淺談牛欄山二鍋頭酒生產(chǎn)中的微生物

魏金旺

（北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠，北京101300）

淺談牛欄山二鍋頭酒生產(chǎn)中的微生物

魏金旺

（北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠，北京101300）

微生物在白酒釀造中具有十分重要的地位，它們所分泌的多種酶類物質(zhì)能夠酶解釀酒原料中的淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素等物質(zhì)，其生長所形成的代謝產(chǎn)物又往往決定了白酒的香型和品質(zhì)，所以微生物可以被稱之為是白酒釀造的靈魂。該文從酵母菌、絲狀真菌、乳酸菌、芽孢桿菌、放線菌這5個方面對牛欄山白酒釀造過程中微生物的種類及變化規(guī)律進行詳細介紹，確定了牛欄山二鍋頭酒發(fā)酵過程中的主要微生物，同時概述了不同微生物的變化規(guī)律及其在發(fā)酵過程中的作用，旨在為牛欄山二鍋頭酒的釀造過程及機理研究提供理論支撐。

牛欄山二鍋頭；釀造；微生物；變化規(guī)律；機理

牛欄山酒廠地處北京市順義區(qū)牛欄山鎮(zhèn)，具有300年的釀酒歷史。其坐落在土地肥沃的燕山腳下，東臨潮、白二河匯合處，屬暖溫帶半濕潤大陸性季風(fēng)性氣候。清初以來，牛欄山釀酒業(yè)就已十分發(fā)達，康熙五十八年《順義縣志》卷二“集鎮(zhèn)”載：牛欄山酒肆茶坊等“鋪店亦數(shù)百家”；其“黃酒、燒酒”為遠近聞名的地方特色“物產(chǎn)”。此后的《順義縣志·實業(yè)志》亦記載：“造酒工：做是工者約百余人（受雇于治內(nèi)十一家燒鍋），所釀之酒為平北特產(chǎn)，銷售鄰縣或平市，頗膾灸人口，而尤以牛欄山之酒為最著”。此處所提的“燒酒”即現(xiàn)在的牛欄山二鍋頭酒。自1952年建廠后，牛欄山二鍋頭憑借清香純正、口味甘洌、酒體醇厚、酒力強勁的特點，逐漸成為我國北方清香型的代表性白酒之一，在國內(nèi)外具有較高的知名度，產(chǎn)品遠銷美國、韓國、日本、加拿大等國家[1-2]。

牛欄山二鍋頭酒的釀造過程是開放式的，獨特的地域微生物在牛欄山二鍋頭釀造中繁衍，經(jīng)過長期的培養(yǎng)和馴化，早已形成了屬于牛欄山二鍋頭的獨特微生物類群。這些微生物不僅賦予了牛欄山二鍋頭獨特的風(fēng)味，同時也形成了外人難以復(fù)制的牛欄山二鍋頭的獨特“秘密之一”。

本文主要從真菌和細菌兩個方面對牛欄山二鍋頭中獨特的生物類群進行介紹，詳細闡釋了牛欄山二鍋頭釀造過程中微生物多樣性、變化規(guī)律及其作用，以期為明確牛欄山二鍋頭主要微生物以及解析牛欄山二鍋頭的釀造機理提供理論支撐。

