體外誘導(dǎo)獲取對利奈唑胺耐藥的結(jié)核分枝桿菌菌株及其穩(wěn)定性研究

胡明豪 王彬 付雷 徐建 陸宇

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體外誘導(dǎo)獲取對利奈唑胺耐藥的結(jié)核分枝桿菌菌株及其穩(wěn)定性研究

胡明豪 王彬 付雷 徐建 陸宇

目的 利用濃度2倍遞增的方法體外誘導(dǎo)獲得對利奈唑胺(linezolid，Lzd)耐藥的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)菌株，考察其耐藥穩(wěn)定性及用于篩選新化合物的抗結(jié)核活性。方法 將MTB標準株H37Rv(ATCC27294)在Lzd濃度2倍遞增的含藥固體培養(yǎng)基上進行傳代培養(yǎng)，逐步誘導(dǎo)菌株對Lzd耐藥，運用微孔板阿爾瑪藍(microplate alamar blue assay，MABA)法測定部分抗結(jié)核藥物對體外誘導(dǎo)Lzd耐藥株的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，對體外誘導(dǎo)獲得的Lzd耐藥株測序鑒定rplC基因的突變情況。將誘導(dǎo)Lzd耐藥菌株在無藥固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代培養(yǎng)10代以觀察耐藥穩(wěn)定性變化，包括MIC變化和rplC基因突變情況。結(jié)果 MTB標準株誘導(dǎo)后得到7株單克隆MTB菌株，其對Lzd的MIC值范圍是5.99～18.28 μg/ml，為誘導(dǎo)前(0.25 μg/ml)8倍以上，成功獲得Lzd耐藥株，且對Sutezolid(PNU-100480)同時發(fā)生交叉耐藥，7株菌株均檢測到rplC基因中T460C的突變。體外誘導(dǎo)Lzd耐藥株在無藥固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代10代，MIC值有所下降(范圍為4.71～7.47 μg/ml)，但均穩(wěn)定在誘導(dǎo)前8倍以上。結(jié)論 通過體外誘導(dǎo)實驗可以獲得對2種惡唑烷酮類(Oxazolidinones)藥物均耐藥的MTB耐藥菌株；rplC基因突變與MTB對惡唑烷酮類藥物的耐藥相關(guān)；MTB對惡唑烷酮類藥物的耐藥穩(wěn)定性較強，較難復(fù)敏。

分枝桿菌，結(jié)核； 惡唑烷酮類； 體外研究； 抗藥性，細菌； 連續(xù)傳代

利奈唑胺(linezolid，Lzd)屬于第五組抗結(jié)核藥物[1]，具有良好的抗結(jié)核活性，且獨特的作用機制使得它與傳統(tǒng)抗結(jié)核藥無交叉耐藥性。已有研究提示，Lzd治療耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug resistant tuberculosis，XDR-TB)取得了比較好的臨床效果；但Lzd的主要不良反應(yīng)(外周神經(jīng)炎和骨髓抑制)和高昂的價格也限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用[2-4]。機體在長期或不合理用藥的情況下，可能產(chǎn)生Lzd獲得性耐藥。目前，國內(nèi)外有關(guān)Lzd耐藥的相關(guān)研究報道較少，Lzd耐藥誘導(dǎo)的研究尚缺。由此，筆者擬采用體外誘導(dǎo)耐藥株的方法，獲得耐Lzd的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)菌株，為進一步探討Lzd發(fā)生耐藥的規(guī)律，為干預(yù)Lzd耐藥的發(fā)生、指導(dǎo)臨床合理用藥、克服不良反應(yīng)(篩選活性優(yōu)良的新化合物)等提供幫助。

材料和方法

1.菌株：MTB標準株H37Rv(ATCC27294)為北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所藥物研究室保存菌株。

