• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    體外誘導(dǎo)獲取對利奈唑胺耐藥的結(jié)核分枝桿菌菌株及其穩(wěn)定性研究

    2017-04-27 07:52:02胡明豪王彬付雷徐建陸宇
    中國防癆雜志 2017年4期
    關(guān)鍵詞:酮類抗結(jié)核耐藥

    胡明豪 王彬 付雷 徐建 陸宇

    ?

    體外誘導(dǎo)獲取對利奈唑胺耐藥的結(jié)核分枝桿菌菌株及其穩(wěn)定性研究

    胡明豪 王彬 付雷 徐建 陸宇

    目的 利用濃度2倍遞增的方法體外誘導(dǎo)獲得對利奈唑胺(linezolid,Lzd)耐藥的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)菌株,考察其耐藥穩(wěn)定性及用于篩選新化合物的抗結(jié)核活性。方法 將MTB標準株H37Rv(ATCC27294)在Lzd濃度2倍遞增的含藥固體培養(yǎng)基上進行傳代培養(yǎng),逐步誘導(dǎo)菌株對Lzd耐藥,運用微孔板阿爾瑪藍(microplate alamar blue assay,MABA)法測定部分抗結(jié)核藥物對體外誘導(dǎo)Lzd耐藥株的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC),對體外誘導(dǎo)獲得的Lzd耐藥株測序鑒定rplC基因的突變情況。將誘導(dǎo)Lzd耐藥菌株在無藥固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代培養(yǎng)10代以觀察耐藥穩(wěn)定性變化,包括MIC變化和rplC基因突變情況。結(jié)果 MTB標準株誘導(dǎo)后得到7株單克隆MTB菌株,其對Lzd的MIC值范圍是5.99~18.28 μg/ml,為誘導(dǎo)前(0.25 μg/ml)8倍以上,成功獲得Lzd耐藥株,且對Sutezolid(PNU-100480)同時發(fā)生交叉耐藥,7株菌株均檢測到rplC基因中T460C的突變。體外誘導(dǎo)Lzd耐藥株在無藥固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代10代,MIC值有所下降(范圍為4.71~7.47 μg/ml),但均穩(wěn)定在誘導(dǎo)前8倍以上。結(jié)論 通過體外誘導(dǎo)實驗可以獲得對2種惡唑烷酮類(Oxazolidinones)藥物均耐藥的MTB耐藥菌株;rplC基因突變與MTB對惡唑烷酮類藥物的耐藥相關(guān);MTB對惡唑烷酮類藥物的耐藥穩(wěn)定性較強,較難復(fù)敏。

    分枝桿菌,結(jié)核; 惡唑烷酮類; 體外研究; 抗藥性,細菌; 連續(xù)傳代

    利奈唑胺(linezolid,Lzd)屬于第五組抗結(jié)核藥物[1],具有良好的抗結(jié)核活性,且獨特的作用機制使得它與傳統(tǒng)抗結(jié)核藥無交叉耐藥性。已有研究提示,Lzd治療耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug resistant tuberculosis,XDR-TB)取得了比較好的臨床效果;但Lzd的主要不良反應(yīng)(外周神經(jīng)炎和骨髓抑制)和高昂的價格也限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用[2-4]。機體在長期或不合理用藥的情況下,可能產(chǎn)生Lzd獲得性耐藥。目前,國內(nèi)外有關(guān)Lzd耐藥的相關(guān)研究報道較少,Lzd耐藥誘導(dǎo)的研究尚缺。由此,筆者擬采用體外誘導(dǎo)耐藥株的方法,獲得耐Lzd的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)菌株,為進一步探討Lzd發(fā)生耐藥的規(guī)律,為干預(yù)Lzd耐藥的發(fā)生、指導(dǎo)臨床合理用藥、克服不良反應(yīng)(篩選活性優(yōu)良的新化合物)等提供幫助。

    材料和方法

    1.菌株:MTB標準株H37Rv(ATCC27294)為北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所藥物研究室保存菌株。

    2.藥物:異煙肼(INH,批號:SLBC3024V)、利福平(RFP,批號:080M1506V)、乙胺丁醇(EMB,批號:050M0034)、環(huán)絲氨酸(Cs,批號:021M1711V)均購自美國Sigma公司。莫西沙星(Mfx,批號:BXFZG31)購自德國Bayer公司。Lzd、PNU-100480、TBA-354為全球結(jié)核病藥物研發(fā)聯(lián)盟(TB Alliance)惠贈。氯苯吩嗪(clofazimine,CFZ;批號:20150328)、貝達喹啉(bedaquiline,TMC207;批號:20150317)、pretomanid(PA-824;批號:20150226)購自上海瀚香生物科技有限公司。卷曲霉素(Cm)購自中國生物制品檢定所。新化合物(編號):T1~T8等,屬于惡唑烷酮-硝基咪唑類雙功能結(jié)構(gòu)的分子,由丹諾醫(yī)藥(蘇州)有限公司提供。INH、EMB、Cm、Cs用滅菌蒸餾水溶解,其他藥物用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解,溶解后用0.22 μm 無菌濾器過濾,-80 ℃保存。

