四川泡菜中產(chǎn)γ-氨基丁酸植物乳桿菌BC114發(fā)酵條件優(yōu)化

曾林，譚霄，張慶*，楊穎，唐潔

1(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都，610039) 2(西華大學(xué) 古法發(fā)酵(釀造)生物技術(shù)研究所，四川 成都，610039)3(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南，250101)

四川泡菜中產(chǎn)γ-氨基丁酸植物乳桿菌BC114發(fā)酵條件優(yōu)化

曾林1,2，譚霄1，張慶1,2*，楊穎3，唐潔1

1(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都，610039) 2(西華大學(xué) 古法發(fā)酵(釀造)生物技術(shù)研究所，四川 成都，610039)3(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南，250101)

為拓展產(chǎn)γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)微生物資源，以四川泡菜為分離源，從中分離具有產(chǎn)GABA能力的乳酸菌，并對其進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。通過高效液相色譜法對篩選到的GABA菌株進(jìn)行表達(dá)能力評估發(fā)現(xiàn)，菌株BC114在含10 g/L L-谷氨酸鈉的MRS培養(yǎng)基于37 ℃發(fā)酵48 h后，發(fā)酵液中GABA質(zhì)量濃度為1.72 g/L。以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最適培養(yǎng)基組成為葡萄糖15 g/L、牛肉膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、K2HPO41.50 g/L、L-谷氨酸鈉17 g/L、乙酸鈉5 g/L、MnSO40.05 g/L、MgSO40.10 g/L、吐溫-80 1 mL/L；培養(yǎng)條件為pH 5.50、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間80 h、接種量4%。在此優(yōu)化條件下，植物乳桿菌BC114產(chǎn)GABA能力達(dá)到3.82 g/L，較優(yōu)化前提高了2.22倍。

植物乳桿菌BC114；γ-氨基丁酸；響應(yīng)面分析法

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，簡稱GABA)是通過谷氨酸脫羧酶(GAD)生物合成的非蛋白質(zhì)氨基酸[1]。在哺乳動(dòng)物中，GABA以一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中[2]，具有降低血壓、利尿、增強(qiáng)記憶等多種生理功能[3-5]。GABA既是一種具有顯著藥理作用的藥物[6]，又被視為具有保健功能的新型功能性因子，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有十分樂觀的應(yīng)用前景[7]。因此，GABA的合成引起了人們的廣泛關(guān)注和重視。

GABA在動(dòng)植物體內(nèi)分布廣泛，但其天然含量低，從天然組織中分離提取難度大[8]，目前獲得GABA的方法主要有化學(xué)合成、植物富集法和微生物發(fā)酵法三大類[9]。相比而言，化學(xué)合成GABA法反應(yīng)條件復(fù)雜、污染大；植物富集法產(chǎn)GABA難度大、含量低；而微生物發(fā)酵法產(chǎn)GABA條件溫和、安全性好，成為了目前GABA生產(chǎn)的理想方法[10]。近年來，含有谷氨酸脫羧酶的霉菌[11]、酵母[12]和乳酸菌[13]等作為發(fā)酵劑用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)GABA，Anussara Ratanaburee[14]等利用LactobacillusnamurensisNH2和PediococcuspentosaceusHN8作發(fā)酵劑生產(chǎn)富含GABA發(fā)酵豬肉香腸；Ja Young Kim[15]等利用LactobacillusbrevisGABA100發(fā)酵生產(chǎn)GABA黑莓果汁。然而，優(yōu)良菌株的缺乏制約了GABA發(fā)酵法的進(jìn)一步發(fā)展，Naser Tajabadi[16]等從蜂蜜中分離產(chǎn)GABA的LactobacillusplantarumTaj-Apis362, 響應(yīng)面優(yōu)化后GABA質(zhì)量濃度僅0.721 g/L; 黃桂東[17]等從黃酒發(fā)酵液中分離出的LactobacillusplantarumMJ0301進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化后GABA質(zhì)量濃度僅1.59 g/L。因此，如何獲取優(yōu)良菌株成為了開發(fā)GABA微生物發(fā)酵法的重要任務(wù)。

本研究以四川泡菜為原料，分離、篩選出高產(chǎn)GABA的乳酸菌菌株，以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)對影響GABA產(chǎn)量的各因子及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化，確定篩選菌株的最佳發(fā)酵條件，旨在為高產(chǎn)GABA菌株的開發(fā)、應(yīng)用以及產(chǎn)GABA發(fā)酵條件優(yōu)化等相關(guān)研究及后續(xù)研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

