肝臟ESWAN與血清鐵蛋白定量評(píng)價(jià)肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究

王丹，陳天武，劉啟榆，張小明，易光明

肝纖維化是因?yàn)楦渭?xì)胞內(nèi)存在炎癥刺激及壞死時(shí)，以膠原纖維為主的細(xì)胞外基質(zhì)合成增多，而過多的細(xì)胞外基質(zhì)沉積于肝內(nèi)導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[1]。目前肝纖維化治療指南[2]表明早期肝纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的，因此診斷早期肝纖維化尤為重要。而肝穿刺活檢由于各種原因致其臨床應(yīng)用受限[3]，因此磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)作為一項(xiàng)無創(chuàng)、并發(fā)癥少且重復(fù)性高的成像方法得到廣泛的應(yīng)用，在診斷肝纖維化中扮演著重要的角色。

重度T2

*加權(quán)的三維梯度回波成像序列(enhanced T2star weight angiography，ESWAN)的成像原理是由于組織間存在磁敏感性差異，這種差異多由順磁性物質(zhì)引起，如鐵、去氧血紅蛋白以及部分血液產(chǎn)物等。ESWAN最初用于檢測顱內(nèi)出血灶[4]，隨著技術(shù)的發(fā)展逐漸應(yīng)用于肝臟。肝纖維化過程中，鐵與其進(jìn)展密切相關(guān)，鐵誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷可以促進(jìn)肝細(xì)胞壞死、肝星狀細(xì)胞激活，導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生[5]；同時(shí)在肝功能受損嚴(yán)重的肝硬化患者中，肝臟內(nèi)微循環(huán)發(fā)生改變，導(dǎo)致肝內(nèi)組織缺氧，引起去氧血紅蛋白增加[6]，隨著肝內(nèi)鐵及去氧血紅蛋白的增加，導(dǎo)致局部磁場發(fā)生改變，從而使ESWAN成像。

國內(nèi)研究報(bào)道，ESWAN可以間接評(píng)估肝內(nèi)鐵含量[7]，及ESWAN較磁共振常規(guī)序列能更敏感、更準(zhǔn)確地檢測肝臟鐵沉積結(jié)節(jié)[8]，但沒有關(guān)注肝纖維化各期與ESWAN參數(shù)之間的相關(guān)性，同時(shí)多定性研究幅度值和相位值。因此本研究的目的是探討T2

*值、幅度值和血清鐵蛋白能否用于定量診斷肝纖維化的存在和評(píng)估肝纖維化的嚴(yán)重程度及其對(duì)比研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及方法

實(shí)驗(yàn)新西蘭大白兔64只，6～8月齡，體重2.0～3.0 kg，雄性。建模分2批進(jìn)行，每批共32只，正常組4只，實(shí)驗(yàn)組28只，實(shí)驗(yàn)組分為4小組，每小組7只。第2批建模較第1批推遲2個(gè)月進(jìn)行，分組方案同第1批。根據(jù)Zhang等[9]的方法及采用純四氯化碳(CCl4)[10]建造兔肝纖維化模型。實(shí)驗(yàn)組兔每周2次純CCL4腹腔注射，劑量為0.1 ml/kg，對(duì)照組進(jìn)行同劑量的、同時(shí)間的生理鹽水腹腔注射。

1.2 MR檢查

造模第 6、8、10及12周隨機(jī)抽取1只對(duì)照組兔和1只實(shí)驗(yàn)組兔進(jìn)行MR檢查，使用美國GE Discovery MR750 3.0 T超導(dǎo)型MR機(jī)，膝關(guān)節(jié)線圈。掃描前兔8 h禁食，4 h禁水；使用麻醉機(jī)(美國Matrx，VIP3000；麻醉藥：異氟烷)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉。兔取俯臥位固定，用腹帶控制動(dòng)物呼吸動(dòng)度。掃描完成取出肝臟做病理學(xué)檢查，由兩名高年資的病理學(xué)教授對(duì)標(biāo)本進(jìn)行肝纖維化METAVIR分期。

掃描序列如下：(1) T1LAVA-Flex：TR/TE=5.2/2.0 ms，帶寬166.67 KHz，F(xiàn)OV=20 cm×20 cm，矩陣=128×128，層厚3 mm，激勵(lì)次數(shù)1.0；(2) T2WI：TR/TE=3158/104 ms，帶寬83.34 KHz，F(xiàn)OV=14 cm×14 cm，矩陣=320×320，層厚4 mm，激勵(lì)次數(shù)2.0；(3) ESWAN：回波數(shù)為8個(gè)，TR=28.5 ms，TE=3.9～17.5 ms，翻轉(zhuǎn)角為20°，層厚3 mm，無間隔掃描，帶寬125 KHz，F(xiàn)OV=16 cm×16 cm，矩陣=256×256。