    3.試劑:DMSO購自成都化學(xué)試劑廠。7H9、7H11培養(yǎng)基干粉及營養(yǎng)添加劑油酸-白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶(oleic acid albumin dextrose catalase,OADC)購自美國BD公司,應(yīng)用液為含10% OADC的7H9液體培養(yǎng)基和7H11固體培養(yǎng)基。阿爾瑪藍(Alamar blue)購自英國AbD Serotec公司,4 ℃避光保存;Golden view購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司;PCR試劑購自日本Takara公司。

    4.儀器:多功能酶標儀購自瑞士Tecan公司,型號Infinite 200 PRO。臺式高速離心機購自德國SIGMA公司,型號3K-15。恒溫培養(yǎng)箱購自上海智城分析儀器制造有限公司,型號ZHWY-100B。紫外分析儀購自北京市六一儀器廠,型號WD-9403D。全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司,型號Tanon-4200。0.22 μm無菌濾器購自美國Millipore公司。

    5.Lzd對MTB的最小抑菌濃度(MIC)值測定:用DMSO溶解Lzd并配制成10 mg/ml濃度,分裝保存于-80 ℃,使用時用DMSO稀釋成所需濃度(DMSO終濃度小于1‰)。采用微孔板阿爾瑪藍(microplate alamar blue assay,MABA)二倍稀釋法[5]進行Lzd的MIC值測定:96孔熒光板中每孔加入7H9液體培養(yǎng)基和H37Rv菌懸液[濃度是106菌落形成單位(CFU)/ml]各100 μl,Lzd的濃度分別是20、10、5、2.5、1.25、0.62、0.31、0.16 μg/ml,每板均設(shè)培養(yǎng)基和菌液生長對照孔。96孔熒光板置于37 ℃恒溫箱孵育,6 d后向各孔內(nèi)加入20 μl阿爾瑪藍和12.5 μl 20%的吐溫80混合液,37 ℃恒溫孵育24 h后,將酶標儀測試模式設(shè)置為激發(fā)波長530 nm,發(fā)射波長590 nm,以7H9液體培養(yǎng)基對照孔為背景進行熒光值校正,測定各孔的熒光值,MIC值定義為熒光值的抑制≥90%的最低藥物濃度[6]。

    6.體外誘導(dǎo)耐藥實驗:取本實驗室-80 ℃保存的H37Rv,用7H9液體培養(yǎng)基復(fù)蘇后,將其接種于7H11無藥固體培養(yǎng)基上,待菌株培養(yǎng)2~3周至對數(shù)生長期,磨菌并用酶標儀測定其波長570 nm處的吸光度值(A570值;A570=0.1,相當于108CFU/ml),并用7H9液體培養(yǎng)基將其稀釋至104~105CFU/ml整數(shù)倍濃度,取200 μl稀釋后的菌懸液涂布于含Lzd濃度為1/2的MIC值(0.15 μg/ml)或1倍MIC值(0.3 μg/ml)的7H11固體培養(yǎng)基及空白對照培養(yǎng)基,封膜后置于37 ℃ 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育3~4周。從含Lzd濃度為1倍MIC值的固體培養(yǎng)基上挑取生長良好的單菌落,磨菌并稀釋至104~105CFU/ml整數(shù)倍濃度后,接種于含Lzd濃度為2倍 MIC值(0.6 μg/ml)的7H11固體培養(yǎng)基及空白對照培養(yǎng)基上,封膜后恒溫孵育3~4周,觀察單菌落生長情況。從含Lzd濃度為2倍MIC值的固體培養(yǎng)基上挑取生長良好的單菌落,直接接種于含藥濃度4倍MIC值的固體培養(yǎng)基及空白對照培養(yǎng)基上,封膜后恒溫孵育3~4周,繼續(xù)從含Lzd濃度為4倍MIC值的固體培養(yǎng)基上挑取單菌落直接接種于含藥濃度為8倍MIC值的固體培養(yǎng)基及空白對照培養(yǎng)基上,恒溫孵育3~4周,最終得到在含Lzd濃度為8倍MIC值的固體培養(yǎng)基上生長良好的單菌落。單菌落增菌后,對其MIC值進行測定,根據(jù)參考文獻[7-8],若誘導(dǎo)后Lzd的MIC值是誘導(dǎo)前的8倍以上,認為誘導(dǎo)耐藥成功。

    7.耐藥相關(guān)基因rplC檢測:刮取適量誘導(dǎo)耐藥菌株(包括后續(xù)無藥傳代培養(yǎng)第10代菌株)于1.5 ml EP管,加入200 μl TE緩沖液,煮沸30 min,13 201×g離心10 min,取上清(模板)4 ℃保存?zhèn)溆?。rplC基因PCR實驗[9]:上游引物序列5′-TCCGCTCACCGCATAAGTACA-3′,下游引物序列5′-CGATGTTGGCCGGGACGT-3′(目的片段長度約933 bp)。反應(yīng)體系包含2×PCR混合緩沖液12.5 μl,上下游引物各1 μl,模板3 μl,雙蒸水補充至25 μl。擴增條件:98 ℃預(yù)變性5 min后進入循環(huán);95 ℃ 30 s,58 ℃ 10 s,72 ℃ 1 min,35個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)較理想目的條帶后送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進行切膠純化測序,測序結(jié)果用DNAman(V6.0.3.99)軟件進行比對分析。

    8.誘導(dǎo)耐藥株的穩(wěn)定性實驗:誘導(dǎo)耐藥株在無藥固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代培養(yǎng)10代,每隔3代測定Lzd、PNU-100480對各菌株的MIC值,觀察其耐藥的穩(wěn)定性變化情況。