四川泡菜中分離出的12 株具有產(chǎn)GABA能力的乳酸菌菌株，NCBI登錄號為KU761831～KU761842，西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院保藏。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

MRS液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，牛肉膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，K2HPO42 g/L，乙酸鈉5 g/L，MnSO40.05 g/L，MgSO40.10 g/L，吐溫-80 1 mL/L，調(diào)節(jié)pH6.20，121 ℃條件下滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加10 g/L L-谷氨酸鈉。

取經(jīng)活化培養(yǎng)16 h的種子液(約108CFU/mL)，以4%的接種量接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，30 ℃靜止培養(yǎng)48 h。

1.3 GABA表達(dá)能力評估

采用HPLC定量分析對各菌株產(chǎn)GABA能力進(jìn)行評估。參照張術(shù)聰[18]等柱前衍生的方法對發(fā)酵液中GABA進(jìn)行柱前衍生。HPLC分析條件：色譜柱為島津-GL INERTSIL ODS-3(4.6 mm×150 mm，5 um)；紫外檢測波長254 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為醋酸鈉(pH 6.20)∶甲醇∶四氫呋喃(420∶75∶5，V/V/V)；流速1 mL/min；梯度洗脫時(shí)，流動(dòng)相B比例為：0～6 min，80%～50%；6～9 min，50%～20%；9～10 min，20%～0%；10～11 min，維持0%；11～15 min，返回80%。

1.4 篩選菌株生理生化特征和16S rRNA測序分析

根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》[19]和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及試驗(yàn)方法》[20]中試驗(yàn)方法進(jìn)行常規(guī)的生化測試，同時(shí)采用16S rRNA測序分析，所得序列提交至NCBI進(jìn)行Blast比對。

1.5 單因素試驗(yàn)

根據(jù)查閱文獻(xiàn)及前期實(shí)驗(yàn)篩選[21-22]，以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按4%的接種量，選取影響菌株GABA產(chǎn)量和生長情況(A600nm)的因素：L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度(0～20 g/L)，初始pH(5～7)，發(fā)酵溫度(30～38 ℃)和發(fā)酵時(shí)間(24～84 h)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.6 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)

采用響應(yīng)面分析方法對篩選菌株產(chǎn)GABA發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)CCD的中心組合設(shè)計(jì)原理[17]，以L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度、初始pH、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因子為自變量，以GABA產(chǎn)量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，并用Design-Expert7.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GABA表達(dá)能力評估分析

利用HPLC定量分析對菌株產(chǎn)GABA能力進(jìn)行評估。其標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=9E+06X-18007(R2=0.999 2)。因此，可用于菌株發(fā)酵液中的GABA進(jìn)行定量分析，定量結(jié)果如圖1所示，12 株菌株發(fā)酵液中γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度為0.28～1.72 g/L，其中菌株BC114發(fā)酵產(chǎn)γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度較高，達(dá)1.72 g/L。周青[23]等從泡菜中篩選到一株植物乳桿菌，發(fā)酵液中GABA質(zhì)量濃度達(dá)1.26 g/L，并通過正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件及其培養(yǎng)基成分，發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量提高了79%。因此，菌株BC114發(fā)酵生產(chǎn)GABA更具有優(yōu)勢，下一步可對其進(jìn)行發(fā)酵條件及其培養(yǎng)基成分的優(yōu)化。

圖1 四川泡菜中篩選的12株乳酸菌產(chǎn)GABA能力的大小(不同字母表示數(shù)據(jù)差異顯著，P<0.05)Fig.1 Comparison of GABA production by 12 LAB strains isolated from Sichuan Pickle

2.2 菌株BC114生理生化特征及16S rRNA測序分析

通過常規(guī)的生理生化特征分析，菌株BC114為革蘭氏陽性菌，在15～45 ℃培養(yǎng)條件下，能在厭氧和有氧條件下生長良好，結(jié)果見表1，同化碳源試驗(yàn)表明，纖維二糖、果糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蜜二糖、棉籽糖、核糖、山梨糖、蔗糖和海藻糖為陽性；阿拉伯糖、松三糖、鼠李糖和D-木糖為陰性。16S rRNA基因測序分析菌株BC114(KU761835)與LactobacillusplantarumJCM 1149 (NR_115605.1)相似度為100%，因此，結(jié)合生理生化特征，菌株BC114被鑒定為L.plantarum。

2.3L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度、初始pH、發(fā)酵溫度和時(shí)間對L.plantarumBC114生長及GABA產(chǎn)量的影響