2.藥物：異煙肼(INH，批號：SLBC3024V)、利福平(RFP，批號：080M1506V)、乙胺丁醇(EMB，批號：050M0034)、環(huán)絲氨酸(Cs，批號：021M1711V)均購自美國Sigma公司。莫西沙星(Mfx，批號：BXFZG31)購自德國Bayer公司。Lzd、PNU-100480、TBA-354為全球結(jié)核病藥物研發(fā)聯(lián)盟(TB Alliance)惠贈。氯苯吩嗪(clofazimine，CFZ；批號：20150328)、貝達喹啉(bedaquiline，TMC207；批號：20150317)、pretomanid(PA-824；批號：20150226)購自上海瀚香生物科技有限公司。卷曲霉素(Cm)購自中國生物制品檢定所。新化合物(編號)：T1～T8等，屬于惡唑烷酮-硝基咪唑類雙功能結(jié)構(gòu)的分子，由丹諾醫(yī)藥(蘇州)有限公司提供。INH、EMB、Cm、Cs用滅菌蒸餾水溶解，其他藥物用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，溶解后用0.22 μm 無菌濾器過濾，-80 ℃保存。

3.試劑：DMSO購自成都化學(xué)試劑廠。7H9、7H11培養(yǎng)基干粉及營養(yǎng)添加劑油酸-白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶(oleic acid albumin dextrose catalase，OADC)購自美國BD公司，應(yīng)用液為含10% OADC的7H9液體培養(yǎng)基和7H11固體培養(yǎng)基。阿爾瑪藍(Alamar blue)購自英國AbD Serotec公司，4 ℃避光保存；Golden view購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司；PCR試劑購自日本Takara公司。

4.儀器：多功能酶標儀購自瑞士Tecan公司，型號Infinite 200 PRO。臺式高速離心機購自德國SIGMA公司，型號3K-15。恒溫培養(yǎng)箱購自上海智城分析儀器制造有限公司，型號ZHWY-100B。紫外分析儀購自北京市六一儀器廠，型號WD-9403D。全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司，型號Tanon-4200。0.22 μm無菌濾器購自美國Millipore公司。

5.Lzd對MTB的最小抑菌濃度(MIC)值測定：用DMSO溶解Lzd并配制成10 mg/ml濃度，分裝保存于-80 ℃，使用時用DMSO稀釋成所需濃度(DMSO終濃度小于1‰)。采用微孔板阿爾瑪藍(microplate alamar blue assay，MABA)二倍稀釋法[5]進行Lzd的MIC值測定：96孔熒光板中每孔加入7H9液體培養(yǎng)基和H37Rv菌懸液[濃度是106菌落形成單位(CFU)/ml]各100 μl，Lzd的濃度分別是20、10、5、2.5、1.25、0.62、0.31、0.16 μg/ml，每板均設(shè)培養(yǎng)基和菌液生長對照孔。96孔熒光板置于37 ℃恒溫箱孵育，6 d后向各孔內(nèi)加入20 μl阿爾瑪藍和12.5 μl 20%的吐溫80混合液，37 ℃恒溫孵育24 h后，將酶標儀測試模式設(shè)置為激發(fā)波長530 nm，發(fā)射波長590 nm，以7H9液體培養(yǎng)基對照孔為背景進行熒光值校正，測定各孔的熒光值，MIC值定義為熒光值的抑制≥90%的最低藥物濃度[6]。