    9.抗結(jié)核藥物對誘導(dǎo)耐藥株的敏感性實驗:將Lzd耐藥株接種于7H11固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期(2~3周),再用7H9液體培養(yǎng)基磨菌后制成菌懸液,向96孔熒光板中每孔加入菌液(濃度為106CFU/ml)100 μl。二倍稀釋后,各藥物的濃度范圍如下:INH 0.039~5 μg/ml,RFP 0.039~5 μg/ml,EMB 0.156~20 μg/ml,Lzd 0.156~20 μg/ml,PA-824 0.039~5 μg/ml,Cfz 0.039~5 μg/ml,TMC207 0.039~5 μg/ml,Mfx 0.039~5 μg/ml,Cm 0.078~10 μg/ml,Cs 0.391~50 μg/ml,PNU-100480 0.039~5 μg/ml。測定11種抗結(jié)核藥物(INH、RFP、EMB、Lzd、PA-824、Cfz、TMC207、Mfx、Cm、Cs、PNU-100480)的MIC值,比較誘導(dǎo)前后的MIC值。

    10.誘導(dǎo)耐藥株應(yīng)用于新化合物的MIC實驗:選取2株誘導(dǎo)成功的Lzd耐藥菌株,進行新化合物的MIC實驗,MIC測定方法如上述。

    結(jié) 果

    1.誘導(dǎo)耐藥株的表型驗證(MIC測定):MABA法測定Lzd對H37Rv的MIC值為0.25 μg/ml。H37Rv經(jīng)體外誘導(dǎo)實驗得到7株Lzd耐藥株,分別命名為L1、L2、L3、L4、L5、L8、L9,其對Lzd的 MIC值范圍為5.99~18.28 μg/ml(表1),可見誘導(dǎo)菌株對Lzd的MIC值是誘導(dǎo)前的8倍以上,并且對PNU-100480的MIC值也是誘導(dǎo)前的8倍以上,即本試驗成功獲得Lzd耐藥株,這些耐藥株同時對PNU-100480存在交叉耐藥。

    表1 各類體外誘導(dǎo)的Lzd耐藥株對Lzd和

    注 本實驗體外誘導(dǎo)獲得的Lzd耐藥株分別命名為L1、L2、L3、L4、L5、L8、L9

    2.體外誘導(dǎo)Lzd耐藥株基因型驗證(rplC基因檢測):TE煮沸法獲得體外誘導(dǎo)Lzd耐藥株(包括無藥傳代培養(yǎng)第10代菌株)基因組上清,經(jīng)PCR擴增目的片段(rplC基因),后進行瓊脂糖凝膠電泳實驗驗證目的片段,將PCR產(chǎn)物進行測序。將測序結(jié)果與H37Rv的rplC基因序列比對后發(fā)現(xiàn),7株體外誘導(dǎo)Lzd耐藥株均出現(xiàn)rplC基因T460C突變。

    3.體外誘導(dǎo)Lzd耐藥株的穩(wěn)定性觀察:將體外誘導(dǎo)獲得的Lzd耐藥株在7H11無藥固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代培養(yǎng)10代,對第3、6、9代菌株進行MIC實驗,各耐藥株對Lzd和PNU-100480的MIC值見表2。

    4.抗結(jié)核藥物對Lzd耐藥株的MIC值:測定11種抗結(jié)核藥(INH、RFP、EMB、Lzd、PA-824、Cfz、TMC207、Mfx、Cm、Cs、PNU-100480)對各誘導(dǎo)耐藥菌株的MIC值,具體見表3。

    表2 各類體外誘導(dǎo)Lzd耐藥菌株傳代后對Lzd和PNU-100480的MIC值(μg/ml)

    注 本實驗體外誘導(dǎo)獲得的Lzd耐藥株分別命名為L1、L2、L3、L4、L5、L8、L9

    表3 各類Lzd耐藥菌株對抗結(jié)核藥物的MIC值(μg/ml)

    注 本實驗體外誘導(dǎo)獲得的Lzd耐藥株分別命名為L1、L2、L3、L4、L5、L8、L9

    表4 各類Lzd耐藥菌株對新化合物的MIC值(μg/ml)

    注 L1和L3為本實驗體外誘導(dǎo)獲得的Lzd耐藥株

    5.誘導(dǎo)耐藥株應(yīng)用于篩選新化合物(MIC實驗):參考Lzd對耐藥株的MIC值,選擇2株先誘導(dǎo)獲得的Lzd耐藥株(L1和L3)用于篩選抗結(jié)核活性良好的惡唑烷酮-硝基咪唑類新化合物。相比于Lzd,8個新化合物中的T6對L1和L3菌株抗菌活性相對較好,見表4。