L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度增大可使GABA支路中碳流量增加，并調(diào)節(jié)GAD活性。L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度對菌株BC114生長及GABA產(chǎn)量的影響如圖2-a所示，L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度對菌株BC114產(chǎn)GABA有較大的影響，而菌體濃度基本保持不變。隨著L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度的增大，GABA的產(chǎn)量也隨之增加，當(dāng)L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度超過15 g/L后，GABA產(chǎn)量緩慢減少。因此選擇15 g/L為L-谷氨酸鈉的最優(yōu)質(zhì)量濃度。

表1 菌株BC114主要的生理生化測試

培養(yǎng)基pH值可通過影響生物體內(nèi)的酶反應(yīng)、細(xì)胞膜對營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸?shù)确绞絹碛绊懢w的生長及代謝產(chǎn)物的積累。試驗(yàn)將培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)節(jié)為pH5.00～7.00，探討培養(yǎng)基的初始pH對L.plantarumBC114的生長及GABA產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，菌體濃度在初始pH6.00時(shí)最高，隨著pH升高菌體濃度緩慢降低，GABA質(zhì)量濃度在初始pH 5.50時(shí)最高，隨pH升高GABA產(chǎn)量迅速降低(如圖2-b)。劉佳榮[24]等篩選獲得的L.plantarumLp-Dfa301在pH 5.00時(shí)產(chǎn)GABA能力最強(qiáng)，Naser Tajabadi[25]等篩選獲得的L.plantarumTaj-Apis362在pH 5.50時(shí)產(chǎn)GABA能力最強(qiáng)。綜上所述，試驗(yàn)選擇pH 5.50是合理的，可供后續(xù)研究。

發(fā)酵溫度對L.plantarumBC114的生長及GABA產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖2-c所示，隨著發(fā)酵溫度的提高，GABA的產(chǎn)量逐漸增加，36 ℃時(shí)達(dá)到最高值，隨著溫度的繼續(xù)升高，GABA產(chǎn)量降低。由于高溫或低溫條件下都會影響菌體GABA代謝關(guān)鍵酶的活性、穩(wěn)定性、與底物的結(jié)合程度等，進(jìn)而影響菌體的生長與代謝；Naser Tajabadi[16]等研究表明L.plantarumTaj-Apis362合成GABA關(guān)鍵酶(GAD)在36 ℃時(shí)活性最高，故選取發(fā)酵溫度36 ℃。

圖2 L-谷氨酸鈉，初始pH，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對菌株BC114生長及GABA產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of sodium L-glutamate concentration, initial pH, temperature and fermentation time on the growth of L .plantarum BC114 and the yield of GABA

發(fā)酵時(shí)間對L.plantarumBC114生長及GABA產(chǎn)量的影響如圖2-d所示，在發(fā)酵24 h后，隨著時(shí)間延長，菌體濃度緩慢減少，發(fā)酵60 h后菌體濃度基本保持不變，同時(shí)隨著發(fā)酵時(shí)間增加，發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量也隨之增加，在發(fā)酵72 h達(dá)到最大，因此選擇72 h為最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

基于文獻(xiàn)和單因素試驗(yàn)結(jié)果[26-27]，選取L-谷氨酸鈉、初始pH、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間度作為響應(yīng)面分析的有效變量。以L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度15 g/L、培養(yǎng)溫度36 ℃，初始pH 5.50和發(fā)酵時(shí)間72 h為響應(yīng)面分析中心點(diǎn)(如表2)，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與響應(yīng)值

對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸，以GABA產(chǎn)量為因變量，L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度、初始pH、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間為自變量建立回歸方程：

Y=3.77+0.031A+0.14B-0.012C+0.24D-0.089AB-0.011AC+0.068AD-0.015BC+0.031BD-0.026CD-0.21A2-0.24B2-0.36C2-0.21D2

依據(jù)回歸方程，利用Design-Expert 7.0軟件繪制響應(yīng)曲面圖(圖3)。對模型方程求導(dǎo)得到最大預(yù)測值GABA產(chǎn)量為3.87 g/L，此時(shí)對應(yīng)變量的最佳值：發(fā)酵溫度為37.11 ℃、L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度為16.59 g/L、初始pH5.48和發(fā)酵時(shí)間為79.47 h。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)的回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)及方差分析

注：*. 差異顯著(P<0.05)；**.差異極顯著(P<0.01)。

圖3 各因素交互影響的響應(yīng)面法立體分析圖Fig.3 Response surface plots showing the interaction effect of factors on the yield of GABA

