逍遙散對肝郁脾虛證大鼠下丘腦基因表達譜的影響

李曉紅 陳家旭 孔鵬云 肖艷芬 楊力強

(1 廣西中醫(yī)藥大學，南寧，530200； 2 北京中醫(yī)藥大學，北京，100029)

逍遙散對肝郁脾虛證大鼠下丘腦基因表達譜的影響

李曉紅1陳家旭2孔鵬云1肖艷芬1楊力強1

(1 廣西中醫(yī)藥大學，南寧，530200； 2 北京中醫(yī)藥大學，北京，100029)

目的：在全基因組水平上系統(tǒng)探討逍遙散對慢性束縛應激肝郁脾虛證大鼠下丘腦基因表達譜的影響及其抗應激調節(jié)機制。方法：采用Agilent大鼠全基因組表達譜芯片檢測慢性束縛應激肝郁脾虛證大鼠模型(每天束縛3 h，連續(xù)21 d)正常組、模型組、逍遙散組(大、中、小劑量)下丘腦基因表達的差異，篩選出組間兩兩比較的差異基因表達譜，并利用生物信息學技術對差異基因表達譜進行GO功能分析、信號通路分析。結果：模型組、逍遙散大、中、小劑量組具有不同的差異基因表達譜，多條生物過程和信號通路的功能被顯著上調或下調，其中模型組、逍遙散大、中、小劑量組差異基因參與的顯著生物過程分別有909、712、516、1322個功能基因群，參與的顯著信號通路分別有60、57、41、90條。結論：肝郁脾虛證具有下丘腦差異表達基因組學背景，逍遙散大、中、小劑量對肝郁脾虛證大鼠下丘腦眾多差異表達基因及功能改變的信號通路、生物過程均有一定的干預作用，大劑量和中劑量結果顯示優(yōu)于小劑量。

逍遙散；肝郁脾虛證；下丘腦；基因表達譜

基因芯片是目前發(fā)展最為成熟的生物芯片，近年來，在中醫(yī)藥研究中基因芯片技術已廣泛應用于中醫(yī)證候、體質、中藥復方作用機制、中藥有效成分篩選等領域[1]。肝郁脾虛證是肝失疏泄、脾失健運所致的中醫(yī)證候，是臨床上的常見證型。逍遙散最早記載于《太平惠民和劑局方》，由柴胡、白芍、白術、茯苓、當歸、甘草、生姜、薄荷8味藥物組成，是治療肝郁脾虛證的經典名方，也是中醫(yī)治療情志病的經典方劑之一,廣泛應用于精神科和神經科疾病如抑郁癥、焦慮癥、心臟神經官能癥、睡眠障礙等的治療中[2-4]。慢性應激可以導致抑郁癥已成為公認事實，有抑郁癥史自殺患者的行為表現與慢性應激引發(fā)癥狀非常一致，肝郁脾虛是抑郁癥最常見證型[5-6]，是抑郁癥中醫(yī)核心病機[7]。因此，為了進一步發(fā)現和闡明肝郁脾虛證的生物學基礎及逍遙散防治肝郁脾虛證、抑郁癥及抗慢性應激的作用機制，本研究應用Agilent大鼠基因表達譜芯片，觀察了逍遙散大中小劑量對慢性束縛應激肝郁脾虛證大鼠中樞下丘腦差異基因表達譜的影響?，F將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與分組 SD雄性大鼠75只，體質量(200±20)g，購自廣西醫(yī)科大學動物實驗中心[動物許可證號：SCXK(桂)2009-0002]，適應性飼養(yǎng)1周后按體質量隨機分為正常對照組、模型組、逍遙散大、中、小劑量組，每組15只。光照節(jié)律12L：12D(6：00—18：00)，飼養(yǎng)于普通級動物房，室內溫度保持為(22±2)℃，相對濕度保持為30%，大鼠喂常規(guī)飼料及飲用水。