    討 論

    為提高MDR-TB和XDR-TB患者的臨床治療效果,Lzd被廣泛用于治療復(fù)雜的耐藥結(jié)核病,而廣泛的應(yīng)用有可能導(dǎo)致其耐藥趨勢不斷上升。臨床研究報道,Lzd用于治療MDR-TB有效,但是Lzd的耐藥發(fā)生率在1.9%~10.8%之間[3,7,10]。2007年,Richter等[7]曾首次報道了4株Lzd耐藥的MTB臨床分離株。近來研究顯示, Lzd的耐藥與MTB菌株的rplC基因發(fā)生T460C突變明顯相關(guān)[9,11-12],本研究與其結(jié)果相符。但是關(guān)于Lzd對MTB耐藥的機制至今仍未能完全闡明。由于Lzd臨床耐藥株較難獲得,后續(xù)關(guān)于Lzd臨床耐藥株的研究也鮮有報道。筆者采用人工體外誘導(dǎo)耐藥的方法,實現(xiàn)MTB菌株由敏感向耐藥的轉(zhuǎn)變,從而成功獲得了體外誘導(dǎo)的Lzd耐藥菌株,為探討Lzd的耐藥機制奠定了基礎(chǔ),同時對干預(yù)Lzd耐藥的發(fā)生發(fā)展、克服不良反應(yīng)(篩選活性優(yōu)良的新化合物)具有重要意義。

    與以往篩選耐藥菌株的研究方法不同[8,13-14],筆者從1/2 MIC濃度開始誘導(dǎo),以Lzd濃度2倍遞增的含藥固體培養(yǎng)基對MTB的標準株進行體外誘導(dǎo)耐藥,最終成功誘導(dǎo)出7株Lzd耐藥的MTB菌株,這些菌株同時對PNU-100480也產(chǎn)生了交叉耐藥。結(jié)果表明,在體外藥物長期持續(xù)壓力作用下,MTB可以產(chǎn)生對Lzd的獲得性耐藥,并發(fā)生對其他惡唑烷酮類(如PNU-100480)藥物的交叉耐藥,提示盡管MTB對Lzd耐藥的自然突變率(2×10-8~5×10-9)相對較低[8],但是耐藥結(jié)核病的治療仍需謹慎使用Lzd,避免獲得性耐藥和交叉耐藥的產(chǎn)生。

    本研究中誘導(dǎo)獲得了7株Lzd耐藥菌株,并分別對其表型(誘導(dǎo)后菌株對Lzd的MIC值是誘導(dǎo)前的8倍以上)和基因型(誘導(dǎo)后菌株均出現(xiàn)rplC基因T460C突變)進行了驗證,同時也進一步確證了在藥物長期選擇壓力下,大部分菌株中和獲得性耐藥密切相關(guān)的基因突變被選擇出來,從而對惡唑烷酮類藥物產(chǎn)生耐藥。另外,這些Lzd耐藥株耐藥穩(wěn)定性如何,是否會恢復(fù)突變?yōu)槊舾兄辏€是一直持續(xù)耐藥,目前尚未見相關(guān)報道。本研究將7株Lzd耐藥株在固體培養(yǎng)基上連續(xù)無藥傳代10代,結(jié)果發(fā)現(xiàn)傳代后菌株對2種惡唑烷酮類藥物(Lzd、PNU-100480)的MIC值有波動,但MIC值仍為誘導(dǎo)前的8倍以上;并且對第10代菌株的rplC基因重新進行測序,結(jié)果仍為T460C突變。結(jié)果表明,MTB對惡唑烷酮類藥物的耐藥穩(wěn)定性相對較強,較難復(fù)敏,其機制可能與MTB修復(fù)其適應(yīng)性損失的代償性進化密切相關(guān)[15]。此外,本次研究通過這些Lzd耐藥株對其他抗結(jié)核藥物的藥物敏感性試驗發(fā)現(xiàn),除了惡唑烷酮類藥物對耐藥株產(chǎn)生交叉耐藥外,EMB對部分Lzd耐藥株(如L4和L8)的MIC值也明顯增高,即EMB對這些菌株的敏感性降低。故EMB和惡唑烷酮類藥物對這些耐藥株是否存在交叉耐藥,這還有待進一步研究。本研究選擇了L1和L3耐藥菌株,應(yīng)用于新化合物的活性篩選,以期篩出活性優(yōu)良并且對Lzd耐藥株有效的惡唑烷酮-硝基咪唑類新化合物。

    當然,本研究也存在一定局限。首先,本研究選擇將H37Rv作為親代菌株進行誘導(dǎo),這樣獲得的體外誘導(dǎo)Lzd耐藥株和Lzd臨床耐藥株可能存在一定差異,不能完全模擬臨床中Lzd發(fā)生耐藥的情況;但同時選擇MTB臨床敏感株作為親代菌株進行誘導(dǎo),不僅會增加工作量,而且由于MTB敏感株存在差異無法建立統(tǒng)一的誘導(dǎo)方法。其次,本研究獲得的7株Lzd耐藥株發(fā)生耐藥的機制尚未完全明確,為了構(gòu)建更加標準化的新化合物篩選模型,有必要對其耐藥機制作進一步深入研究。

    綜上所述,本研究通過體外誘導(dǎo)試驗成功獲得了7株對Lzd耐藥的MTB耐藥菌株,這些耐藥菌株均存在rplC基因的T460C突變,Lzd耐藥菌株的獲得為這類藥物耐藥機制的研究奠定了基礎(chǔ),達到指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用惡唑烷酮類抗結(jié)核藥物的目的。后期,筆者團隊將繼續(xù)開展這些MTB耐藥菌株進行全基因組測序分析,以進一步探討其對惡唑烷酮類抗結(jié)核藥物的耐藥機制,以及可能存在的EMB與惡唑烷酮類藥物交叉耐藥的機制。

    [1] 中國防癆協(xié)會. 耐藥結(jié)核病化學(xué)治療指南(2015). 中國防癆雜志, 2015, 37(5): 421-469.

