低溫貯藏期間‘長富2’果實細(xì)胞壁酶及基因表達(dá)的變化

易美君，孔靜，許昕，郁志芳

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京, 210095)

低溫貯藏期間‘長富2’果實細(xì)胞壁酶及基因表達(dá)的變化

易美君，孔靜，許昕，郁志芳*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京, 210095)

以‘長富2’蘋果為實驗材料，測定冷藏(1～4 ℃)期間果實多聚半乳糖醛酸酶(poly galacturonase,PG)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)活性及基因表達(dá)變化，同時分析果實硬度、可溶性固形物(soluble solid content,SSC)、可滴定酸和還原糖含量。結(jié)果表明，果實的硬度和可滴定酸持續(xù)下降且變化顯著；SSC和還原糖含量在貯藏前期有少量增加后緩慢下降；PG活性及MdPG1、MdPG2表達(dá)量均增加，PG活性和MdPG2表達(dá)量均在120 d達(dá)到峰值，MdPG1表達(dá)量在60 d達(dá)到最大值。β-Gal活性持續(xù)增加，與果實硬度呈顯著負(fù)相關(guān)；MdGAL1和MdGAL2表達(dá)量在60 d之前增加，60 d以后迅速下降?？傮w上，PG和β-Gal基因表達(dá)先于酶活增加，對兩種酶活性變化有重要作用。

蘋果；冷藏；品質(zhì)；細(xì)胞壁酶；基因表達(dá)

蘋果是許多國家的主要消費果品，營養(yǎng)價值高，貯藏期間面臨最大的問題是伴隨果實成熟衰老而發(fā)生的組織軟化，同時降低抗病性，縮短果實的貯藏期，影響商品價值[1]。細(xì)胞壁是果實細(xì)胞的骨架成分，其結(jié)構(gòu)和成分的直接變化是果實硬度下降、耐貯性降低[2]。大多數(shù)果實軟化是由于細(xì)胞壁酶降解細(xì)胞壁物質(zhì)，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組分改變，導(dǎo)致果實軟化[3]，多聚半乳糖醛酸酶(poly galacturonase,PG)[4]、木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶(Xyloglucan endotransglycosylase，XET)[5]、果膠甲酯酶(Pectin methyl esterase，PME)[6]和β-Gal[7]是導(dǎo)致果實成熟軟化的主要細(xì)胞壁降解酶。嘎啦蘋果在發(fā)育期PME活性很高，果實成熟后PME活性迅速下降[8]。COSTA等[9]分析證明MdPG2表達(dá)與蘋果果實硬度變化相關(guān)，LONGHI[10]驗證了此結(jié)論。魏建梅[11]以不同品種‘富士’、‘嘎啦’和‘金冠’為試材，系統(tǒng)研究了果實發(fā)育、成熟和后熟軟化過程中細(xì)胞壁酶活性變化及其關(guān)鍵酶基因的表達(dá)特性。‘富士’是我國栽培面積最大的蘋果品種，也是深受我國消費者歡迎的晚熟品種。本實驗中進(jìn)一步以‘長富2號’蘋果成熟果實為試材，測定低溫貯藏期間與果實軟化相關(guān)的細(xì)胞壁降解關(guān)鍵酶活性變化及其基因表達(dá)特性以及品質(zhì)變化，探索蘋果果實軟化與細(xì)胞壁代謝酶變化和基因表達(dá)的關(guān)系，為闡明蘋果果實軟化機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘長富2號’蘋果(Malus domestica Borkh., cv. Changfu 2)，2015年11月15日采收自江蘇省徐州市豐縣師寨果園，采摘后立即運至大沙河果園冷庫在0～2 ℃預(yù)冷，挑選個體大小一致、無機(jī)械損傷、病蟲害的果實，套網(wǎng)袋裝入瓦楞紙箱內(nèi)，于17日運回實驗室進(jìn)行試驗處理。

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；Alpha-1860A紫外-可見分光光度計，上海譜元有限公司；Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀，美國伯樂公司；DJ300精密電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；GL-20G-II高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；WFJ UV-282 PC紫外-可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；DYY-10C電泳儀，北京市六一儀器廠；ZF-20D暗箱式紫外分析儀，上海寶山顧村電光儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理

運回實驗室的果實分為4組，每組大約120個果實。置1～4 ℃冷藏條件下貯藏。貯藏期間分別于第0、60、120、180天隨機(jī)從各組取蘋果果實樣品進(jìn)行品質(zhì)指標(biāo)的測定，并從果實果肉取樣經(jīng)液氮冷凍后存放在-80 ℃用以測定細(xì)胞壁酶活性和基因表達(dá)的變化。每個樣品45個果實，取樣重復(fù)3次。