6.體外誘導(dǎo)耐藥實驗：取本實驗室-80 ℃保存的H37Rv，用7H9液體培養(yǎng)基復(fù)蘇后，將其接種于7H11無藥固體培養(yǎng)基上，待菌株培養(yǎng)2～3周至對數(shù)生長期，磨菌并用酶標儀測定其波長570 nm處的吸光度值(A570值；A570=0.1，相當于108CFU/ml)，并用7H9液體培養(yǎng)基將其稀釋至104～105CFU/ml整數(shù)倍濃度，取200 μl稀釋后的菌懸液涂布于含Lzd濃度為1/2的MIC值(0.15 μg/ml)或1倍MIC值(0.3 μg/ml)的7H11固體培養(yǎng)基及空白對照培養(yǎng)基，封膜后置于37 ℃ 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育3～4周。從含Lzd濃度為1倍MIC值的固體培養(yǎng)基上挑取生長良好的單菌落，磨菌并稀釋至104～105CFU/ml整數(shù)倍濃度后，接種于含Lzd濃度為2倍 MIC值(0.6 μg/ml)的7H11固體培養(yǎng)基及空白對照培養(yǎng)基上，封膜后恒溫孵育3～4周，觀察單菌落生長情況。從含Lzd濃度為2倍MIC值的固體培養(yǎng)基上挑取生長良好的單菌落，直接接種于含藥濃度4倍MIC值的固體培養(yǎng)基及空白對照培養(yǎng)基上，封膜后恒溫孵育3～4周，繼續(xù)從含Lzd濃度為4倍MIC值的固體培養(yǎng)基上挑取單菌落直接接種于含藥濃度為8倍MIC值的固體培養(yǎng)基及空白對照培養(yǎng)基上，恒溫孵育3～4周，最終得到在含Lzd濃度為8倍MIC值的固體培養(yǎng)基上生長良好的單菌落。單菌落增菌后，對其MIC值進行測定，根據(jù)參考文獻[7-8]，若誘導(dǎo)后Lzd的MIC值是誘導(dǎo)前的8倍以上，認為誘導(dǎo)耐藥成功。

7.耐藥相關(guān)基因rplC檢測：刮取適量誘導(dǎo)耐藥菌株(包括后續(xù)無藥傳代培養(yǎng)第10代菌株)于1.5 ml EP管，加入200 μl TE緩沖液，煮沸30 min，13 201×g離心10 min，取上清(模板)4 ℃保存?zhèn)溆?。rplC基因PCR實驗[9]：上游引物序列5′-TCCGCTCACCGCATAAGTACA-3′，下游引物序列5′-CGATGTTGGCCGGGACGT-3′(目的片段長度約933 bp)。反應(yīng)體系包含2×PCR混合緩沖液12.5 μl，上下游引物各1 μl，模板3 μl，雙蒸水補充至25 μl。擴增條件：98 ℃預(yù)變性5 min后進入循環(huán)；95 ℃ 30 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)較理想目的條帶后送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進行切膠純化測序，測序結(jié)果用DNAman(V6.0.3.99)軟件進行比對分析。

8.誘導(dǎo)耐藥株的穩(wěn)定性實驗：誘導(dǎo)耐藥株在無藥固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代培養(yǎng)10代，每隔3代測定Lzd、PNU-100480對各菌株的MIC值，觀察其耐藥的穩(wěn)定性變化情況。

9.抗結(jié)核藥物對誘導(dǎo)耐藥株的敏感性實驗：將Lzd耐藥株接種于7H11固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期(2～3周)，再用7H9液體培養(yǎng)基磨菌后制成菌懸液，向96孔熒光板中每孔加入菌液(濃度為106CFU/ml)100 μl。二倍稀釋后，各藥物的濃度范圍如下：INH 0.039～5 μg/ml，RFP 0.039～5 μg/ml，EMB 0.156～20 μg/ml，Lzd 0.156～20 μg/ml，PA-824 0.039～5 μg/ml，Cfz 0.039～5 μg/ml，TMC207 0.039～5 μg/ml，Mfx 0.039～5 μg/ml，Cm 0.078～10 μg/ml，Cs 0.391～50 μg/ml，PNU-100480 0.039～5 μg/ml。測定11種抗結(jié)核藥物(INH、RFP、EMB、Lzd、PA-824、Cfz、TMC207、Mfx、Cm、Cs、PNU-100480)的MIC值，比較誘導(dǎo)前后的MIC值。