    [2] Swaney SM, Aoki H, Ganoza MC, et al. The oxazolidinone linezolid inhibits initiation of protein synthesis in bacteria. Antimicrob Agents Chemother, 1998, 42(12): 3251-3255.

    [3] Lee M, Lee J, Carroll MW, et al. Linezolid for treatment of chronic extensively drug-resistant tuberculosis. N Engl J Med, 2012, 367(16): 1508-1518.

    [4] Hoagland DT, Liu J, Lee RB, et al. New agents for the treatment of drug-resistantMycobacteriumtuberculosis. Adv Drug Deliv Rev, 2016, 102: 55-72.

    [5] 陸宇, 王彬, 鄭梅琴, 等. 應(yīng)用A1amar Blue和MTT測定抗結(jié)核藥物最低抑菌濃度的研究. 中國防癆雜志, 2007, 29(6): 499-501.

    [6] 鄭梅琴, 陸宇, 王彬, 等. Alamar blue法檢測藥物細胞內(nèi)抗結(jié)核活性的研究. 中國抗生素雜志, 2011, 36(6): 468-473.

    [7] Richter E, Rüsch-Gerdes S, Hillemann D. First linezolid-resistant clinical isolates ofMycobacteriumtuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(4): 1534-1536.

    [8] Hillemann D, Rüsch-Gerdes S, Richter E. In vitro-selected linezolid-resistantMycobacteriumtuberculosismutants. Antimicrob Agents Chemother, 2008, 52(2): 800-801.

    [9] Zhang S, Chen J, Cui P, et al.Mycobacteriumtuberculosismutations associated with reduced susceptibility to linezolid. Antimicrob Agents Chemother, 2016, 60(4): 2542-2544.

    [10] Zhang Z, Pang Y, Wang YF, et al. Beijing genotype ofMycobacteriumtuberculosisis significantly associated with linezolid resistance in multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis in China. Int J Antimicrob Agents, 2014, 43(3): 231-235.

    [11] Beckert P, Hillemann D, Kohl TA, et al. rplC T460C identified as a dominant mutation in linezolid-resistantMycobacteriumtuberculosisstrains. Antimicrob Agents Chemother, 2012, 56(5): 2743-2745.

    [12] Makafe GG, Cao Y, Tan Y, et al. Role of the Cys154Arg substitution in ribosomal protein L3 in oxazolidinone resistance inMycobacteriumtuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 2016, 60(5): 3202-3206.

    [13] Siddiqi S, Takhar P, Baldeviano C, et al. Isoniazid induces its own resistance in nonreplicatingMycobacteriumtuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(6): 2100-2104.

    [14] Malik M, Chavda K, Zhao X, et al. Induction of mycobacterial resistance to quinolone class antimicrobials. Antimicrob Agents Chemother, 2012, 56(7): 3879-3887.

    [15] Andersson DI, Hughes D. Antibiotic resistance and its cost: is it possible to reverse resistance? Nat Rev Microbiol, 2010, 8(4): 260-271.

    (本文編輯:李敬文)

    Induction in vitro and stability ofMycobacteriumtuberculosisresistance to Linezolid

    HUMing-hao,WANGBin,FULei,XUJian,LUYu.

    DepartmentofPharmacology,BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute,Beijing101149,China

    LUYu,Email:luyu4876@hotmail.com

    Objective To gain strains ofMycobacteriumtuberculosis(MTB) resistance with Linezolid (Lzd) utilizing twice increasing concentration inductioninvitro, investigating its stability of drug resistance and using which to screen for anti-tuberculosis (anti-TB) activity of new compounds. Methods MTB standard strains H37Rv (ATCC27294) were sub-cultured on solid culture medium containing twice increasing concentration of Lzd and induced the drug resistance to Lzd. The minimal inhibitory concentrations (MIC) of partial anti-TB drugs against induced drug resistant strainsinvitrowere detected through micro-plate alamar blue assay (MABA),rplCgenes of drug resistant strains obtained from inductioninvitrowere sequenced and identified for mutations. Induced drug resistant strains were continuously subcultured 10 generations on solid medium without drug to observe the resistance stability, including varieties of MIC andrplCgene mutations. Results Seven MTB monoclonal strains were obtained after induction with the MTB standard strains, the ranges of MIC values of Lzd against these strains were 5.99-18.28 μg/ml, which were eight times higher than before (0.25 μg/ml), drug resistant strains were successfully acquired and were resistant to Sutezolid (PNU-100480) simultaneously. T460C mutation in generplCwas detected in all 7 strains by sequencing. After 10 serially generations on solid culture medium without drug, MIC values of induced drug resistant strains were slightly declined (4.71-7.47 μg/ml), but all were stable for more than eight times than before. Conclusion MTB strains resistant to two kinds of Oxazolidinones antibiotic were obtained by inductioninvitro. Mutation ofrplCgene was related to Oxazolidinones antibiotic drug resistance of MTB. Drug resistant stability of MTB to Oxazolidinones antibiotic was strong, and it is difficult for MTB to resume susceptibility.