1.2.2 硬度和SSC測定

在果實腰部去皮，用FHM-5果實硬度計測定果實腰部對應(yīng)側(cè)的硬度，取測定平均值(kg/cm2)；用手持折光儀(WYT-4型)測定SSC值(%)。

1.2.3 果實可滴定酸的測定

采用指示劑滴定法[12]，略有改動。取2 g新鮮組織，充分研磨后加入30 mL ddH2O混勻，靜置30 min后4 000×g離心30 min，取20 mL上清液，滴1～2滴酚酞指示劑，用0.01 mol/L NaOH滴定，3次重復(fù)。用ddH2O做空白。

式中：c，NaOH濃度，mol/L；V1，滴定濾液消耗的NaOH溶液體積，mL；V0，滴定空白消耗的NaOH溶液體積，mL；V2，滴定時取的上清液體積，mL；V總，研磨時加入的提取總體積，mL；m，樣品質(zhì)量，g；f，折算系數(shù)，蘋果酸0.067 g/mmol。

1.2.4 還原糖含量的測定

采用3,5-二硝基水楊酸比色法[13]測定。

1.2.5 PG和β-Gal活性測定

參考WEI等[14]的實驗方法，略有改動。取3 g冷凍的果肉組織，在液氮中研磨均勻加入6 mL預(yù)冷的12%聚乙二醇和0.2% Na2SO4溶液。勻漿在12 000×g，4 ℃條件下離心10 min，然后用4 ℃ 0.2% Na2SO46 mL洗滌沉淀。向沉淀中加入6 mL提取緩沖液(0.1 mol/L醋酸鈉pH 5.2，100 mmol/L NaCl，2%β-巰基乙醇，5%聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinyl Pyrrolidone，PVP))于4 ℃提取1 h，離心10 min，保留上清液。

1.2.5.1 PG活性測定

參考葉玉平[15]的實驗方法，稍作改動。取500 μL粗酶液與500 μL 0.3%(w/v)多聚半乳糖醛酸溶液混合，37 ℃條件下反應(yīng)1 h，加入3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)1.5 mL，沸水浴5 min后定容到25 mL，在540 nm下測吸光值，重復(fù)3次。用半乳糖醛酸溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線。以每分鐘單位冷凍果實重產(chǎn)生的半乳糖醛酸的量表示酶活性，即1 U=1 μg半乳糖醛酸/(g·FW·min)。

1.2.5.2 β-Gal活性測定

取500 μL 0.1 mol/L醋酸鈉溶液(pH5.2)，加入500 μL 3 mmol/L對硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷(p-nitrophenyl-β-D-galactospytanoside，pNPG)，在40 ℃預(yù)熱10 min。加入500 μL上清液到混合液中，37 ℃水浴30 min。加入2.0 mL 0.5 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。在400 nm下測吸光值，重復(fù)3次。用p-硝基酚(p-Nitrophenol，pNP)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以每分鐘單位冷凍果實重產(chǎn)生的pNP的量表示酶活性，即1 U=1 nmolpNP/(g·FW·min)。

1.2.6 果實總RNA提取及RT-PCR檢測

果實總RNA的提取使用的RNAprep Pure Plant Kit 是TIANGEN公司產(chǎn)品(目錄號：DP441)，并進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳和測定A260、A280、A230的吸光值，檢測RNA質(zhì)量和完整性。cDNA第一條鏈的合成采用TaKaRa(日本)公司產(chǎn)品PrimeScriptTMRT Master Mix。以蘋果TUB基因作為內(nèi)參，引物對為F5'-AGCAGGTGGAAGCCATCAAG-3'，R5'-CTCATCATCACGCAGCAACAG-3'。采用Primer Premier5.0設(shè)計MdPG1、MdPG2、MdPG3、MdGAL1、MdGAL2的特異性引物(表1)[16]。使用熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96，美國)開展RT-PCR檢測，反應(yīng)體系為20.0 μL，含有10.0 μL SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)，1.0 μL cDNA，7.4 μL ddH2O，上下游引物各0.8 μL(引物濃度10 μmol/L)。運行程序為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性3 s，60 ℃延伸1 min，40次循環(huán)。每個樣品3次重復(fù)，每個基因均把果實采收當(dāng)天(0 d)的表達(dá)水平設(shè)為1.0[17]。