10.誘導(dǎo)耐藥株應(yīng)用于新化合物的MIC實驗：選取2株誘導(dǎo)成功的Lzd耐藥菌株，進行新化合物的MIC實驗，MIC測定方法如上述。

結(jié) 果

1．誘導(dǎo)耐藥株的表型驗證(MIC測定)：MABA法測定Lzd對H37Rv的MIC值為0.25 μg/ml。H37Rv經(jīng)體外誘導(dǎo)實驗得到7株Lzd耐藥株，分別命名為L1、L2、L3、L4、L5、L8、L9，其對Lzd的 MIC值范圍為5.99～18.28 μg/ml(表1)，可見誘導(dǎo)菌株對Lzd的MIC值是誘導(dǎo)前的8倍以上，并且對PNU-100480的MIC值也是誘導(dǎo)前的8倍以上，即本試驗成功獲得Lzd耐藥株，這些耐藥株同時對PNU-100480存在交叉耐藥。

表1 各類體外誘導(dǎo)的Lzd耐藥株對Lzd和

注 本實驗體外誘導(dǎo)獲得的Lzd耐藥株分別命名為L1、L2、L3、L4、L5、L8、L9

2.體外誘導(dǎo)Lzd耐藥株基因型驗證(rplC基因檢測)：TE煮沸法獲得體外誘導(dǎo)Lzd耐藥株(包括無藥傳代培養(yǎng)第10代菌株)基因組上清，經(jīng)PCR擴增目的片段(rplC基因)，后進行瓊脂糖凝膠電泳實驗驗證目的片段，將PCR產(chǎn)物進行測序。將測序結(jié)果與H37Rv的rplC基因序列比對后發(fā)現(xiàn)，7株體外誘導(dǎo)Lzd耐藥株均出現(xiàn)rplC基因T460C突變。

3.體外誘導(dǎo)Lzd耐藥株的穩(wěn)定性觀察：將體外誘導(dǎo)獲得的Lzd耐藥株在7H11無藥固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代培養(yǎng)10代，對第3、6、9代菌株進行MIC實驗，各耐藥株對Lzd和PNU-100480的MIC值見表2。

4.抗結(jié)核藥物對Lzd耐藥株的MIC值：測定11種抗結(jié)核藥(INH、RFP、EMB、Lzd、PA-824、Cfz、TMC207、Mfx、Cm、Cs、PNU-100480)對各誘導(dǎo)耐藥菌株的MIC值，具體見表3。

表2 各類體外誘導(dǎo)Lzd耐藥菌株傳代后對Lzd和PNU-100480的MIC值(μg/ml)

注 本實驗體外誘導(dǎo)獲得的Lzd耐藥株分別命名為L1、L2、L3、L4、L5、L8、L9

表3 各類Lzd耐藥菌株對抗結(jié)核藥物的MIC值(μg/ml)

注 本實驗體外誘導(dǎo)獲得的Lzd耐藥株分別命名為L1、L2、L3、L4、L5、L8、L9

表4 各類Lzd耐藥菌株對新化合物的MIC值(μg/ml)

注 L1和L3為本實驗體外誘導(dǎo)獲得的Lzd耐藥株

5.誘導(dǎo)耐藥株應(yīng)用于篩選新化合物(MIC實驗)：參考Lzd對耐藥株的MIC值，選擇2株先誘導(dǎo)獲得的Lzd耐藥株(L1和L3)用于篩選抗結(jié)核活性良好的惡唑烷酮-硝基咪唑類新化合物。相比于Lzd，8個新化合物中的T6對L1和L3菌株抗菌活性相對較好，見表4。