1.1.2 藥物 實驗所用中藥復方選用《太平惠民和劑局方》中的逍遙散，組成藥物購自廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院，按鄧中甲[8]主編的第七版《方劑學》教材所載藥物組成比例：柴胡30 g、當歸30 g、白芍30 g、白術30 g、茯苓30 g、炙甘草15 g、煨姜和薄荷少許(本次實驗各用10 g)用水煎成湯劑，濃縮至含生藥量1.67 g/mL。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 采用慢性束縛應激結合孤養(yǎng)方法制作肝郁脾虛證大鼠模型，將模型組和逍遙散大、中、小劑量組大鼠進行捆綁束縛并單籠飼養(yǎng)造模，每日于夜間18:00—6:00點束縛3 h，束縛時間點隨機，連續(xù)21 d。

1.2.2 藥物干預 正常對照組大鼠群養(yǎng)不予束縛，自由進食、飲水及自主活動。自造模第1天開始，每日在束縛前1 h給各組大鼠灌胃，逍遙散組大鼠灌服逍遙散中藥煎液，根據成人逍遙散每日用量，按體表面積換算成大鼠大劑量用藥量為16.7 g/(kg·d)，中劑量用藥量為8.35 g/(kg·d)，小劑量用藥量為4.175 g/(kg·d)，灌胃容積為1 mL/100 g體質量，正常組、模型組大鼠每日灌服大劑量同等換算量的生理鹽水，造模期間根據大鼠體質量調整給藥量。

1.2.3 取材 造模21 d結束后取材標本，各組大鼠以2%戊巴比妥鈉腹腔注射進行深度麻醉(40 mg/kg)，鍘刀斷頭，在超凈臺內冰上剝離出完整大腦取下丘腦組織置凍存管中迅速放入液氮速凍，取材完畢將標本放入-80 ℃冰箱保存用于基因芯片實驗。

1.2.4 基因芯片檢測下丘腦差異基因表達譜 每組選取3只大鼠的下丘腦標本提取總RNA，使用NanoDrop ND-1000評估RNA的純度和濃度，通過標準變性凝膠電泳評估RNA完整性?？俁NA質檢后進行芯片實驗，芯片為Agilent Rat 4×44K Gene Expression Microarrays，RNA樣品標記和芯片雜交根據Agilent One-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis實驗方案(Agilent Technology)執(zhí)行，由上海康成生物工程有限公司完成基因表達譜檢測。

1.3 數據處理與分析 使用Agilent Feature Extraction軟件(v11.0.1.1)獲得芯片圖，并讀值，得到原始數據。使用GeneSpring GX v12.1軟件(Agilent Technologies)對原始數據進行Quantile標準化和隨后的數據處理。原始數據標準化后經過篩選高質量探針進行進一步分析。2個樣品間差異表達基因通過Fold Change篩選，以Fold change>=2.0標準來確定差異表達基因。使用topGO[9]進行差異基因的GO分析，使用標準的富集計算方法對差異基因進行Pathway分析，Pathway來源于KEGG數據庫。

2 結果

2.1 芯片散點圖 見圖1。

圖1 組間兩兩比較的樣本標準化后的散點分布圖

注：圖1a～圖1d為組間兩兩比較的樣本標準化后的散點分布圖，橫縱坐標代表樣本，每個點代表基因表達情況，點在上面斜線以上為上調大于2倍的基因，代表縱坐標的樣本相對高表達，點在斜線以下為下調大于2倍的基因，代表橫縱標的樣本相對高表達，點離斜線越遠說明信號值越高，點在上下斜線中間的為無差異變化。