    Mycobacteriumtuberculosis; Oxazolidinones;Invitro; Drug resistance, bacterial; Serial passage

    10.3969/j.issn.1000-6621.2017.04.017

    “十二五”國家科技重大專項(2015ZX09102007-015);北京市醫(yī)院管理局“登峰”計劃(DFL20151501)

    101149 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院耐藥結(jié)核病研究北京市重點實驗室 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所藥物研究室

    陸宇,Email:luyu4876@hotmail.com

    2016-12-05)

    猜你喜歡
    酮類抗結(jié)核耐藥
    如何判斷靶向治療耐藥
    miR-181a在卵巢癌細胞中對順鉑的耐藥作用
    抗結(jié)核藥物不良反應(yīng)376例分析
    梵凈山土壤鏈霉菌Streptomyces sp. FJS 31-2生產(chǎn)的Ⅲ型聚酮類化合物
    冬蟲夏草定殖菌Aspergillus fumigatus中一個新的聚酮類化合物
    貴州夏枯草的抗結(jié)核化學(xué)成分研究
    鏈霉菌CPCC 203702中抗結(jié)核分枝桿菌活性次級代謝產(chǎn)物的分離與鑒定
    3-芳基苯并呋喃酮類化合物的合成
    中國塑料(2015年10期)2015-10-14 01:13:13
    主要高危人群抗結(jié)核治療不良反應(yīng)發(fā)生情況分析
    PDCA循環(huán)法在多重耐藥菌感染監(jiān)控中的應(yīng)用
    欧美在线黄色| 一区二区三区国产精品乱码| 日韩有码中文字幕| av天堂久久9| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 午夜精品国产一区二区电影| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲熟妇熟女久久| 美女扒开内裤让男人捅视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲成a人片在线一区二区| av福利片在线| 男女高潮啪啪啪动态图| 怎么达到女性高潮| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 日韩免费av在线播放| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲全国av大片| 午夜福利视频在线观看免费| 99热只有精品国产| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲精品自拍成人| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产成人免费观看mmmm| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 高潮久久久久久久久久久不卡| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲av片天天在线观看| 不卡av一区二区三区| 一二三四在线观看免费中文在| 国产在视频线精品| 亚洲一区中文字幕在线| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 91精品三级在线观看| 久久久久久久午夜电影 | 天堂√8在线中文| 十八禁网站免费在线| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 视频区欧美日本亚洲| av超薄肉色丝袜交足视频| 制服诱惑二区| 精品少妇久久久久久888优播| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 18禁国产床啪视频网站| 中文欧美无线码| √禁漫天堂资源中文www| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 十八禁高潮呻吟视频| 久久香蕉国产精品| 极品人妻少妇av视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 成人av一区二区三区在线看| 中文亚洲av片在线观看爽 | 精品久久久久久久久久免费视频 | 欧美色视频一区免费| 美女 人体艺术 gogo| 91麻豆av在线| www.精华液| 美女高潮到喷水免费观看| 大码成人一级视频| 99久久综合精品五月天人人| 人妻久久中文字幕网| www.精华液| 丁香六月欧美| 亚洲成人手机| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 国产熟女午夜一区二区三区| 91麻豆av在线| 搡老乐熟女国产| 精品国内亚洲2022精品成人 | 免费观看人在逋| 视频区欧美日本亚洲| 久久精品成人免费网站| 中文欧美无线码| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 两人在一起打扑克的视频| 中文字幕色久视频| 老司机福利观看| 日韩欧美在线二视频 | 国产不卡av网站在线观看| 91成年电影在线观看| 国产精品av久久久久免费| 视频在线观看一区二区三区| 国产精品 欧美亚洲| 国产xxxxx性猛交| 亚洲av熟女| 国产精品亚洲av一区麻豆| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 久久久久久人人人人人| 久久久国产精品麻豆| 国产麻豆69| 男男h啪啪无遮挡| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 欧美激情高清一区二区三区| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲国产精品合色在线| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 中文欧美无线码| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产精品.久久久| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 成人永久免费在线观看视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 麻豆国产av国片精品| 国精品久久久久久国模美| 老汉色∧v一级毛片| 国产欧美亚洲国产| 性少妇av在线| 9热在线视频观看99| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲熟女精品中文字幕| 又黄又粗又硬又大视频| 在线观看一区二区三区激情| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲情色 制服丝袜| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 一级毛片高清免费大全| 女性生殖器流出的白浆| 视频在线观看一区二区三区| 国产成人精品久久二区二区91| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 在线播放国产精品三级| 女性被躁到高潮视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 香蕉国产在线看| 五月开心婷婷网| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 人妻久久中文字幕网| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 制服人妻中文乱码| 黑人操中国人逼视频| av免费在线观看网站| 婷婷成人精品国产| av中文乱码字幕在线| 精品国产美女av久久久久小说| 欧美日本中文国产一区发布| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产亚洲一区二区精品| 热99久久久久精品小说推荐| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 波多野结衣一区麻豆| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲精品在线观看二区| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲欧美一区二区三区久久| 美女午夜性视频免费| 中亚洲国语对白在线视频| 两个人看的免费小视频| 嫩草影视91久久| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲一区高清亚洲精品| 