1 牛欄山白酒釀造微生物多樣性研究

目前，白酒釀造可培養(yǎng)微生物的研究方法主要可分為傳統(tǒng)微生物分離技術(shù)、分子生物學(xué)和分子生態(tài)學(xué)。如馬凱等[3]利用傳統(tǒng)微生物分離方法從汾酒大曲中分離出81株真菌，通過分子生物學(xué)鑒定確定了在汾酒大曲中分布有6個屬的霉菌和4個屬的酵母菌，其中扣囊腹膜孢酵母是優(yōu)勢酵母菌種，傘枝犁頭霉和匍枝根霉是優(yōu)勢霉菌菌種。韓莎等[4]跟蹤汾酒的釀造過程，利用傳統(tǒng)微生物分離方法獲得了微生物菌群的動態(tài)變化，確定了發(fā)酵開始后酵母菌和細菌迅速增殖，在第3天達到最高數(shù)量，隨后開始下降；而霉菌在發(fā)酵開始后卻沒有增長，反而逐漸消失的酒醅微生物變化規(guī)律。雷振河[5]利用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法對汾酒大曲微生物在制曲過程的消長做了初步地統(tǒng)計分析，結(jié)果表明，酵母菌的數(shù)量整體呈先上升后下降趨勢；霉菌的數(shù)量整體呈先上升后下降趨勢；細菌在大曲發(fā)酵過程中的數(shù)量變化呈先上升后下降，再略有上升，然后逐漸下降的趨勢。牛欄山酒廠通過跟蹤發(fā)酵過程，利用傳統(tǒng)微生物分離方法結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)確定了牛欄山白酒中微生物變化規(guī)律，其結(jié)果與韓莎等[5]跟蹤汾酒釀造過程的結(jié)果較為相似，但存在不同之處，牛欄山白酒中微生物主要變化規(guī)律為釀酒酵母和生香酵母在發(fā)酵開始后先快速上升后下降；扣囊覆膜酵母和絲狀真菌數(shù)量在入池時較多隨后逐漸減少；乳酸菌在入池后緩慢上升，在中后期數(shù)量較多；芽孢桿菌數(shù)量基本穩(wěn)定，在發(fā)酵后期數(shù)量出現(xiàn)增長；放線菌數(shù)量較少且維持此穩(wěn)定的變化規(guī)律。

1.1 釀造過程中真菌多樣性

牛欄山二鍋頭釀造過程中的真菌可主要分為絲狀真菌和酵母菌2大類，如圖1所示。由圖1可知，通過跟蹤牛欄山白酒釀造過程微生物演替規(guī)律，在釀造過程中共獲得22種真菌微生物。根據(jù)微生物數(shù)量的變化規(guī)律，將真菌微生物分為5大類：即扣囊覆膜酵母（Saccharomycopsisfibuligera）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、生香酵母類（除釀酒酵母和扣囊覆膜酵母之外酵母的統(tǒng)稱）、橫梗霉類及其他霉菌。這五類真菌分別活躍在牛欄山二鍋頭發(fā)酵的不同時期，對牛欄山二鍋頭的發(fā)酵起著至關(guān)重要的作用。

圖1 牛欄山二鍋頭酒生產(chǎn)中真菌菌種發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of fungi strains in Niulanshan Erguotou Baijiuproduction

1.2 釀造過程中細菌多樣性

在白酒釀造中，細菌往往具有數(shù)量較多、種類豐富等特點，常被認為是“生香動力軍”。牛欄山白酒釀造過程中的主要細菌種類如圖2所示。由圖2可知，通過跟蹤牛欄山白酒釀造過程微生物演替規(guī)律，共獲得細菌類微生物大致可以分為乳酸菌（Lactobacillus）、芽孢桿菌（Bacillus）和放線菌（Actinomycetes）三大類53種，其中乳酸菌25種、芽孢桿菌15種、放線菌13種。

圖2 牛欄山二鍋頭酒生產(chǎn)中細菌菌種發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of bacteria strains in Niulanshan Erguotou Baijiuproduction

2 牛欄山二鍋頭釀造過程中微生物作用

2.1 扣囊覆膜酵母

扣嚢覆膜酵母（S.fibuligera）又名擬內(nèi)孢霉，是一種常見的酵母菌，主要存在于發(fā)酵前期。目前已有研究表明，扣嚢覆膜酵母能產(chǎn)α-淀粉酶，能分解生料和熟料淀粉，也能產(chǎn)生糖化酶，分解淀粉為葡萄糖[6-8]。如陳蕾[9]研究發(fā)現(xiàn)陸地扣囊復(fù)膜酵母能產(chǎn)生高活力的淀粉酶，具有同時水解α-1,4和α-1,6-糖苷鍵的能力。說明扣囊覆膜酵母在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生糖化酶、淀粉酶，將原料中的淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖，為酒醅的正常發(fā)酵提供多種糖類物質(zhì)?？勰腋材そ湍竿瑯舆€具備微弱的產(chǎn)乙醇能力以及生成多種風(fēng)味物質(zhì)和合成多元醇等功能[10-12]，如胡建華等[13]利用擬內(nèi)孢霉進行純甜基酒的生產(chǎn)，通過勾調(diào)、串蒸、強化發(fā)酵等方法確認了擬內(nèi)孢霉可以生成多種純甜物質(zhì)，對酒質(zhì)純甜改善明顯。在牛欄山二鍋頭大曲中廣泛存在，是大曲中的主要真菌。在牛欄山二鍋頭釀造過程中扣囊覆膜酵母由大曲帶入酒醅中參與發(fā)酵，在發(fā)酵前期大量存在，隨著發(fā)酵期的進行，數(shù)量逐漸減少，在頂火期已經(jīng)很難分離到。作為在牛欄山二鍋頭釀造前期的主要酵母菌，扣囊覆膜酵母不僅起到了糖化作用，同時其產(chǎn)生純甜類物質(zhì)可以有效改善基酒的口感，提高基酒質(zhì)量。