圖2 逍遙散大、中、小劑量組與模型組上調和下調基因交集結果圖

圖3 逍遙散大、中、小劑量組與模型組功能上調和下調的生物過程交集結果圖表1 逍遙散大、中、小劑量干預后模型組功能沒有逆轉的信號通路名稱

組別上調通路下調通路逍遙散大劑量組1.MAPKsignalingpathway(雙向調節(jié)通路)2.Calciumsignalingpathway(雙向調節(jié)通路)3.Leukocytetransendothelialmigration4.Circadianentrainment(雙向調節(jié)通路)1.Amphetamineaddiction2.Salivarysecretion逍遙散中劑量組1.Viralmyocarditis2.HTLV-Iinfection3.Allograftrejection4.Autoimmunethyroiddisease5.Epstein-BarrvirusinfectionAmphetamineaddiction逍遙散小劑量組1.Allograftrejection2.TypeIdiabetesmellitus3.Autoimmunethyroiddisease4.Graft-versus-hostdisease5.Naturalkillercellmediatedcytotoxicity6.Viralmyocarditis7.HTLV-Iinfection8.Regulationofactincytoskeleton9.MAPKsignalingpathway(雙向調節(jié)通路)10.Celladhesionmolecules(CAMs)11.Endocytosis12.Antigenprocessingandpresentation13.Phagosome14.Amoebiasis15.Epstein-Barrvirusinfection1.Retrogradeendocannabinoidsignaling2.Rap1signalingpathway3.MAPKsignalingpathway(雙向調節(jié)通路)4.MicroRNAsincancer5.Adrenergicsignalingincardiomyocytes6.Amphetamineaddiction7.GnRHsignalingpathway8.Proteoglycansincancer9.Calciumsignalingpathway(雙向調節(jié)通路)10.ErbBsignalingpathway11.Tcellreceptorsignalingpathway12.Circadianentrainment(雙向調節(jié)通路)13.Melanogenesis14.Salivarysecretion15.Long-termpotentiation16.Thyroidhormonesynthesis17.Arrhythmogenicrightventricularcardiomyopathy(ARVC)18.Thyroidhormonesignalingpathway19.Rap1signalingpathway20.Bacterialinvasionofepithelialcells

2.2 差異表達基因 1)模型組與正常組比較差異表達基因(簡稱模型組差異基因)：與正常組比較，模型組篩選出2 856個差異基因，其中1 653個上調基因，1 203個下調基因。

2)逍遙散組與模型組比較差異表達基因(簡稱逍遙散組差異基因)：逍遙散大劑量組與模型組比較篩選出1 051個差異基因，其中506個上調基因，545個下調基因；逍遙散中劑量組與模型組比較篩選出837個差異基因，其中513個上調基因，324個下調基因；逍遙散小劑量組與模型組比較篩選出2 077個差異基因，其中767個上調基因，1 310個下調基因。

3)逍遙散組差異基因與模型組差異基因交集結果：逍遙散大、中、小劑量組的1 051、837、2 077個上下調差異基因分別與模型組2 856個上下調差異基因進行交集，結果分別有45(上調22個，下調23個)、64(上調46個，下調18個)、224(上調43個，下調181個)個共同差異基因仍為上調或下調表達，從共同差異基因數目看逍遙散小劑量沒有逆轉模型組差異表達的基因數目遠多于中劑量和大劑量。圖2a～圖2f分別表示逍遙散大、中、小劑量組與模型組上調和下調基因交集結果。

2.3 差異表達基因GO功能分析結果 1)模型組差異基因參與的顯著生物過程涉及909個功能基因群，其中功能上調的生物過程有390條，主要集中在神經遞質轉運的調節(jié)、調節(jié)神經遞質分泌、系統(tǒng)過程、多細胞生物過程、膜去極化等方面；功能下調的生物過程有519條，主要集中在細胞組分組織或細胞水平的生物發(fā)生、神經系統(tǒng)發(fā)育、正調節(jié)神經發(fā)生、前腦發(fā)育、信號的預處理等方面。