一区二区三区激情视频| 女性生殖器流出的白浆| 多毛熟女@视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 中文字幕高清在线视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 成人手机av| 精品高清国产在线一区| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 日韩欧美国产一区二区入口| 国产亚洲精品久久久久5区| 欧美中文综合在线视频| 少妇粗大呻吟视频| 成在线人永久免费视频| 欧美精品av麻豆av| 国产深夜福利视频在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 免费观看精品视频网站| 丁香欧美五月| 成人黄色视频免费在线看| 91在线观看av| 午夜福利,免费看| 99久久国产精品久久久| 国产免费男女视频| 午夜福利,免费看| 操美女的视频在线观看| 亚洲欧美激情在线| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲在线自拍视频| 欧美在线黄色| 很黄的视频免费| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产成+人综合+亚洲专区| 一二三四在线观看免费中文在| 免费少妇av软件| 99在线人妻在线中文字幕 | 亚洲午夜理论影院| 亚洲熟女毛片儿| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | www日本在线高清视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产成人精品无人区| 欧美 日韩 精品 国产| 1024香蕉在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| av片东京热男人的天堂| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 天天影视国产精品| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 曰老女人黄片| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美午夜高清在线| 久久中文字幕一级| 人人妻人人澡人人看| 久久久久精品国产欧美久久久| 成人永久免费在线观看视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 欧美精品一区二区免费开放| 9色porny在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 欧美乱妇无乱码| 亚洲国产中文字幕在线视频| 一本综合久久免费| 乱人伦中国视频| 国产欧美亚洲国产| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 中文字幕色久视频| 色综合婷婷激情| 亚洲 国产 在线| 91精品三级在线观看| 黄片播放在线免费| а√天堂www在线а√下载 | 美女视频免费永久观看网站| avwww免费| 亚洲九九香蕉| 亚洲免费av在线视频| 亚洲午夜理论影院| 国产成人系列免费观看| 亚洲九九香蕉| 人妻久久中文字幕网| 国产精品久久久久成人av| www.自偷自拍.com| 国产三级黄色录像| 国产极品粉嫩免费观看在线| 久久久久久久久免费视频了| 国产精品久久久久久精品古装| 国产亚洲精品第一综合不卡| 老汉色av国产亚洲站长工具| 天天操日日干夜夜撸| 777米奇影视久久| 亚洲 欧美一区二区三区| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 亚洲精品久久午夜乱码| 国产99白浆流出| 99热只有精品国产| 日韩大码丰满熟妇| 人人澡人人妻人| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 在线观看午夜福利视频| 曰老女人黄片| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产精品av久久久久免费| 久久草成人影院| 国产激情欧美一区二区| 国产亚洲av高清不卡| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲精品自拍成人| 精品第一国产精品| 亚洲一区中文字幕在线| 在线永久观看黄色视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 黑人猛操日本美女一级片| 高清欧美精品videossex| 免费看a级黄色片| 国产一区二区激情短视频| 欧美日韩视频精品一区| 看片在线看免费视频| 久久久精品区二区三区| 国产高清激情床上av| 日本一区二区免费在线视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 啦啦啦免费观看视频1| 中文字幕人妻熟女乱码| 欧美亚洲日本最大视频资源| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲国产精品合色在线| 日韩欧美免费精品| 一级毛片女人18水好多| 国产免费av片在线观看野外av| 国产区一区二久久| 飞空精品影院首页| 国产精品成人在线| 亚洲一区中文字幕在线| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 精品国内亚洲2022精品成人 | 欧美丝袜亚洲另类 | 又黄又爽又免费观看的视频| 午夜福利在线免费观看网站| 中文字幕高清在线视频| 国产欧美亚洲国产| 亚洲色图综合在线观看| 日韩欧美三级三区| 国产精品一区二区在线不卡| 一级a爱片免费观看的视频| 久9热在线精品视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 男女高潮啪啪啪动态图| 精品国产亚洲在线| 久久亚洲精品不卡| а√天堂www在线а√下载 | 村上凉子中文字幕在线| а√天堂www在线а√下载 | 欧美久久黑人一区二区| 国产成人欧美| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 日本wwww免费看| 一二三四在线观看免费中文在| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲国产欧美网| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 午夜福利欧美成人| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 欧美+亚洲+日韩+国产| 桃红色精品国产亚洲av| 国产视频一区二区在线看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 激情在线观看视频在线高清 | 国产精品亚洲一级av第二区| 交换朋友夫妻互换小说| 国产免费男女视频| 欧美日韩乱码在线| 搡老熟女国产l中国老女人| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 中文字幕最新亚洲高清| avwww免费| 成人三级做爰电影| 亚洲国产看品久久| 成熟少妇高潮喷水视频| av欧美777| 久久草成人影院| 午夜免费成人在线视频| 视频区图区小说| 久久婷婷成人综合色麻豆| 日韩大码丰满熟妇| 久久香蕉精品热| 亚洲av欧美aⅴ国产| av不卡在线播放| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 黄片播放在线免费| 亚洲精品一二三| 久久ye,这里只有精品| 另类亚洲欧美激情| 搡老乐熟女国产| 亚洲美女黄片视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久草成人影院| 我的亚洲天堂| 成人国产一区最新在线观看| 69精品国产乱码久久久| 成人av一区二区三区在线看| 在线观看日韩欧美| 日韩欧美国产一区二区入口| 极品人妻少妇av视频| 国产深夜福利视频在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| av片东京热男人的天堂| 色在线成人网| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 波多野结衣av一区二区av| 人人妻人人澡人人看| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | www.999成人在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲av美国av| xxx96com| 天堂动漫精品| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲性夜色夜夜综合| 9191精品国产免费久久| 亚洲性夜色夜夜综合| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 美女高潮到喷水免费观看| 国产1区2区3区精品| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产成人啪精品午夜网站| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲欧美一区二区三区久久| 午夜福利,免费看| 亚洲国产中文字幕在线视频| www.