2.2 釀酒酵母

釀酒酵母（S.cerevisiae）是一種可以將糖類高效轉(zhuǎn)化為乙醇的酵母，常應(yīng)用于傳統(tǒng)的發(fā)酵行業(yè)（如啤酒、白酒、黃酒等）。在牛欄山二鍋頭釀造過程中，釀酒酵母在大曲中數(shù)量較少，在充當種子進入發(fā)酵環(huán)境后開始增長，隨著發(fā)酵期的進行，釀酒酵母數(shù)量急速增加，在頂火期成為牛欄山二鍋頭發(fā)酵中的主要酵母菌，隨后開始減少，在發(fā)酵后期數(shù)量較少。釀酒酵母主要集中在發(fā)酵中期，其主要的作用是將發(fā)酵環(huán)境中的糖類物質(zhì)在厭氧環(huán)境下轉(zhuǎn)化為乙醇，是牛欄山二鍋頭發(fā)酵的主要產(chǎn)酒菌。研究表明，釀酒酵母在產(chǎn)生乙醇的同時，還會形成以乙酸乙酯為主的多種風(fēng)味物質(zhì)，這些風(fēng)味物質(zhì)在牛欄山二鍋頭的風(fēng)味中發(fā)揮主要作用[14-16]。

2.3 生香酵母

生香酵母不屬于傳統(tǒng)酵母分類學(xué)意義上的名詞，簡單的說是指在生長、繁殖過程中能產(chǎn)生芳香氣味物質(zhì)的酵母的統(tǒng)稱[17]。在牛欄山二鍋頭發(fā)酵過程中，生香酵母主要為扁平云假絲酵母（Candida humilis）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、戴爾凱氏有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）、發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）、異常畢赤酵母（Pichia anomala）及粉狀畢赤酵母（Pichia farinosa），其產(chǎn)酯、產(chǎn)香能力遠高于釀酒酵母。牛欄山二鍋頭發(fā)酵過程中的生香酵母指的是除釀酒酵母和扣囊覆膜酵母以外的酵母菌，這些主要活躍在發(fā)酵的前期和中期，其主要作用是利用發(fā)酵環(huán)境中的糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)及醇類物質(zhì)，在發(fā)酵前期生成大量以乙酸乙酯為主體的酯類及少量酸類、酚類等化合物，起到為基酒增香的重要作用[18-20]。

2.4 橫梗霉類

分支橫梗霉（Lichtheimia ramosa）和傘枝橫梗霉（Lichtheimia corymbifera）同屬于橫梗霉類，是發(fā)酵中的主要絲狀真菌。KIM H R等[21]在研究韓國米酒酒曲Nuruk時發(fā)現(xiàn)，橫梗霉能夠產(chǎn)生α-淀粉酶的能力；FABIANOAG等[22]研究表明，橫梗酶同樣具備產(chǎn)生葡萄糖苷酶的能力。在牛欄山白酒釀造前期存在大量橫梗酶類可以有效地輔助酒醅內(nèi)的酶將淀粉等物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖類，為酒醅的正常發(fā)酵提供前體物質(zhì)。

2.5 其他絲狀真菌

同橫梗霉類相比，米曲霉（Aspergillus oryzae）、卷枝毛霉（Mucor circinelloides）、少根根霉（Rhizopus arrhizus）等其他絲狀真菌在發(fā)酵過程中數(shù)量相對要少，但同樣具有重要作用。如米曲霉可以產(chǎn)淀粉酶、糖化酶、纖維素酶和蛋白酶等；卷枝毛霉可以產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、果膠酶等；謝瓦散囊菌（Eurotium chevalieri）具備較強的纖維素酶活力；微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）和嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus）同屬于嗜熱真菌，可以產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等多種嗜熱酶[23-27]。這些絲狀真菌數(shù)量雖然較少，但卻為發(fā)酵過程提供了多種酶類物質(zhì)，促進原料中淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)等的降解。在牛欄山二鍋頭發(fā)酵前期，絲狀真菌所分泌的多種酶類可以輔助大曲中的酶類，將原料中的直鏈、支鏈淀粉降解為糊精及各種低分子糖類；將大分子蛋白質(zhì)降解為多肽及各種氨基酸；降解輔料中粗纖維、植酸等，為酒醅的后期發(fā)酵提供多種前體物質(zhì)，對白酒發(fā)酵過程中的糖、蛋白質(zhì)代謝起著重要作用。同時，絲狀真菌可以生成少量的乳酸、琥珀酸等多種有機酸及一些呈香物質(zhì)，為酒體風(fēng)格做貢獻。

