黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條性能評估測試

黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，簡寫為AFB1）是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?，含有一個雙呋喃環(huán)和一個氧雜萘鄰?fù)ㄏ愣顾兀?，其劇毒且具有強致癌性，是迄今已發(fā)現(xiàn)的真菌毒素中最穩(wěn)定的一種。從1993年開始，黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機構(gòu)劃定為一類致癌物，是世界公認的三大強致癌物質(zhì)之一。此外，黃曲霉毒素B1由于毒性最大，污染最重，是黃曲霉毒素中危害最大的一種。

受黃曲霉毒素B1污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麥、花生油等糧油食品，且以南方高溫、高濕地區(qū)受污染最為嚴重。目前，GB 2761-2011《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》中對糧食谷物及其制品中黃曲霉毒素B1的最高限量為20μg/kg。GB 13078-2001《飼料衛(wèi)生標準》中對不同種類的飼料中黃曲霉毒素B1的最高限量標準為10～50μg/kg。

目前，國標法測定黃曲霉毒素B1采用HPLC法，但是HPLC法需要使用大型的儀器設(shè)備，價格昂貴，操作過程復(fù)雜，時間較長，且無法在現(xiàn)場和基礎(chǔ)小型實驗室使用。除此之外，也有采取黃曲霉毒素酶聯(lián)免疫試劑盒或膠體金快速檢測試紙條用于大量樣品篩查的方法，此類方法操作簡便，檢測快速，成本也較低，但準確性和重復(fù)性較差，容易造成假陽性或假陰性。因此，市場上急需一種既簡便快速，又能準確定量的檢測方法，而熒光定量免疫層析正好可以滿足這種需求。本文通過對多種糧食谷物飼料樣品的實測，驗證了上海飛測生物科技有限公司（以下簡稱“上海飛測”）開發(fā)的黃曲霉毒素B1熒光定量快速檢測試紙條的技術(shù)性能。

實驗材料和方法

所需材料和設(shè)備

試劑除注明外，均為分析純；試驗用水均為UP水。

黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條（由被有熒光微球標記黃曲霉毒素B1抗體的乳膠墊、噴涂有黃曲霉毒素B1抗原的檢測線和噴涂有羊抗雞二抗的控制線的NC膜、樣品墊及吸收墊組成）、樣品提取液、樣品稀釋液、標準曲線ID卡及標準曲線條形碼，以上材料由上海飛測提供。

黃曲霉毒素B1及其他真菌毒素的標準品，購自Sigma公司。

大米、玉米、小麥、面粉等樣品，從超市購得或從企業(yè)取樣。

麩皮，小麥、面粉等飼料樣品，從飼料廠和企業(yè)取樣。

FD-100型熒光免疫定量分析儀和FD-5000型試紙條恒溫孵育器，上海飛測；低速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；漩渦振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電子天平：Sartorius。

試驗方法

樣品前處理：取具有代表性的待測樣品500g，用小型粉碎機粉碎1min后過20目篩，收集過篩的細小樣品。稱取1.0±0.02g過篩的樣品于10mL離心管中，加入5mL提取液，用漩渦混勻儀震蕩5min（或者搖床振蕩10min）后，4000RPM離心1min，取上清。

檢測過程：取50μL離心上清液加入500μL樣品稀釋液中，用漩渦混勻器混勻3～5s，然后取100μL加入到黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條的加樣孔中，置于37℃恒溫孵育器中溫育10min后，將試紙條插入熒光免疫定量分析儀中讀數(shù)，即為樣品的實際檢測濃度。當檢測值大于50μg/kg時，可用提取液將離心上清液稀釋5倍后再進行檢測，所得讀數(shù)值乘以對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為最終的檢驗結(jié)果。

檢測結(jié)果分析

線性范圍與檢出限

在樣品提取液中，分別添加1.00μg/kg、2.50μg/kg、5.00μg/kg、10.00μg/kg、25.00μg/kg、50.00μg/kg的黃曲霉毒素B1標準品，用上海飛測生物黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條每個樣品檢測3次，以添加濃度為縱坐標，以熒光定量檢測試紙條的檢測結(jié)果為橫坐標，擬合曲線并計算線性相關(guān)系數(shù)。計算得出小麥的線性范圍：1.00～50.00μg/kg（6點），回歸方程：y=1.042x+0.540，相關(guān)系數(shù)R2=0.998（見圖1）。

取10個無污染（陰性）小麥樣品、10個無污染（陰性）玉米樣品和10個無污染（陰性）大米樣品，用上海飛測生物黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條對每個樣品檢測3次，檢測限（LOD）為測定平均值加3倍標準偏差，定量限（LOQ）為測定平均值加10倍標準偏差。測試結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條的LOD為0.29μg/kg，LOQ為0.91μg/kg。

準確性和重復(fù)性分析

在用國標法測定為0的不同種類空白樣品中分別添加黃曲霉毒素B1濃度為1.00，2.50，5.00，10.00，25.00，50.00μg/kg的標準品，然后按照黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條的檢測方法進行檢測。檢測結(jié)果見表1。

從表1可以看出，上海飛測所生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條測試不同糧食谷物中黃曲霉毒素B1的添加回收率在92.89%～121.07%，3次重復(fù)的變異系數(shù)在14.56%以內(nèi)。

與色譜方法的對比試驗結(jié)果

取大米、小麥、玉米、高粱、花生、麩皮、噴漿玉米、DDGS、豆粕受污染樣品各1份，先采用國標液相色譜法進行測定，再使用上海飛測所生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條進行測定，各測試3個平行樣。檢測結(jié)果見表2。

表2表明，在不同的糧食谷物飼料中，上海飛測所生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條與液相色譜法的符合率為89.89%～112.65%，3次重復(fù)測定的的CV值在10.29%以內(nèi)。

方法特異性

選擇其他5種常見的真菌毒素的標準品在陰性玉米中進行添加，添加的濃度為100μg/kg，然后用上海飛測的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條進行測試，每個樣品測3次取平均值；結(jié)果顯示與赭曲霉毒素A，伏馬菌素B1，嘔吐毒素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮交叉反應(yīng)率均小于5%。實驗結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1膠體金試劑條對伏馬毒素、赭曲霉毒素、黃曲霉毒素、玉米赤霉毒素幾乎無交叉反應(yīng)，其方法特異性可以滿足檢測要求。檢測結(jié)果見表3。

結(jié)論

本實驗采用上海飛測所生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條對不同的糧食谷物飼料樣本進行測試，該產(chǎn)品的最低檢出限（LOD）為0.29μg/kg，最低定量限（LOQ）為0.91μg/kg，線性范圍為1.00～50.00μg/kg，線性范圍內(nèi)的添加回收率為92.89%～121.07%，3次重復(fù)的變異系數(shù)在14.56%以內(nèi)。與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)率均小于5%。其準確性和可靠性均可以滿足歐盟和我國對黃曲霉毒素B1的分析標準的技術(shù)要求。該方法具有簡便快速、準確可靠、重復(fù)性好等特點，可用于不同糧食谷物飼料中黃曲霉毒素B1的快速定量檢測分析。