自偷自拍.com| 最近最新免费中文字幕在线| 啦啦啦在线免费观看视频4| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲五月天丁香| 亚洲色图综合在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 欧美日韩视频精品一区| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久九九热精品免费| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 黄频高清免费视频| 美女国产高潮福利片在线看| 最新的欧美精品一区二区| 精品国产国语对白av| 啦啦啦 在线观看视频| 91麻豆av在线| 12—13女人毛片做爰片一| 满18在线观看网站| 精品少妇久久久久久888优播| 精品一区二区三卡| 午夜久久久在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 国产高清国产精品国产三级| 婷婷丁香在线五月| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲五月天丁香| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲五月婷婷丁香| 免费在线观看影片大全网站| 99热国产这里只有精品6| 国产精品综合久久久久久久免费 | 亚洲国产精品sss在线观看 | 欧美日韩乱码在线| www.熟女人妻精品国产| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲熟女精品中文字幕| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 777米奇影视久久| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 欧美激情极品国产一区二区三区| 99热网站在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲人成电影观看| 欧美激情久久久久久爽电影 | 亚洲色图av天堂| 日韩欧美免费精品| 看免费av毛片| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲中文av在线| 久久久久久久久免费视频了| 久久狼人影院| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产在线一区二区三区精| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久香蕉精品热| 国产免费av片在线观看野外av| 中文字幕色久视频| 老汉色∧v一级毛片| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 高清在线国产一区| 男女午夜视频在线观看| 亚洲黑人精品在线| 91麻豆av在线| 亚洲精品在线观看二区| 久久九九热精品免费| 一边摸一边做爽爽视频免费| 高清黄色对白视频在线免费看| 91在线观看av| 亚洲精品粉嫩美女一区| 免费观看精品视频网站| 国产精品久久久人人做人人爽| 女人被狂操c到高潮| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲av熟女| 热99国产精品久久久久久7| 国产一区二区激情短视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品国产av在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 欧美精品高潮呻吟av久久| 在线观看日韩欧美| 激情视频va一区二区三区| 最近最新免费中文字幕在线| 曰老女人黄片| 亚洲七黄色美女视频| 国产亚洲精品一区二区www | 最近最新中文字幕大全电影3 | 99在线人妻在线中文字幕 | 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲精品国产一区二区精华液| 极品少妇高潮喷水抽搐| 日韩有码中文字幕| 不卡一级毛片| a在线观看视频网站| 一级a爱视频在线免费观看| 久久亚洲真实| a级毛片黄视频| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲精华国产精华精| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产麻豆69| 欧美黑人精品巨大| 日日夜夜操网爽| 狠狠狠狠99中文字幕| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 精品无人区乱码1区二区| 国产不卡一卡二| 免费观看精品视频网站| 欧美日韩乱码在线| 日韩中文字幕欧美一区二区| 夜夜夜夜夜久久久久| av天堂在线播放| 午夜老司机福利片| 中文字幕制服av| 久9热在线精品视频| 免费看a级黄色片| 精品国产一区二区久久| 日韩免费av在线播放| 美女 人体艺术 gogo| av中文乱码字幕在线| e午夜精品久久久久久久| av天堂在线播放| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 村上凉子中文字幕在线| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲性夜色夜夜综合| 搡老熟女国产l中国老女人| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 在线观看免费午夜福利视频| 妹子高潮喷水视频| 日本vs欧美在线观看视频| avwww免费| 国产1区2区3区精品| 亚洲一码二码三码区别大吗| 中文字幕制服av| x7x7x7水蜜桃| 国产在线一区二区三区精| 日本vs欧美在线观看视频| 日本五十路高清| 日本vs欧美在线观看视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产成人欧美在线观看 | 99香蕉大伊视频| 老汉色∧v一级毛片| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲国产看品久久| 国产激情欧美一区二区| 电影成人av| 久久久精品区二区三区| 日本一区二区免费在线视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| av中文乱码字幕在线| 操美女的视频在线观看| 丁香欧美五月| 国产精品欧美亚洲77777| 久久精品国产清高在天天线| 日韩欧美在线二视频 | 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 精品福利永久在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 伦理电影免费视频| 极品教师在线免费播放| 超碰97精品在线观看| 久久草成人影院| 欧美激情极品国产一区二区三区| 手机成人av网站| 国产精品偷伦视频观看了| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 国产亚洲精品第一综合不卡| 成年女人毛片免费观看观看9 | 中国美女看黄片| 久久久久久免费高清国产稀缺| 无人区码免费观看不卡| 国产野战对白在线观看| 99热国产这里只有精品6| 国产精品影院久久| 久久久久国产一级毛片高清牌| 一区福利在线观看| 亚洲avbb在线观看| 亚洲,欧美精品.| 久久国产亚洲av麻豆专区| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 很黄的视频免费| 国产xxxxx性猛交| 久久影院123| 岛国毛片在线播放| 9191精品国产免费久久| 国产成人精品无人区| 欧美成人午夜精品| 黄色片一级片一级黄色片| 热99久久久久精品小说推荐| 老司机深夜福利视频在线观看| 一区在线观看完整版| 国产免费av片在线观看野外av| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 成在线人永久免费视频| 美女国产高潮福利片在线看| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲全国av大片| 亚洲成国产人片在线观看| 一a级毛片在线观看| 搡老乐熟女国产| 女人久久www免费人成看片|