芪參二蓮湯對肝纖維化大鼠血清基質金屬蛋白酶-1及其抑制劑-1水平的影響

袁星星，郭蕾，王炳予，楊磊，劉長發(fā)，張雅麗

1.黑龍江省中醫(yī)藥科學院南崗分院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.齊齊哈爾市中醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000

芪參二蓮湯對肝纖維化大鼠血清基質金屬蛋白酶-1及其抑制劑-1水平的影響

袁星星1，郭蕾2，王炳予1，楊磊1，劉長發(fā)1，張雅麗1

1.黑龍江省中醫(yī)藥科學院南崗分院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.齊齊哈爾市中醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000

目的 觀察芪參二蓮湯對硫代乙酰胺（TAA）誘導大鼠肝纖維化的逆轉作用和血清基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）及其抑制劑-1（TIMP-1）水平的影響，探討其作用機制。方法 采用TAA灌胃法制造肝纖維化模型，120只SPF級SD雄性大鼠按體質量隨機分為正常組、模型組、秋水仙堿組和芪參二蓮湯低、中、高劑量組，各給藥組給予相應藥物灌胃，正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)5周。采用HE和Masson染色觀察肝臟組織病理形態(tài)及損傷程度，采用生化分析、放免法、ELISA檢測血清肝功能、肝纖維化四項及MMP-1、TIMP-1水平。結果 與模型組比較，芪參二蓮湯各劑量組均能顯著降低大鼠血清丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、總膽紅素、γ-谷氨酰轉酞酶及透明質酸、層黏連蛋白、Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原水平，MMP-1和MMP-1/TIMP-1比值顯著升高，TIMP-1水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01)，并且存在一定的量效關系，以芪參二蓮湯高劑量組療效最佳。結論 芪參二蓮湯可明顯改善肝纖維化大鼠肝功能及肝纖維化指標，調控MMP-1與TIMP-1水平，阻止肝纖維化病情的進展。

芪參二蓮湯；肝纖維化；細胞外基質；基質金屬蛋白酶-1；金屬蛋白酶抑制劑-1；大鼠

肝纖維化是在體內有害因素的持續(xù)刺激下，肝臟內彌漫性細胞外基質（ECM）的合成和降解失去平衡的一種病理變化，屬于肝損傷后組織修復過程中的一種代償反應，也是肝硬化發(fā)展的必經階段。而基質金屬蛋白酶類（MMPs）和金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）兩者的平衡在ECM的合成與降解中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現，通過對MMPs/TIMPs平衡的干預，可抑制ECM合成，促進其降解，故其已成為逆轉肝纖維化的重要方法[1]。芪參二蓮湯為黑龍江省中醫(yī)藥科學院著名肝病專家張雅麗教授治療肝纖維化經驗方，具有益氣扶正、活血解毒、化痰通絡的功效。我們前期研究發(fā)現，芪參二蓮湯可通過減輕炎性細胞因子對肝細胞的直接損傷，抑制炎癥向肝細胞浸潤，具有明顯的抗炎、保肝及調節(jié)免疫的功能，對肝纖維化具有一定拮抗作用[2-4]。為了進一步探究其對肝纖維的逆轉作用，本實驗采用硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）灌胃法制備肝纖維化模型，通過檢測大鼠肝功能、肝纖維化指標，監(jiān)測ECM代謝因子MMP-1、TIMP-1水平及其比值變化，探討芪參二蓮湯對大鼠肝纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級SD大鼠120只，雄性，2月齡，體質量（200±20）g，黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物合格證號[黑動字第]P00102005。飼養(yǎng)于黑龍江省中醫(yī)藥科學院實驗動物中心，室溫18～25℃、相對濕度50%～60%、人工12 h晝夜循環(huán)照明環(huán)境，分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水。

