插上“基因組測序”的翅膀，病原微生物檢測應(yīng)用新進展

摘要：基因測序技術(shù)發(fā)展迅速，二代測序已代替一代測序被廣泛應(yīng)用，三代測序也已進入市場。測序技術(shù)目前逐漸被應(yīng)用于病原微生物的檢測，主要分為單一微生物de novo測序、單一微生物基因組重測序、復(fù)雜病原樣品的宏基因組測序，檢測結(jié)果快速精準。

關(guān)鍵詞：病原微生物；基因組測序；宏基因組

1977年，英國的Sanger利用DNA復(fù)制的生物學(xué)特性，設(shè)計了一種通過DNA復(fù)制來識別4種堿基的方法，即經(jīng)典的雙脫氧核苷酸末端終止測序法（Dideoxy chain termination），揭開了DNA測序技術(shù)新篇章。尤其是高通量測序[1]的發(fā)展，使得短短10年，一個人類基因組的測序由10年前的30億美金發(fā)展到今天只要6000美金。測序技術(shù)快速發(fā)展推進了基因組測序應(yīng)用于臨床病原微生物的檢測。2016年是我國精準醫(yī)療元年，也是基因組測序應(yīng)用于臨床診斷飛速發(fā)展的一年。國家衛(wèi)計委發(fā)布《關(guān)于印發(fā)遏制細菌耐藥國家行動計劃（2016-2020）的通知》中支持耐藥菌感染快速診斷技術(shù)的研發(fā)，特別是快速鑒別細菌與非細菌感染的技術(shù)設(shè)備、耐藥菌快速檢測。

測序技術(shù)的發(fā)展

（一）一代測序

1977年，Sanger等提出了的雙脫氧核苷酸末端終止測序法，即在4個DNA合成體系中加入不同的放射性標記的ddNTP，通過電泳條帶放射性自顯影，根據(jù)條帶的位置測DNA分子的序列，隨后Gilbert等提出了化學(xué)降解法。Sanger 和Gilbert測序方法的提出標志著第一代測序技術(shù)的誕生。[1]

（二）二代測序（NGS）——高通量測序（HTS）

1990年，以熒光標記代替放射性同位素標記和毛細管電泳技術(shù)的發(fā)展大幅提高測序的通量。同時，研究者們又提出了焦磷酸測序法、連接酶測序法、雜交測序法等多種DNA序列測定方法。其中在焦磷酸測序法和連接酶測序法的基礎(chǔ)上分別發(fā)展出了Roche公司454測序方法，和ABI公司的SOLiD測序方法。454、SOLiD 與Illumina公司的Solexa技術(shù)，在2005-2007年短短三年時間內(nèi)相繼推出，共同組成了第二代測序技術(shù)[1]。第二代測序技術(shù)的共同特點是極高的測序通量，使得測序周期和成本大幅降低，是目前微生物基因組測序的主流方法。

（三）三代測序

近兩年，以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies納米孔單分子測序技術(shù)，被稱之為第三代測序技術(shù)[2]。與前兩代相比，他們最大的特點就是單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增。SMRT技術(shù)的測序速度很快，每秒約10個dNTP。但是，同時其測序錯誤率比較高（這幾乎是目前單分子測序技術(shù)的通?。_到15%，但好在它的出錯是隨機的，并不會像第二代測序技術(shù)那樣存在測序錯誤的偏向，因而可以通過多次測序來進行有效的糾錯。納米孔單分子測序讀長很長，大約在幾十kb，甚至100 kb，錯誤率目前介于1%至4%，且是隨機錯誤，而不是聚集在讀取的兩端。數(shù)據(jù)可實時讀取，通量很高（30x人類基因組有望在一天內(nèi)完成），起始DNA在測序過程中不被破壞而且樣品制備簡單又便宜。理論上它也能直接測序RNA，并且能直接讀取甲基化的胞嘧啶。第三代測序有望解決目前測序平臺的不足。

測序技術(shù)應(yīng)用于病原微生物檢測的類型

（一）單一微生物de novo測序

de novo測序也稱為從頭測序：其不需要任何現(xiàn)有的序列資料就可以對某個物種進行測序，利用生物信息學(xué)分析手段對序列進行拼接，組裝，從而獲得該物種的基因組圖譜。獲得一個物種的全基因組序列是加快對此物種了解的重要捷徑[3]。目前主要利用二代測序技術(shù)進行de novo測序，臨床上常見病原微生物的標準菌株多數(shù)已完成測序。

（二）單一微生物基因組重測序（Genome Re-sequencing）

全基因組重測序是對基因組序列已知的個體進行基因組測序，并在個體或群體水平上進行差異性分析的方法。隨著基因組測序成本的不斷降低，通過構(gòu)建不同長度的插入片段文庫和短序列、雙末端測序相結(jié)合的策略對重要的病原微生物進行高通量測序。

（三）單一微生物測序應(yīng)用概況

臨床上培養(yǎng)陽性的菌株可進行全基因組，24小時內(nèi)可以完成鑒定，分型，耐藥基因和毒力基因的分析，速度快而成本低。H7N9流感病毒最初分離時就是采用全基因組測序進行鑒定的。目前大部分典型可培養(yǎng)病原微生物均已完成測序，精準程度是質(zhì)譜技術(shù)無法相提并論的。

（四）復(fù)雜病原樣品的宏基因組測序（Magenomics）[3]

宏基因組測序研究的對象是整個微生物群落。相對于傳統(tǒng)單個細菌研究來說，它的優(yōu)勢明顯。主要有以下兩點：（1）微生物通常是以群落方式共生于某一小生境中，它們的很多特性是基于整個群落環(huán)境及個體間的相互影響的，因此做宏基因組測序研究比做單個個體的研究更能發(fā)現(xiàn)其特性；（2） 宏基因組測序研究無需分離單個細菌，可以研究那些不能被實驗室分離培養(yǎng)的微生物。

（五）病原微生物宏基因組應(yīng)用實例

2010年，華大基因研究院和歐洲科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)人體微生物組分布在腸道菌群呼吸道，皮膚表面，占人總體重中的1-3%，基因種類為人體的十倍，被稱為人類第二基因組。從此開啟了微生物宏基因組測序的研究。

病原微生物的測序檢測展望

隨著測序技術(shù)成本的降低，病原微生物測序檢測將加速應(yīng)用速度。非培養(yǎng)標本可直接檢測宏基因組，已培養(yǎng)菌株可進行全基因組測序進行分型，耐藥基因、毒力因子分析。病原微生物的測序技術(shù)將實現(xiàn)快速檢測（24小時內(nèi)），全面覆蓋（目前是2700多種），達到精準醫(yī)療。

參考文獻：

[1] 解增言等.DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與最新進展[J].生物技術(shù)通報，2010.8.

[2] 曹晨霞等.第三代測序技術(shù)在微生物研究中的應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)通報，2016.10.

[3] 秦楠等.高通量測序技術(shù)及其在微生物學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)報，2011.4.