討 論

為提高MDR-TB和XDR-TB患者的臨床治療效果，Lzd被廣泛用于治療復(fù)雜的耐藥結(jié)核病，而廣泛的應(yīng)用有可能導(dǎo)致其耐藥趨勢不斷上升。臨床研究報道，Lzd用于治療MDR-TB有效，但是Lzd的耐藥發(fā)生率在1.9%～10.8%之間[3,7,10]。2007年，Richter等[7]曾首次報道了4株Lzd耐藥的MTB臨床分離株。近來研究顯示， Lzd的耐藥與MTB菌株的rplC基因發(fā)生T460C突變明顯相關(guān)[9,11-12]，本研究與其結(jié)果相符。但是關(guān)于Lzd對MTB耐藥的機制至今仍未能完全闡明。由于Lzd臨床耐藥株較難獲得，后續(xù)關(guān)于Lzd臨床耐藥株的研究也鮮有報道。筆者采用人工體外誘導(dǎo)耐藥的方法，實現(xiàn)MTB菌株由敏感向耐藥的轉(zhuǎn)變，從而成功獲得了體外誘導(dǎo)的Lzd耐藥菌株，為探討Lzd的耐藥機制奠定了基礎(chǔ)，同時對干預(yù)Lzd耐藥的發(fā)生發(fā)展、克服不良反應(yīng)(篩選活性優(yōu)良的新化合物)具有重要意義。

與以往篩選耐藥菌株的研究方法不同[8，13-14]，筆者從1/2 MIC濃度開始誘導(dǎo)，以Lzd濃度2倍遞增的含藥固體培養(yǎng)基對MTB的標準株進行體外誘導(dǎo)耐藥，最終成功誘導(dǎo)出7株Lzd耐藥的MTB菌株，這些菌株同時對PNU-100480也產(chǎn)生了交叉耐藥。結(jié)果表明，在體外藥物長期持續(xù)壓力作用下，MTB可以產(chǎn)生對Lzd的獲得性耐藥，并發(fā)生對其他惡唑烷酮類(如PNU-100480)藥物的交叉耐藥，提示盡管MTB對Lzd耐藥的自然突變率(2×10-8～5×10-9)相對較低[8]，但是耐藥結(jié)核病的治療仍需謹慎使用Lzd，避免獲得性耐藥和交叉耐藥的產(chǎn)生。

本研究中誘導(dǎo)獲得了7株Lzd耐藥菌株，并分別對其表型(誘導(dǎo)后菌株對Lzd的MIC值是誘導(dǎo)前的8倍以上)和基因型(誘導(dǎo)后菌株均出現(xiàn)rplC基因T460C突變)進行了驗證，同時也進一步確證了在藥物長期選擇壓力下，大部分菌株中和獲得性耐藥密切相關(guān)的基因突變被選擇出來，從而對惡唑烷酮類藥物產(chǎn)生耐藥。另外，這些Lzd耐藥株耐藥穩(wěn)定性如何，是否會恢復(fù)突變?yōu)槊舾兄辏€是一直持續(xù)耐藥，目前尚未見相關(guān)報道。本研究將7株Lzd耐藥株在固體培養(yǎng)基上連續(xù)無藥傳代10代，結(jié)果發(fā)現(xiàn)傳代后菌株對2種惡唑烷酮類藥物(Lzd、PNU-100480)的MIC值有波動，但MIC值仍為誘導(dǎo)前的8倍以上；并且對第10代菌株的rplC基因重新進行測序，結(jié)果仍為T460C突變。結(jié)果表明，MTB對惡唑烷酮類藥物的耐藥穩(wěn)定性相對較強，較難復(fù)敏，其機制可能與MTB修復(fù)其適應(yīng)性損失的代償性進化密切相關(guān)[15]。此外，本次研究通過這些Lzd耐藥株對其他抗結(jié)核藥物的藥物敏感性試驗發(fā)現(xiàn)，除了惡唑烷酮類藥物對耐藥株產(chǎn)生交叉耐藥外，EMB對部分Lzd耐藥株(如L4和L8)的MIC值也明顯增高，即EMB對這些菌株的敏感性降低。故EMB和惡唑烷酮類藥物對這些耐藥株是否存在交叉耐藥，這還有待進一步研究。本研究選擇了L1和L3耐藥菌株，應(yīng)用于新化合物的活性篩選，以期篩出活性優(yōu)良并且對Lzd耐藥株有效的惡唑烷酮-硝基咪唑類新化合物。