2.6 乳酸菌

乳酸菌（Lactobacillus）是指能夠代謝糖類，產(chǎn)生大量乳酸的細菌的總稱，是重要的益生菌，具有多種生理保健功能。在牛欄山二鍋頭發(fā)酵過程中，參與發(fā)酵的乳酸菌種類（25種）較多，其中主要有戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、類食品乳桿菌（Lactobacillus paralimentarius）、小片球菌（Pediococcus parvulus）、希氏乳桿菌（Lactobacillus hilgardii）和耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）。乳酸菌主要存在于中后期，可以利用酒醅中的營養(yǎng)成分，通過同型和異型兩種發(fā)酵形式，生成乳酸、乙酸、乙醇及二氧化碳等。這些有機酸是牛欄山二鍋頭重要的色譜骨架成分，適量的酸醇比、酸酯比形成了牛欄山二鍋頭爽口、醇厚等特點。同時有機酸還有助于其他香味成分的產(chǎn)生，這些有機酸與酵母產(chǎn)生的醇類酯化，形成以乳酸乙酯為代表的酯類風(fēng)味物質(zhì)[28-29]。乳酸乙酯是牛欄山二鍋頭主體風(fēng)味之一，適量的乳酸乙酯起到增加牛欄山二鍋頭的后味、協(xié)調(diào)香氣等作用。另外乳酸菌還可以自身合成一類具有活性的多肽和蛋白質(zhì)類物質(zhì)，呈現(xiàn)不可逆的殺菌作用方式，有效地抑制酒醅中雜菌生長[30]，同時對酒醅中的酵母菌生長、代謝也有促進作用，當乳酸菌和酵母菌共同發(fā)酵時，酸、醇、酯等風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)量均高于單菌種發(fā)酵，同時，乳酸菌自溶所產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)可供酵母利用，自溶后產(chǎn)生的酶類、活性成分和多種酸性多糖磷酸質(zhì)，具有一定的糖化作用，在一定程度上提高了酵母菌對淀粉的利用[31-32]。

2.7 芽孢桿菌

芽孢桿菌（Bacillus）是一種能形成芽孢，好氧或兼性厭氧的桿狀細菌，廣泛存在于土壤、水、空氣及動物腸道等處。芽孢桿菌在整個發(fā)酵過程中都可以分離到，是發(fā)酵后期較多的一類微生物。在牛欄山二鍋頭釀造過程中，共有15種芽孢桿菌參與發(fā)酵。芽孢桿菌可以分泌多種胞外酶類物質(zhì)，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，這些酶類可以將原料中的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)水解成糖、氨基酸、甘油和脂肪酸等成分，為其他微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)[29]。同時，芽孢桿菌在發(fā)酵過程中能夠生成一些次生代謝產(chǎn)物改變酒醅微環(huán)境，抑制雜菌生長，維持酒醅正常發(fā)酵[33]。另外，芽孢桿菌也是牛欄山二鍋頭風(fēng)味的重要貢獻菌，尤其是在發(fā)酵的中后期，芽孢桿菌可以生成酯類、醇類、酸類、醛酮類等多種風(fēng)味成分，還可以利用環(huán)境中的氨基酸、蛋白質(zhì)等含氮類物質(zhì)，形成呋喃類、吡嗪類和酚類為主的含氮雜環(huán)類化合物[34-36]。這些化合物雖然含量較少，卻可以呈現(xiàn)出堅果香、烘烤香，是牛欄山二鍋頭風(fēng)味的重要組成成分。