表1 ‘長富2號’果實細(xì)胞壁酶基因的RT-PCR引物序列

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)取3個樣品測定結(jié)果的平均值，并采用mean±X表示。采用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Excel軟件進(jìn)行示圖制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 硬度和可滴定酸含量的變化

硬度和可滴定酸是衡量果實成熟度和品質(zhì)的重要指標(biāo)。從圖1可知，低溫貯藏期間‘長富2號’蘋果果實的硬度呈下降趨勢，前120 d硬度下降較為緩慢，120 d后下降加快，至180 d約下降了32.3%，與貯藏開始果實比較變化顯著(P<0.05)，但仍保持在4.0 kg/cm2以上，可滿足多數(shù)消費者對質(zhì)地的要求[18]。果實硬度在貯藏期間下降顯著可能與果實主要用于鮮銷而采收時間偏晚(11月15日)造成成熟度較高有關(guān)。與硬度變化一致，果實中可滴定酸含量貯藏期間呈持續(xù)下降的趨勢，120 d后下降加快，至180 d可滴定酸含量不足0.1%，相對于120d前的可滴定酸含量差異明顯(P<0.05)。

圖1 低溫貯藏期間果實硬度和可滴定酸含量變化Fig.1 Changes of firmness and titratable acidity in apple fruit during refrigerated storage

2.2 SSC和還原糖含量變化

圖2 低溫貯藏期間果實可溶性固形物和還原糖含量變化Fig.2 Changes of SSC and reducing sugar content in apple fruit during refrigerated storage

蘋果果實中的SSC和還原糖含量對果實的風(fēng)味、品質(zhì)及貯藏性有很大的影響。由圖2可見，貯藏期間‘長富2號’果實的SSC變化不顯著，60 d達(dá)到峰值后稍有減少；SSC貯藏前60 d僅有少量增加的結(jié)果佐證果實采收時成熟度較高[19]。另外，經(jīng)180 d貯藏SSC含量保持較高水平提示果實仍具有良好的風(fēng)味[20]。貯藏期間果實還原糖含量變化顯著，從貯藏時的79%增加到60 d時的83%，以后120 d貯藏時間內(nèi)快速下降，變化顯著(P<0.05)，至結(jié)束時僅為66.33 mg/g，結(jié)果同時提示，還原糖是SSC的主要物質(zhì)。蘋果果實中SSC和還原糖含量的減少與貯藏期間果實的呼吸消耗有關(guān)[21]。

2.3 PG活性和MdPG1、MdPG2基因表達(dá)水平的變化

PG將果實細(xì)胞壁多糖中多聚半乳糖醛酸通過外切或內(nèi)切的方式降解為半乳糖醛酸或者短鏈，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)解體[22]，在果實成熟軟化中起重要作用。貯藏期間‘長富2號’果實PG活性顯著升高(P<0.05)，至第120 d出現(xiàn)最大值之后下降(圖3-A)。貯藏期間果實PG基因的表達(dá)量與PG活性的變化趨勢一致，亦在貯藏期間逐漸增加，MdPG1表達(dá)早于MdPG2且較早達(dá)到最大值，120 d時MdPG1和MdPG2的表達(dá)水平分別是0d的1.87倍和389倍(圖3-B)。以上結(jié)果顯示，貯藏期間‘長富2號’果實PG活性與PG基因表達(dá)存在相關(guān)性，推測新增加的PG活性很可能來自于PG基因的表達(dá)，MdPG1和MdPG2在果實后熟軟化進(jìn)程中起著重要作用，MdPG2主要在貯藏后期表達(dá)量增加，對PG活性的貢獻(xiàn)大。另外，果實硬度在PG酶活性和基因表達(dá)均達(dá)到最大值后快速下降(圖1和圖3)，表明兩者間存在因果關(guān)系，與GWANPUA[23]的研究結(jié)果相同。

(A) 多聚半乳糖醛酸酶活性變化；(B) 多聚半乳糖醛酸酶基因表達(dá)變化圖3 低溫貯藏期間果實多聚半乳糖醛酸酶活性及其基因表達(dá)變化 Fig.3 Changes of PG activity and gene expression in apple fruit during refrigerated storage