2.5 響應(yīng)面模型的驗(yàn)證和優(yōu)化

為了驗(yàn)證預(yù)測值的真實(shí)性，按照響應(yīng)面分析法得到的優(yōu)化組合，并根據(jù)實(shí)際應(yīng)用情況，以葡萄糖15 g/L、牛肉膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、K2HPO41.50 g/L、L-谷氨酸鈉17 g/L、乙酸鈉5 g/L、MnSO40.05 g/L、MgSO40.10 g/L、吐溫-80 1 mL/L、pH 5.50、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間80 h、接種量4%進(jìn)行發(fā)酵，GABA的產(chǎn)量為3.82 g/L，該實(shí)驗(yàn)值與模型的預(yù)測值3.87 g/L接近，從而驗(yàn)證了預(yù)測值的準(zhǔn)確性，說明優(yōu)化模型可靠。同時(shí)，與優(yōu)化前(初始培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：1.72 g/L)相比，GABA的產(chǎn)量提高了2.22倍，表明優(yōu)化方案設(shè)計(jì)合理有效，所獲的優(yōu)化培養(yǎng)基及發(fā)酵條件能夠明顯提高L.plantarumBC114產(chǎn)GABA的產(chǎn)量。

3 結(jié)論

本研究對四川泡菜中分離得到12 株具有產(chǎn)GABA能力的乳酸菌菌株進(jìn)行能力評估，篩選出菌株L.plantarumBC114產(chǎn)GABA的產(chǎn)量最高，在含10 g/LL-谷氨酸鈉的MRS培養(yǎng)基發(fā)酵48 h后，發(fā)酵液中GABA質(zhì)量濃度為1.72 g/L。以MRS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，GABA產(chǎn)量為響應(yīng)值，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面法對L.plantarumBC114產(chǎn)GABA發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最適培養(yǎng)基成分為葡萄糖15 g/L、牛肉膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、K2HPO41.50 g/L、L-谷氨酸鈉17 g/L、乙酸鈉5 g/L、MnSO40.05 g/L、MgSO40.10 g/L、吐溫-80 1 mL/L；培養(yǎng)條件為pH 5.50、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間80 h、接種量4%。在此優(yōu)化條件下，植物乳桿菌BC114產(chǎn)GABA能力達(dá)到3.82 g/L，較優(yōu)化前提高了2.22倍。

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Optimization of γ-aminobutyric acid production byLactobacillusplantarumBC114 from Sichuan pickle

ZENG Lin1,2, TAN Xiao1, ZHANG Qing1,2*, YANG Ying, TANG Jie1

1(Provincial Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan, College of Food and Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China) 2(Biotechnology Institute of Ancient Brewing, Xihua University, Chengdu 610039, China) 3(Food and Drug Institute of Shandong, Shandong, Jinan 250101, China)

The aim of the present study was to optimize the fermentation conditions of γ-aminobutyric acid (GABA)-producing by lactic acid bacteria from Sichuan Pickle. The performance of GABA- producing strains was evaluated by high performance liquid chromatography (HPLC) method. The results showed that strain BC114 had the higher GABA-producing ability (1.72 g/L) in MRS broth with 10 g/L initial glutamic acid after fermented at 37 ℃ for 48 h. On the basis of MRS culture medium, fermentation conditions ofLactobacillusplantarumBC114 for GABA were optimized by response surface central composite design (CCD). The results showed that the optimal fermentation medium was comprised of glucose 15 g/L, beef extract 10 g/L, peptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, trisodium amine 2 g/L, dipotassium phosphate 1.50 g/L, L- glutamate 17 g/L, sodium acetate 5 g/L, manganese sulfate 0.05 g/L, magnesium sulfate 0.10 g/L, and Twain-80 1 mL/L. And the optimal fermentation condition was as follows: pH 5.50, fermentation temperature 37 ℃, fermentation time 80 h and inoculum amount 4%. Under the optimized conditions, the production of GABA by L. plantarum BC114 reached 3.82 g/L, which was 2.22-fold higher than that before the optimization.

LactobacillusplantarumBC114; γ-aminobutyric acid; response surface methodology

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703021

碩士研究生(張慶副教授為通訊作者,E-mail：biozhangq@163.com)。

四川省應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目(2016JY0253)；教育部春暉計(jì)劃項(xiàng)目(Z2014060)；四川省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(szjj2016-019)

2016-09-13，改回日期：2016-12-05