1.2 藥物

芪參二蓮湯（黃芪15 g，茵陳蒿10 g，虎杖10 g，西洋參10 g，半邊蓮10 g，半枝蓮10 g，貓爪草10 g，石見穿10 g，女貞子15 g，墨旱蓮15 g，五味子15 g，甘草15 g），上述飲片購自黑龍江省中醫(yī)藥科學院中藥房，本院煎藥室制備并濃縮；秋水仙堿片，昆明制藥集團股份有限公司，0.5 mg/片，批號201410213，用前研細粉過100目篩，用蒸餾水配成混懸液。TAA，上海麥克林生化科技有限公司，批號MFCD00008070。

1.3 主要試劑與儀器

丙氨酸氨基轉移酶（ALT）試劑盒、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司，批號20142301、20141161；總膽紅素（TBIL）試劑盒，上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，批號20140806107；γ-谷氨酰轉酞酶（γ-GGT）檢測試劑盒，桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子集團公司，批號25120784；透明質酸（HA）、層黏連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20100514；大鼠MMP-1、TIMP-1 ELISA試劑盒，美國RapidBio Lab.Calabasas，批號分別為13070822、13070866；Masson三色染色試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司，批號 20140514。石蠟切片機（RM2145，德國Leica），石蠟包埋機（EG1140，德國Leica），熒光顯微鏡（DM1L，德國Leica），酶標儀（Benchmark plus型，美國Bio RAD），全自動生化分析儀（日立7600-020，日本HITACHI），CO2培養(yǎng)溫箱（3949型，美國Forma Scientific）。

1.4 分組、造模與給藥

大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，按體質量隨機分為正常組、模型組、秋水仙堿組和芪參二蓮湯低、中、高劑量組，每組20只。除正常組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)外，余組大鼠采用TAA灌胃法制造肝纖維化模型[5-8]，隔日1次，連續(xù)7周。藥物組按照秋水仙堿（0.105 g/kg）和芪參二蓮湯低（5 g/kg）、中（10 g/kg）、高（15 g/kg）劑量灌胃給藥，正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。給藥體積均為8 mL/kg，每日1次，連續(xù)5周。

1.5 標本制備

實驗結束后，所有大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（1 mL/100 g）麻醉，靜脈取血，靜置，5000 r/min離心7 min，收集血清，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，于肝左葉距邊緣0.5 cm處取2塊1 cm×1 cm×0.5 cm大小組織塊。

1.6 指標檢測

1.6.1 肝組織病理形態(tài) HE染色將肝組織切片經二甲苯Ⅲ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、蒸餾水、蘇木素染液、鹽酸乙醇溶液、清水、清水、氨水溶液、伊紅染液、蒸餾水、50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ后入通風櫥封片。Masson染色切片將肝組織脫蠟、蘇木素染、流水稍洗、1%鹽酸乙醇分化、流水沖洗、麗春紅酸性品紅液染、蒸餾水、1%磷鉬酸水溶液、2.5%亮綠液染色、1%冰醋酸、95%乙醇、100%二甲苯。鏡下觀察肝臟組織病理形態(tài)及肝損傷程度。

1.6.2 肝功能檢測 采用全自動生化分析儀，對血清ALT、AST、TBIL、γ-GGT進行檢測。

1.6.3 肝纖維化指標檢測 放射免疫分析法檢測血清HA、LN、PCIII、Ⅳ-C含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.6.4 血清基質金屬蛋白酶-1及其抑制劑測定 采用ELISA試劑盒及酶標儀測定大鼠血清MMP-1、TIMP-1含量，取出96孔板，設置標準品孔、空白孔、模型孔、秋水仙堿孔和芪參二蓮湯低、中、高劑量孔，加入標準品50 μL預計的標準品濃度梯度；按照順序在待測樣本孔中加入待測樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL，重復洗板3次后加酶標工作液，然后按順序每孔先加入顯色劑A液50 μL，再加入顯色劑B液50 μL，于37℃恒溫箱中避光顯色15 min。用酶標儀檢測。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 一般情況