2.4 β-Gal酶活性和MdGAL1、MdGAL2基因表達(dá)水平的變化

β-Gal作用于含有1, 4-β-糖苷鍵的基質(zhì)半乳多聚糖。由圖4-A可知，貯藏期間‘長富2號’果實β-Gal活性與PG變化有所不同，呈持續(xù)的顯著上升趨勢(P<0.05)，180 d的β-Gal活性是0 d的2.3倍，與果實硬度的降低呈顯著的負(fù)相關(guān)。圖4-B顯示，果實的β-Gal基因表達(dá)在貯藏前期顯著提高，第60天MdGAL1和MdGAL2的表達(dá)量分別是0 d的2.67和6.51倍；之后MdGAL1和MdGAL2的表達(dá)下降。比較圖4-A和圖4-B可見，MdGAL1和MdGAL2表達(dá)先于β-Gal活性達(dá)到高峰，表明酶活性的增加可能來源于基因的表達(dá)，這符合分子生物學(xué)的原理。SHI等[24]研究得出金冠蘋果成熟期間β-Gal受基因MDP0000416548和MDP0000030527調(diào)控，而MDP0000416548和MDP0000030527在‘長富2號’果實表達(dá)量較低，與品種差異性有關(guān)。

(A) β-半乳糖苷酶活性變化；(B) β-半乳糖苷酶基因表達(dá)變化圖4 低溫貯藏期間果實β-半乳糖苷酶活性及其基因表達(dá)變化Fig.4 Changes of β-Gal activity in apple fruit during refrigerated storage

‘長富2號’果實PG和β-Gal活性與果實硬度均呈負(fù)相關(guān)，說明PG和β-Gal均參與細(xì)胞壁的軟化進(jìn)程，尤其β-Gal跟果實的貯藏特性密切相關(guān)，貯藏后期PG活性下降，β-Gal活性迅速上升，表明二者作用于果膠物質(zhì)存在時間和作用大小的差異。MdPG1、MdPG2、MdGAL1和MdGAL2的表達(dá)和相關(guān)酶活性的關(guān)系，還需利用分子生物學(xué)手段對二者之間作進(jìn)一步研究，以探討果實軟化的多基因協(xié)調(diào)調(diào)控機(jī)制，為農(nóng)產(chǎn)品保鮮提供理論支持。

3 結(jié)論

低溫貯藏期間，‘長富2號’果實硬度和可滴定酸顯著下降，SSC和還原糖含量在有少量增加后緩慢下降；PG活性和MdPG2表達(dá)量均在120 d達(dá)到峰值，MdPG1表達(dá)量在60 d達(dá)到最大值；β-Gal活性持續(xù)增加直至貯藏結(jié)束且與果實硬度呈顯著負(fù)相關(guān)，MdGAL1和MdGAL2表達(dá)量前60 d顯著增加而后迅速下降；PG和β-Gal基因表達(dá)均先于酶活增加且對兩種酶活性變化有重要作用。

[1] 過國南,閻振立,張恒濤,等.我國早、中熟蘋果品種的生產(chǎn)現(xiàn)狀、選育進(jìn)展及發(fā)展展望[J].果樹學(xué)報,2009,26(6):871-877.

[2] 張鵬龍,陳復(fù)生,楊紅順,等.果實成熟軟化過程中細(xì)胞壁降解研究進(jìn)展[J].食品科技, 2010,35(11):62-66.

[3] BILLY L,MEHINAGIC E,ROYER G,et al.Relationship between texture and pectin composition of two apple cultivars during storage[J].Postharvest Biology & Technology,2008,47(3):315-324.

[4] 李宏建,劉志,王宏,等.PG和LOX酶活性變化與岳帥蘋果果實軟化的關(guān)系研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,2014,27(1):268-271.

[5] SCHRODER R,ATKINSON R G,LANGENKAMPER G,et al.Biochemical and molecular characterisation of xyloglucan endotransglycosylase from ripe kiwifruit[J].Planta,1998,204(2):242-251.

[6] BRUMMELL D A,DAL C V,CRISOSTO C H,et al.Cell wall metabolism during maturation,ripening and senescence of peach fruit[J].Journal of Experimental Botany,2004,55(405):2 029-2 039.

[7] 魏建梅,馬鋒旺.蘋果果實β-Gal和LOX活性變化特性及其與果實軟化的關(guān)系[J].園藝學(xué)報,2009,36(5):631-638.

[8] NG J K,SCHR?DER R,SUTHERLAND P W,et al.Cell wall structures leading to cultivar differences in softening rates develop early during apple (Malus x domestica) fruit growth[J].Bmc Plant Biology,2013,13(1):1-17.