1.3 MR圖像及血清鐵蛋白

使用GE Advantage Workstation 4.6工作站測量ESWAN中的T2*值和幅度值。兩名放射學(xué)醫(yī)師采用雙盲法在圖像上勾畫出感興趣區(qū)(region of interest，ROI)，選取圖像質(zhì)量較佳、肝臟較大的3個(gè)層面勾畫ROI，每個(gè)層面隨機(jī)勾畫3個(gè)ROI(圖1)，每個(gè)兔肝臟共9個(gè)ROI，每個(gè)ROI面積為12～28 mm2。勾畫ROI應(yīng)盡量避開大血管、膽管、偽影等，同時(shí)與肝臟邊緣保持足夠的距離。9個(gè)數(shù)據(jù)的平均值用于統(tǒng)計(jì)分析。

兩名病理學(xué)教授對(duì)肝臟標(biāo)本進(jìn)行肝纖維化METAVIR分期。抽取2 ml兔動(dòng)脈血，3000 r/min離心10 min，收集上層血清。按照ELISA試劑盒說明書操作，得到血清鐵蛋白濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兔肝T2*值和幅度值用x±s表示。

兩名放射科醫(yī)師測量的參數(shù)間和第1名醫(yī)生兩次測量參數(shù)間的一致性檢驗(yàn)均用組間變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)表示，CV(%)=(s/x)×100[11]。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物造模結(jié)果

64只新西蘭大白兔，8只正常對(duì)照組，56只構(gòu)建肝纖維化模型。造模過程中共死亡19只，2只未造模成功(F0期)，共造模成功35只。肝臟纖維化分期結(jié)果見表1，各期肝纖維化Masson染色見圖2。

表1 各分組肝纖維化分期結(jié)果Tab.1 Results of stage of METAVIR in each group

表2 肝纖維化各期的ESWAN參數(shù)和血清鐵蛋白值Tab.2 Parameters of ESWAN and serum ferritin values at various stages of hepatic fi brosis

2.2 T2*值、幅度值和血清鐵蛋白與不同肝纖維化分期的關(guān)系

各期肝纖維化的T2*值、幅度值及血清鐵蛋白見表2、圖3。肝纖維化組的T2*值和幅度值均小于正常組，隨著肝纖維化的進(jìn)展，T2*值(r=-0.588，P＜0.05)和幅度值(r=-0.388，P＜0.05)呈下降的趨勢。T2*值能區(qū)分正常組分別與F2、F3、F4期(P＜0.05)，以及F1期分別與F4期、F2～4期(P＜0.05)；幅度值能鑒別正常組和F4期、F1期和F4期、F1～3期和F4期(P＜0.05)。

肝纖維化組血清鐵蛋白值較正常組高，隨著肝纖維化的進(jìn)展，血清鐵蛋白值呈上升趨勢(r=0.409，P＜0.05)。血清鐵蛋白能區(qū)分正常組分別與F3、F4期(P＜0.05)，同時(shí)與T2*值和幅度值均沒有相關(guān)性。

2.3 觀察者間、觀察者內(nèi)差異性分析

兩名醫(yī)師測量的T2*值和幅度值之間的差異性用CV表示，2 w后兩名醫(yī)師分別再次測量數(shù)據(jù)，并進(jìn)行觀察者內(nèi)差異性分析。兩者CV值超過和低于10%的數(shù)據(jù)見表3。

2.4 ROC曲線分析

3 討論

鐵在肝纖維化發(fā)展過程中非常重要[5]。肝臟是人體鐵最主要的代謝和儲(chǔ)存器官，肝臟的鐵濃度可以反映體內(nèi)鐵濃度，因?yàn)檠彖F蛋白不能準(zhǔn)確評(píng)估體內(nèi)的鐵含量[12]，因此MRI被應(yīng)用于測量肝內(nèi)鐵含量[3]。有研究報(bào)道，ESWAN可以定性診斷肝脾內(nèi)鐵沉積結(jié)節(jié)[13-14]。

圖1 A～D分別代表正常和F1～F4期肝纖維化的肝臟MR圖 圖2 A～D分別代表肝纖維化F1～F4期，藍(lán)色區(qū)域?yàn)楦卫w維化(Masson染色，1100倍) 圖3 A～C分別表示T2*值、幅度值和血清鐵蛋白在各肝纖維化期的分布Fig.1 A—D represents the liver MR map of normal and F1-F4 stage liver fi brosis, respectively. Fig.2 A—D represents hepatic fi brosis stage F1-F4,and blue region is liver fi brosis (Masson staining, ×1100). Fig.3 A—C indicated the distribution of fi brosis stage.