2.8 放線菌

放線菌（Actinomycetes）是細菌家族中的一個獨特的分支，因菌體呈放射線狀生長而得名。在牛欄山二鍋頭釀造過程中，共有13種放線菌參與發(fā)酵，并且數(shù)量變化較為穩(wěn)定。發(fā)酵中的放線菌主要由高溫放線菌（Shimazuella kribbensis）、鏈霉菌（Streptomyces）和小單孢菌（Micromonospora）等組成[37]。周敬波等[38]在對白酒放線菌產(chǎn)酶能力研究中發(fā)現(xiàn)，放線菌可以產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶等，這些酶類可以參與構(gòu)成缸內(nèi)的輔助酶系，作用于酒醅中的淀粉、蛋白質(zhì)及纖維素等營養(yǎng)成分，生成各種氨基酸類及糖類物質(zhì)，為發(fā)酵產(chǎn)酒、產(chǎn)香提供前體物質(zhì)[39]。目前研究表明，多數(shù)放線菌可以產(chǎn)生多種天然藥物成分，如程舉等[40]在近年鏈霉菌次生代謝產(chǎn)物研究進展中指出鏈霉菌屬微生物可合成生物堿、蒽醌、內(nèi)酯、黃酮及酚類等結(jié)構(gòu)多樣的次生代謝產(chǎn)物，這些代謝物質(zhì)往往具備拮抗微生物、抗腫瘤、酶抑制等多種生物活性；張曉敏等[41]在小單孢菌科研究進展中指出小單孢菌具有產(chǎn)生氨基類、大環(huán)內(nèi)酯類、寡糖類、糖類和安沙霉素類抗生素的能力，并且是抗腫瘤活性物質(zhì)的主要來源。另外在牛欄山二鍋頭釀造中的一些高溫放線菌類具有生成多種環(huán)脂肽類的化合物的能力，這類化合物具有抗菌、消炎、抗腫瘤等生物活性[42]。某些鏈霉菌類具有合成復(fù)雜萜烯類化合物的能力，這類化合物普遍具有抗菌和活血化瘀的功效[43]。這些由放線菌產(chǎn)生的天然藥物雖然在白酒中含量極少，但卻賦予白酒重要的保健功能。

3 結(jié)論

白酒的釀造是多菌種在獨特介質(zhì)中繁殖、競爭所形成的復(fù)雜過程。近幾年來隨著微生物學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)、分子生態(tài)學(xué)技術(shù)以及現(xiàn)代風(fēng)味分析技術(shù)的普及，極大地促進了白酒微生物多樣性及其代謝產(chǎn)物的挖掘和應(yīng)用研究。依托以上技術(shù)手段，牛欄山酒廠已初步確認了釀造過程中的微生物變化規(guī)律及主體微生物，并結(jié)合現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)，分析了微生物在牛欄山白酒釀造過程中的主要作用。同時在了解釀造微生物群落組成的基礎(chǔ)上，可以有目的的對釀造過程中的微生物進行產(chǎn)酶、產(chǎn)酒、生香等功能性篩選，并針對特定菌種開展次級代謝產(chǎn)物分析，對其代謝產(chǎn)物進行安全性評估及藥用價值分析等。為為篩選優(yōu)良釀酒微生物及研究牛欄山二鍋頭的釀造機理提供重要的理論支撐。

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《中國釀造》雜志廣告征訂啟事

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Brief discussion on microorganism during Niulanshan ErguotouBaijiuproduction

WEI Jinwang
(Niulanshan Distillery,Beijing Shun Xin Agriculture Co.,Ltd.,Beijing 101301,China)

Microorganisms play an important role inBaijiu-making process,they secrete a variety of enzymes,which can degrade starch,protein,cellulose,etc in raw materials.The metabolites of these microorganisms often determine the flavor and quality ofBaijiu(Chinese liquor),so microorganisms are considered as the soul ofBaijiu-making.The types and change rules of microorganisms includingSaccharomycetes,filamentous fungi,Lactobacillus,Bacillusand actinomycetes,were described in detail to determine the main microbes in the fermentation process of Niulanshan Erguotou Baijiu.The change and the roles of different microorganisms in the fermentation process were summarized,in order to provide theoretical support for the study of the brewing process and mechanism research of the Niulanshan ErguotouBaijiu.

Niulanshan ErguotouBaijiu;brewing;microorganism;change rule;mechanism

TS261.1

0254-5071（2017）04-0001-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.001

2016-12-16

魏金旺（1971-），男，本科，研究方向為白酒釀造微生物。