當然，本研究也存在一定局限。首先，本研究選擇將H37Rv作為親代菌株進行誘導(dǎo)，這樣獲得的體外誘導(dǎo)Lzd耐藥株和Lzd臨床耐藥株可能存在一定差異，不能完全模擬臨床中Lzd發(fā)生耐藥的情況；但同時選擇MTB臨床敏感株作為親代菌株進行誘導(dǎo)，不僅會增加工作量，而且由于MTB敏感株存在差異無法建立統(tǒng)一的誘導(dǎo)方法。其次，本研究獲得的7株Lzd耐藥株發(fā)生耐藥的機制尚未完全明確，為了構(gòu)建更加標準化的新化合物篩選模型，有必要對其耐藥機制作進一步深入研究。

綜上所述，本研究通過體外誘導(dǎo)試驗成功獲得了7株對Lzd耐藥的MTB耐藥菌株，這些耐藥菌株均存在rplC基因的T460C突變，Lzd耐藥菌株的獲得為這類藥物耐藥機制的研究奠定了基礎(chǔ)，達到指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用惡唑烷酮類抗結(jié)核藥物的目的。后期，筆者團隊將繼續(xù)開展這些MTB耐藥菌株進行全基因組測序分析，以進一步探討其對惡唑烷酮類抗結(jié)核藥物的耐藥機制，以及可能存在的EMB與惡唑烷酮類藥物交叉耐藥的機制。

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(本文編輯：李敬文)

Induction in vitro and stability ofMycobacteriumtuberculosisresistance to Linezolid

HUMing-hao,WANGBin,FULei,XUJian,LUYu.

DepartmentofPharmacology,BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute,Beijing101149,China

LUYu,Email:luyu4876@hotmail.com

Objective To gain strains ofMycobacteriumtuberculosis(MTB) resistance with Linezolid (Lzd) utilizing twice increasing concentration inductioninvitro, investigating its stability of drug resistance and using which to screen for anti-tuberculosis (anti-TB) activity of new compounds. Methods MTB standard strains H37Rv (ATCC27294) were sub-cultured on solid culture medium containing twice increasing concentration of Lzd and induced the drug resistance to Lzd. The minimal inhibitory concentrations (MIC) of partial anti-TB drugs against induced drug resistant strainsinvitrowere detected through micro-plate alamar blue assay (MABA),rplCgenes of drug resistant strains obtained from inductioninvitrowere sequenced and identified for mutations. Induced drug resistant strains were continuously subcultured 10 generations on solid medium without drug to observe the resistance stability, including varieties of MIC andrplCgene mutations. Results Seven MTB monoclonal strains were obtained after induction with the MTB standard strains, the ranges of MIC values of Lzd against these strains were 5.99-18.28 μg/ml, which were eight times higher than before (0.25 μg/ml), drug resistant strains were successfully acquired and were resistant to Sutezolid (PNU-100480) simultaneously. T460C mutation in generplCwas detected in all 7 strains by sequencing. After 10 serially generations on solid culture medium without drug, MIC values of induced drug resistant strains were slightly declined (4.71-7.47 μg/ml), but all were stable for more than eight times than before. Conclusion MTB strains resistant to two kinds of Oxazolidinones antibiotic were obtained by inductioninvitro. Mutation ofrplCgene was related to Oxazolidinones antibiotic drug resistance of MTB. Drug resistant stability of MTB to Oxazolidinones antibiotic was strong, and it is difficult for MTB to resume susceptibility.

Mycobacteriumtuberculosis; Oxazolidinones;Invitro; Drug resistance, bacterial; Serial passage

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.04.017

“十二五”國家科技重大專項(2015ZX09102007-015)；北京市醫(yī)院管理局“登峰”計劃(DFL20151501)

101149 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院耐藥結(jié)核病研究北京市重點實驗室 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所藥物研究室

陸宇，Email：luyu4876@hotmail.com

2016-12-05)