2)逍遙散大劑量組差異基因參與的顯著生物過程涉及715個功能基因群，其中功能上調的生物過程有383條，主要集中在甘油脂分解代謝過程，調節(jié)運輸、調節(jié)系統(tǒng)過程、肌細胞發(fā)育、血管重塑等方面；功能下調的生物過程有332條，主要集中在系統(tǒng)發(fā)育、多細胞生物體發(fā)育、解剖結構發(fā)展、組織發(fā)育、對環(huán)磷腺苷(cAMP)的反應等方面；逍遙散中劑量組差異基因參與的顯著生物過程涉及516個功能基因群，其中功能上調的生物過程有193條，主要集中在肌細胞發(fā)育、脂蛋白代謝過程、心室心肌細胞發(fā)育、蛋白質自身磷酸化的正調節(jié)、蛋白脂質化等方面；功能下調的生物過程有323條，主要集中在對有機物的反應、對環(huán)磷腺苷(cAMP)的反應、組織發(fā)育、細胞分裂、細胞單價無機陽離子體內平衡等方面。逍遙散小劑量組差異基因參與的顯著生物過程涉及1 322個功能基因群，其中功能上調的生物過程有347條，主要集中在調節(jié)心臟收縮、調節(jié)系統(tǒng)過程、細胞因子產生的正調節(jié)、脂蛋白代謝過程、鈣離子轉運等方面；功能下調的生物過程有975條，主要集中在本土化、細胞過程的正調節(jié)、運輸、主要代謝過程的調節(jié)、神經系統(tǒng)發(fā)育等方面。

3)逍遙散組生物過程與模型組生物過程交集結果：逍遙散大、中、小劑量組的715、516、1 322條功能上調和下調的生物過程分別與模型組909條功能上調和下調的生物過程進行交集，結果分別有146(上調78條、下調68條，其中有62條為雙向調節(jié))、103(上調35條、下調68條，其中有40條為雙向調節(jié))、419(上調62條、下調357條，其中99條為雙向調節(jié))條相同生物過程的功能仍為上調或下調表達，從交集部分相同的生物過程看逍遙散小劑量組沒有逆轉模型組功能改變的生物過程遠多于大劑量和中劑量。圖3a～圖3f分別表示逍遙散大、中、小劑量組與模型組功能上調和下調的生物過程交集結果。

2.4 差異基因信號通路(Pathway)結果 1)模型組差異基因參與的顯著通路共有60條，其中上調通路29條，主要表現在MAPK信號通路、抗原加工與提呈、內吞、EB病毒感染、自然殺傷細胞介導的細胞毒性等通路功能的改變；下調通路31條，主要表現在MAPK信號通路、促性腺激素釋放激素(GnRH)信號通路、鈣信號通路、神經營養(yǎng)因子信號通路、甲狀腺激素合成、胰腺分泌等通路功能的改變。

2)逍遙散大劑量組差異基因參與的顯著通路共有57條，其中上調通路31條，主要表現在致心律失常性右心室心肌病、肥厚性心肌病(HCM)、緊密連接、甘油代謝、血管內皮生長因子(VEGF)信號通路等通路功能的改變；下調通路26條，主要表現在移植物抗宿主病、抗原加工與提呈、I型糖尿病、安非他明成癮、同種異體移植排斥等通路功能的改變；逍遙散中劑量組差異基因參與的顯著通路共有41條，其中上調通路13條，主要表現在病毒性心肌炎、癌癥中的轉錄失調、酮體的合成和降解、碳代謝、血管內皮生長因子(VEGF)信號通路等通路功能的改變；下調通路28條，主要表現在細胞黏附分子、抗原加工與提呈、吞噬體、病毒性心肌炎、人類T淋巴細胞白血病病毒Ⅰ型(HTLV-1)感染等通路功能的改變；逍遙散小劑量組差異基因參與的顯著通路共有90條，其中上調通路30條，主要表現在同種異體移植排斥、I型糖尿病、自身免疫性甲狀腺疾病、移植物抗宿主病、自然殺傷細胞介導的細胞毒性等通路功能的改變；下調通路60條，主要表現在逆行內源性大麻素信號、粘著斑、嗎啡成癮、Rap1信號通路、雌激素信號通路等通路功能的改變。