本研究發(fā)現(xiàn)，幅度值能區(qū)分正常組與F4期、F1期和F4期、F1～3期和F4期。幅度圖像對(duì)局部磁場的不均勻比較敏感[14]。肝纖維化過程中，肝內(nèi)鐵含量增加，使局部磁場發(fā)生改變、局部磁場不均勻，從而使幅度值發(fā)生改變，隨著肝纖維化程度的加重，鐵也愈加增多，因此幅度值呈下降的趨勢。但是在正常組分別與F1、F2、F3期纖維化比較中，幅度值差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于差異不明顯導(dǎo)致。

本研究發(fā)現(xiàn)血清鐵蛋白能分別區(qū)分正常組與F3、F4期。有研究報(bào)道血清鐵蛋白的水平能輔助診斷肝纖維化[18]。血清鐵蛋白是鐵儲(chǔ)存的最主要方式，因此鐵過載時(shí)，組織內(nèi)和血循環(huán)中的血清鐵蛋白都將增加[19]。肝臟中鐵持續(xù)增加導(dǎo)致肝纖維化程度加重，同時(shí)血循環(huán)中的血清鐵蛋白也逐漸增加。因此血清鐵蛋白隨著肝纖維化程度的加重呈上升趨勢；然而血清鐵蛋白不能區(qū)分正常對(duì)照和早期肝纖維化，究其緣由可能是因?yàn)樵缙诟卫w維化時(shí)，肝臟的代償能力較強(qiáng)，兩者之間差異較小所導(dǎo)致。

通過ROC分析得出，在鑒別正常對(duì)照組和F4期肝纖維化中，幅度值和T2*值的AUC均≥0.825，其中T2*值的診斷效能較高。在各期肝纖維化之間比較中，幅度值與T2*值能鑒別F1期和F4期，且AUC均≥0.8，其中幅度值的診斷效能較高；T*2值能鑒別F1期和F2～4期肝纖維化，AUC值為0.74；而幅度值能鑒別F1～3期和F4期纖維化，AUC值為0.822。血清鐵蛋白較ESWAN的參數(shù)診斷價(jià)值稍低，僅能區(qū)別正常對(duì)照組分別與F3期、F4期肝纖維化，AUC值分別為0.873、0.886。綜上所述，T*2值較幅度值與血清鐵蛋白的診斷效能高。

本實(shí)驗(yàn)有幾點(diǎn)不足：(1)本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行相位值分析，有報(bào)道相位值可以評(píng)估鐵含量[20]，在將來筆者將進(jìn)一步進(jìn)行這方面的研究。(2)本實(shí)驗(yàn)不是臨床研究而是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

T2

*值、幅度值及血清鐵蛋白能定量診斷肝纖維化以及評(píng)估肝纖維化的嚴(yán)重程度，其中T2*值診斷價(jià)值較高。

表3 觀察者內(nèi)及觀察者間的ESWAN參數(shù)的變異系數(shù)比較Tab.3 Comparison of interobserver and intraobserver variability of parameters of ESWAN

表4 ESWAN參數(shù)值與血清鐵蛋白的ROC曲線診斷肝纖維化Tab.4 Parameters of ESWAN and serum ferritin values in stages of fi brosis

參考文獻(xiàn) [References]

[1] Jiang HQ, Zhang XL. Pathogenesis of hepatic fi brosis. World Chin J Diges, 2000, 8(6): 687-689.姜慧卿, 張曉嵐. 肝纖維化的發(fā)生機(jī)制. 世界華人消化雜志, 2000,8(6): 687-689.

[2] Heintges T, Mohr L, Hensel F, et al. Value of liver biopsy prior to interferon therapy for chronic viral hepatitis. Diges Dis & Sci, 1998,43(7): 1562-1565.

[3] Zamani F, Razmjou S, Akhlaghpoor S, et al.imaging of the liver in thalassemic patients in Iran. World J Gastroenterol, 2011, 17(4): 522-525.

[4] Zhang J. ESWAN in the detection of diffuse axonal injury related hemorrhagic lesions and the investigation of imaging parameters.Wuhan: Huazhong University of Science and Technology, 2010.張菁. ESWAN序列對(duì)DAI出血灶的檢出及其參數(shù)研究. 武漢: 華中科技大學(xué), 2010.