[9] COSTA F,PEACE C P,STELLA S,et al.QTL dynamics for fruit firmness and softening around an ethylene-dependent polygalacturonase gene in apple (Malus x domestica Borkh.)[J].Journal of Experimental Botany,2010,61(11):3 029-3 039.

[10] LONGHI S,HAMBLIN M T,TRAINOTTI L,et al.A candidate gene based approach validates Md-PG1,the main responsible for a QTL impacting fruit texture in apple (Malus x domestica Borkh)[J].Bmc Plant Biology,2013,13(1):37-40.

[11] 魏建梅.蘋果(Malus domestica Borkh.)果實質(zhì)地品質(zhì)發(fā)育及采后調(diào)控的生理和分子基礎(chǔ)[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué),2009:5.

[12] 王啟軍.食品分析實驗[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2011:24-27.

[13] 王鴻飛,邵興鋒.果品蔬菜貯藏與加工實驗指導(dǎo)[M].北京:科學(xué)出版社,2012:25-26.

[14] WEI Jian-mei,MA Feng-wang,SHI Shou-guo,et al.Changes and postharvest regulation of activity and gene expression of enzymes related to cell wall degradation in ripening apple fruit[J].Postharvest Biology and Technology,2010,56(2):147-154.

[15] 葉玉平.細(xì)胞壁多糖降解引起采后菠蘿果實成熟軟化機(jī)理的初步研究[D].湛江：廣東海洋大學(xué),2014: 33.

[16] GWANPUA S G,MELLIDOU I,BOECKX J,et al.Expression analysis of candidate cell wall-related genes associated with changes in pectin biochemistry during postharvest apple softening[J].Postharvest Biology and Technology,2016,112:176-185.

[17] HUAN Chen,JIANG Li,AN Xiu-juan,et al.Potential role of glutathione peroxidase gene family in peach fruit ripening under combined postharvest treatment with heat and 1-MCP[J].Postharvest Biology and Technology,2016,111:175-184.

[18] 聶繼云,李志霞,李海飛,等.蘋果理化品質(zhì)評價指標(biāo)研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,14:2 895-2 903.

[19] 郭燕.幾種蘋果品種果實糖酸積累及糖代謝相關(guān)酶活性變化研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué),2012:32.

[20] 鄭麗靜.蘋果果實糖酸特性及其與風(fēng)味關(guān)系研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2015:25-30.

[21] 趙猛,王亮,李超,等.冰溫氣調(diào)對紅富士蘋果貯藏效果的影響[J].保鮮與加工,2010,10(3):46-49.

[22] 梁潔玉,朱丹實,趙麗紅,等.低溫貯藏李子細(xì)胞壁酶活性變化對果膠降解的影響[J].現(xiàn)代食品科技,2015,31(5):212-218.

[23] GWANPUA S G,BUGGENHOUT S V,VERLINDEN B E,et al.Pectin modifications and the role of pectin-degrading enzymes during postharvest softening of Jonagold apples[J].Food Chemistry,2014,158(9):283-291.

[24] SHI Yun,JIANG Li,ZHANG Li,et al.Dynamic changes in proteins during apple (Malus x domestica) fruit ripening and storage[J].Horticulture Research,2014,1(6)：1-21.

Changes of cell wall-enzymes activity and gene expression in ‘Changfu 2’apple fruit during refrigerated storage

YI Mei-jun, KONG Jing, XU Xin, YU Zhi-fang*

(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095, China)

The ‘Changfu 2’ cultivar was used to investigate the change of activity and gene expression of polygalacturonase (PG) and β-galactosidase (β-Gal), firmness, soluble solid content (SSC), titratable acidity and reducing sugar content during refrigerated storage (1-4 ℃). Results showed that firmness and titratable acidity decreased constantly and changed markedly, SSC and reducing sugar content increased slightly in the early storage and then decreased slowly. PG activity and expression of MdPG2 increased up to the peak in 120 d and expression of MdPG1 reached the top in 60 d. The activity of β-Gal increased distinctly, having a negative correlation with changes of firmness. And expression of MdGAL1 and MdGAL2 increased before 60 d and decreased rapidly after 60 d. On the whole, gene expression of PG and β-Gal had significantly effects on enzyme activities because expression of PG and β-Gal genes was prior to increase of activities.

apple; refrigerated storage; quality; cell wall-related enzyme; gene expression

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703044

碩士研究生(郁志芳教授為通訊作者，E-mail: yuzhifang@njau.edu.cn)。

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目(CX(15)1022)

2016-09-08，改回日期：2016-11-30