3)逍遙散組信號通路與模型組信號通路交集結果：逍遙散大、中、小劑量組的57、41、90條顯著通路分別與模型組60條顯著通路進行交集，結果分別有6(其中3條為雙向調節(jié)通路)、6、35(其中4條為雙向調節(jié)通路)條共同通路的功能仍為激活或抑制，從交集部分相同的信號通路看逍遙散小劑量組沒有逆轉模型組功能改變的顯著信號通路遠多于中劑量和大劑量。由于篇幅原因，交集圖省略，表1列出逍遙散大、中、小劑量干預后模型組功能沒有逆轉的信號通路名稱。

3 討論

中醫(yī)學的發(fā)展以臨床療效為基石，以整體觀念和辨證論治為理論和思維特色。中藥復方是中醫(yī)治病的主要臨床應用形式，其進入機體后，通過多成分、多途徑、多靶點的協(xié)同整合作用發(fā)揮了單味藥無法獲得的治療效果[10]。證候是中醫(yī)學認識疾病、臨床診療和療效判定的核心基礎。證候作為一種有規(guī)律的病理表現或一種功能表現，必然有其內在的物質結構來支配它，以往的研究表明反映中醫(yī)證候規(guī)律的“物質基礎”不僅是一些特征性物質，而且可能是“組”“群”“譜”集成的形式[11-13]。系統(tǒng)生物學是當前生命復雜體系研究比較公認的科學思維方式和研究手段，中醫(yī)學的整體觀、辨證論治和方劑配伍等理論與系統(tǒng)生物學的意旨有相同之處?；蛐酒夹g是系統(tǒng)生物學的主要技術平臺之一，根據芯片的功能可以分為基因表達譜芯片和DNA測序芯片?；蛐酒哂懈咄?，并行分析的特點，能夠在同一時間內并行分析大量的基因，進行大信息量的篩選與檢測分析，優(yōu)于其他傳統(tǒng)的技術方法，因而能整體宏觀地研究生物體基因的表達及功能。生物信息學主要研究內容是與生物基因組研究相關的生物信息的獲取、加工、儲存、分配、分析和解釋，其實質就是利用計算機科學和網絡技術來解決生物學問題?；蛐酒梢源笠?guī)模地篩選藥物，能夠在藥物和基因之間架起橋梁，從基因水平研究和解釋藥物的作用機制和藥物的不良反應[14]。因此，運用基因芯片獲得中醫(yī)證候及中藥復方的基因表達譜數據，通過生物信息學方法的處理，有望從基因水平闡釋證候的分子生物學基礎及中藥復方的作用機制。

本研究應用Agilent大鼠全基因組表達譜芯片篩選了慢性束縛應激肝郁脾虛證模型大鼠及逍遙散大、中、小劑量干預大鼠下丘腦差異基因表達譜，并應用生物信息學方法對差異基因表達譜進行了GO功能分析和信號通路分析。從研究結果看出21 d慢性應激復制出的肝郁脾虛證大鼠具有下丘腦差異表達基因組學背景，模型組大鼠下丘腦差異基因表達譜涉及2 856個差異表達基因，差異表達基因參與了909條生物過程和60條信號通路的功能顯著改變，涉及細胞組分、神經系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和垂體、甲狀腺、胰腺等內分泌系統(tǒng)以及MAPK信號通路、鈣信號通路、神經營養(yǎng)因子信號通路等等多方面的變化。對于模型組大鼠出現的這些變化逍遙散大、中、小劑量均有一定的干預效果，顯示出整體雙向調節(jié)作用。逍遙散組大鼠與模型組大鼠的差異基因、生物過程、信號通路交集結果顯示，模型組大鼠2 856個差異表達基因、909條功能顯著改變的生物過程、60條功能顯著改變的信號通路經過逍遙散大、中、小劑量干預后，分別只有45、64、224個差異基因表達水平沒有接近正常組大鼠仍出現上調或下調表達，84、63、320條(除外雙向調節(jié)的生物過程)顯著生物過程的功能仍為上調或下調狀態(tài)，3、6、31條(除外雙向調節(jié)的信號通路)通路的功能仍處于激活或抑制狀態(tài)，差異基因逆轉效果分別為98.4%、97.7%、92.1%，生物過程逆轉效果分別為90.7%、93%、64.7%，信號通路逆轉效果分別為95%、90%、48.3%，結果顯示逍遙散大、中、小劑量對單個差異基因的干預效果均達到了90%以上，但整體干預效果大、中劑量還是優(yōu)于小劑量。另外，研究結果也顯示逍遙散大、中、小劑量除了逆轉了模型組大鼠體內出現的上述變化外，逍遙散組大鼠差異表達基因還參與了眾多不同于模型組大鼠的顯著生物過程和顯著信號通路的功能改變，并且大、中、小劑量最顯著的干預效果表現在不同方面。