正常組大鼠與芪參二蓮湯高劑量組營養(yǎng)狀況良好，飲食和體態(tài)正常，反應靈敏，眼光有神，皮毛密集伴有光澤，體質量自然增加。余各組大鼠一般情況差，飲食少，皮毛發(fā)黃黯淡無光，伴輕度脫毛，潮濕成縷，體形消瘦，反應遲鈍，煩躁易激惹。實驗過程中大鼠部分死亡，原因可能為灌胃損傷或對藥物耐受性差異等，模型組大鼠死亡3只，秋水仙堿組和芪參二蓮湯低、中劑量組各死亡2只。

2.2 芪參二蓮湯對大鼠肝臟組織病理形態(tài)的影響

HE染色結果顯示，正常組大鼠肝組織的肝小葉完整，肝細胞排列整齊，肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，無變性壞死，未見纖維組織增生；模型組肝小葉結構破壞，肝細胞索排列紊亂，肝細胞變性，部分壞死，伴有炎性細胞浸潤，纖維組織大量增生；各給藥組肝臟損傷程度均較模型組明顯減輕，肝小葉結構破壞減輕，肝臟膠原纖維增生減輕，肝細胞水腫好轉，變性情況明顯改善，炎細胞浸潤減少，其中以芪參二蓮湯高劑量組肝臟結構改善最為明顯。結果見圖1。

Masson染色結果顯示，正常組大鼠肝細胞索排列整齊，在匯管區(qū)與間質的小血管壁上少量藍色的膠原纖維分布；模型組膠原纖維明顯增多，多分布在匯管區(qū)和血管周圍，形成纖維間隔，破壞肝小葉結構；各給藥組均較模型組減輕，膠原纖維組織增生均有不同程度的減少，纖維化程度有明顯好轉，部分較細的藍色纖維走行于血管周圍，其中以芪參二蓮湯高劑量組肝臟結構改善最為明顯。結果見圖2。

圖2 Masson染色各組大鼠肝臟組織病理形態(tài)（×200）

2.3 芪參二蓮湯對模型大鼠血清肝功能的影響

與正常組比較，模型組ALT、AST、γ-GGT、TBIL水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清ALT、AST、TBIL、γ-GGT水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），其中以芪參二蓮湯高劑量組療效最佳（P＜0.01）。結果見表1。

表1 各組大鼠血清肝功能指標比較（±s，U/L）

表1 各組大鼠血清肝功能指標比較（±s，U/L）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與秋水仙堿組比較，##P＜0.01

組別 只數 劑量/（g/kg） ALT AST γ-GGT TBIL正常組 20 33.79± 4.77 34.07±12.98 44.37±0.43 2.47±0.09模型組 17 219.87±11.54△△ 392.33±26.48△△ 126.06±0.87△△ 9.78±0.11△△秋水仙堿組 18 0.105 103.31± 3.83** 137.80±11.25** 61.38±0.46** 4.17±0.09**芪參二蓮湯低劑量組 18 5 203.40± 3.66* 315.18±11.24* 102.26±0.88* 8.19±0.12*芪參二蓮湯中劑量組 18 10 115.45±18.10** 160.02±10.39** 88.79±0.92** 5.23±0.19**芪參二蓮湯高劑量組 20 15 85.10± 2.39**## 103.35±13.01**## 51.58±1.36**## 3.63±0.17**##

2.4 芪參二蓮湯對模型大鼠血清肝纖維指標的影響

與正常組比較，模型組HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清HA、LN、IV-C、PCⅢ水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），其中以芪參二蓮湯高劑量組療效最佳（P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組大鼠血清肝纖維化指標比較（±s，ng/mL）

表2 各組大鼠血清肝纖維化指標比較（±s，ng/mL）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與秋水仙堿組比較，##P＜0.01

