞凋亡、肥大和膠原的增生；（3）抑制了交感神經(jīng)的過度激活；（4）增強了血管緊張素Ⅱ受體的良性心血管效應(yīng)；（5）抑制了炎癥因子等；（6）抑制RAS系統(tǒng)，增加了RyR2的表達和功能；（7）抑制了心衰時肌漿網(wǎng)鈣調(diào)控相關(guān)蛋白的改變，恢復(fù)鈣介導(dǎo)的興奮-收縮耦聯(lián)等[15,16]。

總之，本實驗研究結(jié)果表明，心衰家兔RyR2的表達和活性降低，肌漿網(wǎng)的釋鈣能力下降，從而影響心肌舒縮功能，這將為心衰治療提供新的方向。纈沙坦長期干預(yù)心衰，改善心臟舒縮功能，可能與其增加RyR2的表達和活性，提高肌漿網(wǎng)的釋鈣能力有關(guān)。

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Impact of Valsartan on Sarcoplasmic Reticulum Ryanodine Receptor2 in Myocardiocyte of Heart Failure Rabbits

QU Fu-zheng, ZHANG Xiao-lu, SUN Jing-wu, LIU Xian-liang, WANG Dong, SHI Meng-song, WANG Xiu-hua, QU Ai-yan, LU Xin-lei, ZHOU Hong-xia, CHENG Lin, KANG Hao-fei, YI Xiao-rui, LIU Jing.
Department of Cardiology, Yantai Affiliated Hospital of Bin Zhou Medical College, Yantai (264100), Shandong, China Corresponding Author: SUN Jing-wu, Email: bysjw@163.com

Objective: To explore sarcoplasmic reticulum ryanodine receptor2 (RyR 2) expression and calcium releasing function in chronic heart failure (CHF) rabbits and to study the impact of long term valsartan treatment in relevant animals.

Methods: HF model was established by volume overloading with pressure overloading in experimental rabbits. 27 rabbits were divided into 3 groups: Sham group, HF group and HF+valsartan group. n=9 in each group and the animals were treated for 7 weeks. Left ventricular structure, hemodynamic parameters, expression and functional changes of myocardiocyte sarcoplasmic reticulum RyR 2 were observed and compared among different groups.

Results: Compared with Sham group, HF group had increased left ventricular mess index (LVMI), left ventricular end diastolic pressure (LVEDP) and decreased left ventricular shortening fraction, LVEF, all P＜0.05. Compared with HF group, HF+valsartan group showed decreased LVMI, LVEDP and increased left ventricular shortening fraction, LVEF, all P＜0.05. Sarcoplasmic reticulum RyR 2 expression and calcium releasing function were lower in HF group than Sham group, P＜0.05; while they were both higher in HF+valsartan group than HF group, P＜0.05.

Conclusion: Long term application of valsartan could improve the cardiac function which might be related to increased myocardial sarcoplasmic reticulum RyR 2 expression and calcium releasing function in experimental CHF rabbits.

Heart failure; Sarcoplasmic reticulum; Ryanodine receptor calcium release channel

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:390.)

2016-05-10）

（編輯：許菁）

264100 山東省煙臺市，濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院 心內(nèi)科（曲輔政、孫經(jīng)武、劉現(xiàn)亮、王東、史孟松、王秀花、曲愛燕、路新磊、周紅霞、程林、康浩飛、衣曉蕊、劉靜）；煙臺毓璜頂醫(yī)院 檢驗科（張曉錄）

曲輔政 副主任醫(yī)師 博士 主要從事心力衰竭的發(fā)病機制研究 Email: qufuzheng2005@126.com 通訊作者：孫經(jīng)武 Email: bysjw@163.com

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1000-3614（2017）04-0390-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.04.019