本次研究同時應用實時熒光定量PCR方法對芯片結果進行了驗證，所驗證的差異基因和芯片結果表達趨勢基本一致(驗證結果放于另外文章發(fā)表)，提示本次研究結果還是具有一定的客觀可靠性，可為后續(xù)研究提供參考及思路，但由于本研究每個實驗組只做了3只大鼠的基因表達譜芯片，樣本例數較少，不具有足夠的說服力，在今后研究工作中需擴大樣本應用多種實驗方法從組織、細胞及分子水平對基因表達譜進行驗證和深入研究，以期闡明肝郁脾虛證的生物學基礎及逍遙散防治肝郁脾虛證及抗慢性應激的作用機制。

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(2017-02-20收稿 責任編輯：洪志強)

Effects of Xiaoyao Powder on hypothalamus gene expression profile of rats with liver-stagnation and spleen-deficiency syndrome

Li Xiaohong1, Chen Jiaxu2, Kong Pengyun1, Xiao Yanfen1, Yang Liqiang1

(1GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning, 530200; 2BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To systematically investigate the effect of Xiaoyao powder on hypothalamus gene expression profile of rats with syndrome of liver-depression and spleen-deficiency induced by chronic immobilization stress and its anti-stress regulatory mechanism at the whole genome. Methods:The rat whole genome expression chips(Agilent) were used to detect gene expression differences in the hypothalamus of the rat model with liver-stagnation and spleen-deficiency syndrome induced by chronic immobilization stress(daily immobilization stress for 3 h for 21 days) in normal group, model group and Xiaoyao powder group(large, medium and small doses) and any different gene expression profiles between groups were recognized and selected.The hypothalamus gene expression profile was studied through gene ontology and signal pathway analyses using bioinformatics. Results:The differential gene expression profiles of model group and Xiaoyao Powder groups (large, medium and small dose) were different. The functions of multiple biological processes and signaling pathways were significantly up-regulated or down-regulated. The significantly-changed biological processes participated by differential gene of the model group and the Xiaoyao Powder groups(Large, medium and small dose) had909,712,516,1322 respectively, and signal pathways had 60,57,41,90 respectively. Conclusion:The liver-stagnation and spleen-deficiency syndrome has the background of differentially expressed genomics in hypothalamus. The large, medium and small doses of Xiaoyao powder all have a certain intervention effect on multiple hypothalamus differentially expressed genes, signal pathway and biological process whose functions are both changed. The result shows the large and medium doses are better than the small dose.

Xiaoyao Powder；The Live-stagnation and Spleen Deficiency Syndrome；Hypothalamus；Gene Expression Profile

國家自然科學基金項目(編號：81360526；81560750)；廣西自然科學基金項目(編號：2013GXNSFAA019129)；廣西特色實驗動物病證模型重點實驗室建設項目(編號：桂教科研[2014]14)

李曉紅，醫(yī)學博士，副教授，從事中醫(yī)證候生物學基礎研究，Tel：(0771)4733794，E-mail:lsyuan2008@126.com

楊力強，教授，醫(yī)學博士，從事方證研究，Tel：(0771)4733794，E-mail:ylq6606@163.com

R289.3；R277.7

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.03.006