組別 只數 劑量/（g/kg） HA LN Ⅳ-C PCⅢ正常組 20 50.58±1.05 19.39±0.22 8.57±0.30 5.57±0.08模型組 17 257.45±12.44△△ 91.18±1.06△△ 52.47±1.48△△ 37.44±1.48△△秋水仙堿組 18 0.105 139.18±3.87** 58.07±0.71** 27.84±1.68** 21.84±0.48**芪參二蓮湯低劑量組 18 5 178.12±1.86* 88.84±0.80* 47.60±0.43* 31.60±0.43*芪參二蓮湯中劑量組 18 10 142.87±4.97** 55.61±2.08** 34.61±0.48** 25.12±0.45**芪參二蓮湯高劑量組 20 15 81.09±11.04**## 31.23±1.19**## 17.60±0.31**## 11.60±0.31**##

2.5 芪參二蓮湯對模型大鼠血清基質金屬蛋白酶-1及其抑制劑-1水平的影響

與正常組比較，模型組MMP-1、MMP-1/TIMP-1比值顯著降低（P＜0.01），TIMP-1顯著升高（P＜ 0.01）；與模型組比較，各給藥組MMP-1和MMP-1/ TIMP-1比值顯著升高，TIMP-1水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），其中以芪參二蓮湯高劑量組療效最佳（P＜0.01）。結果見表3。

表3 各組大鼠血清MMP-1、TIMP-1水平比較（±s，μg/mL）

表3 各組大鼠血清MMP-1、TIMP-1水平比較（±s，μg/mL）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與秋水仙堿組比較，##P＜0.01

組別 只數 劑量/（g/kg） MMP-1 TIMP-1 MMP-1/TIMP-1正常組 20 2.11±0.13 0.99±0.07 2.11±0.21模型組 17 1.23±0.06△△ 2.84±0.12△△ 0.47±0.08△△秋水仙堿組 18 0.105 1.73±0.07** 1.60±0.08** 1.24±0.05**芪參二蓮湯低劑量組 18 5 1.31±0.09* 2.35±0.06* 0.85±0.04*芪參二蓮湯中劑量組 18 10 1.65±0.11** 1.81±0.07** 1.18±0.11**芪參二蓮湯高劑量組 20 15 1.94±0.11**## 1.34±0.06**## 1.44±0.09**##

3 討論

中醫(yī)學認為，肝纖維化屬“積聚”“癥瘕”范疇，其病機為絡氣不足，氣虛血瘀，外感濕熱久羈，凝聚成痰，發(fā)為本病證。故肝纖維化多為本虛標實，虛實夾雜。芪參二蓮湯用藥以益氣扶正為主，兼以解毒化痰逐瘀。本方重用黃芪，其為補藥之長，氣充帥血，祛瘀散結；西洋參、五味子、墨旱蓮、女貞子滋補肝腎、活血通絡，養(yǎng)血以柔肝體；半邊蓮、半枝蓮清利濕熱；石見穿、貓爪草化痰散結，解毒化瘀；茵陳蒿、虎杖、甘草散瘀退黃，清血分肝絡之毒。綜觀全方，扶正祛邪，扶正不助邪，逐瘀與化痰并行，共奏益氣扶正、活血解毒、化痰通絡之功。

本課題結合肝臟組織病理學、肝功能、肝纖維化四項檢測，對芪參二蓮湯治療肝纖維化的療效進行研究，通過HE與Masson染色聯合對照觀察。結果顯示，正常組大鼠肝臟組織均無明顯異常改變；模型組肝小葉結構破壞，肝細胞索排列紊亂，肝細胞變性，部分肝細胞壞死，伴有中性粒細胞及淋巴細胞浸潤，纖維組織大量增生，個別大鼠可見假小葉形成；各給藥組肝臟損傷程度均較模型組減輕，而且芪參二蓮湯能夠明顯改善肝纖維化大鼠ALT、AST、TBIL、γ-GGT及HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平，其中以芪參二蓮湯高劑量組療效最佳。