[5] Ramm GA, Ruddell RG. Iron homeostasis, hepatocellular injury,and fi brogenesis in hemochromatosis: the role of in fl ammation in a nonin fl ammatory liver disease. Seminars in Liver Dis, 2010, 30(3):271-287.

[6] Haque M, Koktzoglou L, Li W, et a1. Functional MRI of liver using BOLD MRI: effect of glucose. J Magn Reson Imaging, 2010, 32(4):988-991.

[7] Zhu NY, Yan FH, Wang H. Preliminary study on using IDEALQUANT, and ESWAN imaging technique for evaluating iron deposition in liver fibrosis. J Diagn Concepts Pract, 2014, 13(2):146-151.朱乃懿, 嚴(yán)福華, 王鶴. MR IDEAL-QUANT及ESWAN成像技術(shù)評(píng)估肝纖維化鐵質(zhì)沉積的初步研究. 診斷學(xué)理論與實(shí)踐, 2014,13(2): 146-151.

[8] Ding JR, Pan JL, Mi YC. Application of ESWAN technique in detection siderotic nodules in the cirrhotic liver. J Clin Chin Med Imaging, 2014, 25(9): 664-666.丁建榮, 潘璟琍, 米玉成. ESWAN在檢測肝硬化鐵沉積結(jié)節(jié)中的價(jià)值. 中國臨床醫(yī)學(xué)影像雜志, 2014, 25(9): 664-666.

[9] Zhang L, Duan YY, Yin JK, et al. Grey scale enhancement by a new self-made contrast agent in early cirrhotic stage of rabbit liver. BMC Gastroenterol, 2007, 7(1): 32.

[10] Zeng Y, Zhao JN, Wu W, et al. Establishment of liver fibrosis in rabbit model and quantitative study on hepatic perfusion with dynamic whole liver 3D MR imaging. Chin J Hepatol, 2009, 17(5):350-353.曾燕, 趙建農(nóng), 吳偉, 等. 家兔肝纖維化模型的建立及三維全肝動(dòng)態(tài)磁共振灌注成像對(duì)纖維化分期的量化價(jià)值. 中華肝臟病雜志,2009, 17(5): 350-353.

[11] Data BN. Intraobserver and interobserver variations in liver biopsy interpretation in patients with chronic hepatitis C. Hepatology, 2010,20(1): 15-20.

[12] Anwar M, Wood J, Manwani D, et al. Hepatic iron quanti fi cation on 3 Tesla magnetic resonance (MR): technical challenges and solutions.Radiol Res Pract, 2013, 2013: 628150.

[13] Yuan ZG, Shen Z, Guo LF, et al. Improving detection of sideroticnodules in patients with liver disease using 2D ESWAN technique. Acad Radiol, 2014, 21(8): 971-976.

[14] Ouyang HQ, Gong ZJ, Zha YF, et al. Splenic siderotic nodules in patients with liver cirrhosis. Exp Ther Med, 2013, 6(2): 445-450.[15] Chung YE, Park MS, Kim MS, et al. Quantification of superparamagnetic iron oxide-mediated signal intensity change in patients with liver cirrhosis using T2and T2*mapping: A preliminary report. J Magn Reson Imaging, 2010, 31(6): 1379-1386.

[16] Jin N, Deng J, Chadashvili T, et al. Carbogen gas-challenge BOLD MR imaging in a rat model of diethylnitrosamine-induced liver fi brosis. Radiology, 2010, 254(1): 129-137.

[17] Zhao JY, Li YW, Li L. The role of iron and hepcidin in hepatic fi brosis. Prog Physiol Sci, 2010, 41(3): 183-188.趙晉英, 李艷偉, 李琳. 鐵和鐵調(diào)素在肝纖維化中的作用. 生理科學(xué)進(jìn)展, 2010, 41(3): 183-188.

[18] Manousou P, Kalambokis G, Grillo F, et al. Serum ferritin is a discriminant marker for both fibrosis and inflammation in histologically proven non-alcoholic fatty liver disease patients. Liver Int, 2011, 31(5): 730-739.

[19] Angulo P, George J, Day CP, et al. Serum ferritin levels lack diagnostic accuracy for liver fi brosis in patients with nonalcoholic fatty liver disease. Clin Gastroenterol Hepatol, 2014, 12(7):1163-1169.

[20] Sun LL, Li K, Fu L, et al. Study of phase value from ESWAN in astrocytictumor grading. Chin Comput Med Imag, 2013, 19(2):111-114.孫琳琳, 李克, 付玏, 等. ESWAN序列相位值在星形細(xì)胞腫瘤分級(jí)中的應(yīng)用. 中國醫(yī)學(xué)計(jì)算機(jī)成像雜志, 2013, 19(2):111-114.