肝臟的ECM過度沉積形成肝纖維化，而ECM在肝內過度沉積不僅僅是由于ECM合成增多，更大程度上是由于ECM降解減少[9]。然而，機體主要是通過MMPs與TIMPs的動態(tài)平衡來調節(jié)ECM的生成和降解，MMP-1能降解纖維化肝組織中ECM的主要成分Ⅰ、Ⅲ型膠原，而ECM主要是Ⅰ、Ⅲ型膠原的沉積[10]。TIMP-1可抑制MMP-1的活性，導致ECM降解減少。當MMP-1和TIMP-1比例失調時，導致膠原酶活性減弱，使肝組織內膠原代謝紊亂，Ⅰ、Ⅲ型膠原降解減少而沉積，造成肝纖維化的進一步惡化[11]。史玉嶺[12]使用ROC曲線評估TIMP-1診斷肝纖維化的敏感度、特異性，結果顯示其明顯高于肝纖維化標志物HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN，提示血清TIMP-1診斷肝纖維化有較高的敏感度和特異性，其水平反映肝纖維化程度。本研究結果顯示，TAA誘導肝纖維化模型大鼠較正常組大鼠血清MMP-1水平明顯降低，TIMP-1較正常組明顯升高，MMP-1/TIMP-1較正常組明顯降低，與近年來肝纖維化形成過程中有關MMPs與TIMPs表達的相關研究結果一致[13]。而芪參二蓮湯能顯著提高MMP-1水平，降低TIMP-1水平，從而調整MMP-1/TIMP-1的平衡，達到逆轉肝纖維化的目的。

綜上，芪參二蓮湯能明顯改善肝纖維化大鼠肝功能及肝纖維化指標，促進MMP-1/TIMP-1平衡，從而達到防治肝纖維化的作用，且存在一定的量效關系。

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Effects of Qishen Erlian Decoction on Serum MMP-1 and TIMP-1 in Liver Fibrosis Model Rats

YUAN Xing-xing1,GUO Lei2,WANG Bing-yu1,YANG Lei1,LIU Chang-fa1,ZHANG Ya-li1
(1.Nangang Branch of Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150001,China;2.Qiqihar Hospital of Traditional Chinese Medicine,Qiqihar 161000,China)

Objective To investigate the effects of Qishen Erlian Decoction on serum MMP-1 and TIMP-1 levels in thioacetamide(TAA)induced liver fibrosis rats;To discuss its mechanism of action.Methods Liver fibrosis model was created by the TAA gavage method.120 SD male rats were randomly assigned to control group,model group, colchicine group,Qishen Erlian Decoction low-,medium-and high-dose group(20 in each group).Each medication group was given relevant medicine for gavage.Control group and model group were given the same amount of normal saline for gavage,once a day for 5 weeks.HE staining and Masson trichrome staining were used to observe the pathological changes in liver tissue and liver tissue damage.Biochemistry,radioimmunoassay,and ELISA were used to detect the serum liver function,hepatic fibrosis index,MMP-1 and TIMP-1 levels.Results Compared with the model group,serum ALT,AST,TBIL,γ-GGT,HA,LN,Ⅳ-C and PCⅢ levels,MMP-1 and the ratio of MMP-1/TIMP-1 increased significantly and level of TIMP-1 decreased significantly in Qishen Erlian Decoction groups,with statistical significance(P<0.05,P<0.01).And there is a certain dose-effect relationship,with Qishen Erlian Decoction high-dose group the best effect.Conclusion Qishen Erlian Decoction can improve the liver function and liver fibrosis indexes,regulate the level of MMP-1 and TIMP-1,and prevent the progression of liver fibrosis.

Qishen Erlian Decoction;liver fibrosis;extracellular matrix;MMP-1;TIMP-1;rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.013

R285.5

：A

：1005-5304(2017)05-0052-05

2016-06-13）

（

2016-06-23；編輯：華強）

國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科學技術研究專項（2016ZX05）；黑龍江省科技計劃（GC12C120）；黑龍江省博士后科研啟動資助金（LBH-Q13156）

張雅麗，E-mail：113599895@qq.com