微離軸干涉顯微系統(tǒng)中光學(xué)參數(shù)的確定

程 偉, 江 超, 薛 亮, 魏春娟, 初鳳紅

(上海電力學(xué)院 電子與信息工程學(xué)院, 上海 200090)

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微離軸干涉顯微系統(tǒng)中光學(xué)參數(shù)的確定

程 偉, 江 超, 薛 亮, 魏春娟, 初鳳紅

(上海電力學(xué)院 電子與信息工程學(xué)院, 上海 200090)

著重分析了微離軸干涉理論,通過自(互)相關(guān)理論確定了微離軸干涉中物參角的大小,由此推得干涉條紋的最佳空間頻率.通過與傳統(tǒng)干涉法的實驗結(jié)果對比發(fā)現(xiàn),微離軸干涉成像重建精度高.此外,不同直徑的細胞應(yīng)合理選用不同倍率的物鏡,有助于提高后期相位重建的準(zhǔn)確度,為進一步提高干涉測量的速度和準(zhǔn)確度提供了新方法.

微離軸干涉; 共焦顯微; 層析; 空間頻率

干涉顯微層析是一種新的測量生物組織內(nèi)部三維結(jié)構(gòu)的方法,結(jié)合了干涉層析和顯微放大技術(shù),既能重構(gòu)細胞的三維整體結(jié)構(gòu),又可對細胞內(nèi)部的微小結(jié)構(gòu)進行放大觀察.通過提取干涉條紋的相位信息可反演出由樣品引入的光程差,進而重建樣品的三維折射率分布[1].該技術(shù)常采用He-Ne 激光器作為實驗室光源,其相干長度較OCT長,容易產(chǎn)生干涉條紋,并且功率小,對于較薄的透明細胞穿透能力強,能非侵入地觀察樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu),因此在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價值.

干涉條紋主要有離軸干涉和同軸干涉兩種采集方式.離軸干涉[2]是指參考光與物光成一定角度干涉,只記錄一次干涉圖就可以用快速傅里葉變換法解包出物體的相位信息,大大減少了機械振動帶來的影響,適用于測量動態(tài)生物樣品,但是離軸干涉要求頻譜中0級和±1級譜足夠分開來提取有用的+1級(或者-1級)信息,無效帶寬增多,并且后期相位重建的誤差大.同軸干涉[3]時參考光和物光的夾角為零,在這個條件下,對樣品的一次測量至少需要采集3幅圖像來提取相位信息,雖然相位的重建精度高,但與離軸干涉測量相比,需要借助額外的元件(如PZT)來進行時間移相,加入噪聲的同時也會帶來機械振動[4],并且不能對動態(tài)生物樣品進行測量.

SHAKED N T等人[5]提出了介于兩者之間的微離軸干涉法,吸取了離軸干涉和同軸干涉的優(yōu)點,該方法既優(yōu)化有用帶寬,又避免了機械式移相,保證了后期相位重建的精度.本文著重剖析微離軸干涉系統(tǒng),給出其光學(xué)參數(shù)的確定方法,并與傳統(tǒng)干涉法進行優(yōu)劣比較.

1 微離軸的界定

微離軸干涉是指物光和參考光存在微小夾角,將干涉圖作傅里葉變換后±1級頻譜互相間不重疊但是分別與零級譜有交疊,并且占用帶寬最小時的干涉[5].物參角θ的大小,即條紋的空間頻率是判斷微離軸干涉的唯一標(biāo)準(zhǔn).

干涉條紋的強度分布可以寫成:

(1)

式中:Ik——干涉條紋的強度;Er,Es——參考光場和樣品光場的分布;φOBJ——樣品引起的相位變化;q——條紋的空間頻率,由參考光和樣品光之間的夾角決定;

αk——加入λ/4波片后參考光路的相位變化,α1=0,α2=π/2.

設(shè):

(2)

式中:HT——希爾伯特變換.

則有:

(3)

從式(2)和式(3)可以看出,q值是微離軸干涉中最重要的一個參數(shù),必須很精確,否則會給樣品相位值的后期重建帶來較大誤差.本文中通過自(互)相關(guān)運算來計算q的值.

計算兩光路之間的互相關(guān)函數(shù):

(4)

式中:C(ξ)——兩光路之間的互相關(guān)函數(shù);δ(ω)——沖激函數(shù).

同時,參考光路的自相關(guān)函數(shù)A(ξ)為:

(5)

由此反推,可得此時的物參角θ為:

(6)

式中:λ——參考光波的波長.

即θ=3°.此時,干涉處于微離軸狀態(tài).

2 微離軸干涉與傳統(tǒng)干涉法的對比實驗及結(jié)果分析

2.1 實驗過程及結(jié)果

實驗中,調(diào)整物參角拍攝不同載頻的干涉圖,樣品為玻片,結(jié)果如圖1所示.

由圖1可以看出,隨著物參角的變大,條紋變密.

圖1 不同載頻的干涉圖

經(jīng)過相位解包后,結(jié)果如圖2所示.由圖2可以明顯看出,微離軸條紋與背景交接處跳變較少,過渡較為平滑.

圖2 不同載頻的相位包絡(luò)圖

進一步對包絡(luò)圖進行相位提取,結(jié)果如圖3所示.由圖3可以看到,微離軸的重建結(jié)果噪聲少,很好地反應(yīng)了樣品的原貌,而隨著載頻的增大,重建結(jié)果愈加失真.

2.2 分析與討論

實驗中采集的是樣品經(jīng)顯微物鏡放大后的干涉圖,針對不同放大倍率的顯微物鏡,表1給出了未經(jīng)放大的干涉條紋間距.

圖3 不同載頻的相位重建圖表1 不同放大倍率顯微物鏡對應(yīng)的條紋間距和分辨率

放大倍率條紋間距/μm分辨率/%4176.87.71070.73.11644.22.62528.31.64017.71.26011.80.91007.1

對于同一樣品而言,干涉圖里包含的條紋越少,靈敏度越高,條紋的形變越容易測量;條紋越多,條紋上細微的扭曲就會被略去,導(dǎo)致重建的相位準(zhǔn)確度不高,所以細胞直徑應(yīng)接近條紋間距,這樣加入細胞后條紋的形變最易于測量.如果細胞直徑相對條紋過小,條紋的變化不明顯,重建精度下降.此外,對于共焦顯微而言,物鏡的倍率越高,實驗的調(diào)節(jié)難度越大,像差越嚴(yán)重.因此,在細胞直徑和條紋間距相當(dāng)?shù)那闆r下,不必一味追求高倍率放大物鏡.

根據(jù)推導(dǎo),針對不同直徑的細胞,應(yīng)使用不同倍率的物鏡.當(dāng)細胞直徑大于50 μm時,對應(yīng)選用10倍的顯微物鏡;當(dāng)細胞直徑在30 ～50 μm時,用16倍的物鏡;細胞直徑在12 ～20 μm時,用40倍的物鏡;直徑小于12 μm時,用60倍的或100倍的高倍物鏡.SHAKED N T等人[5]在實驗驗證微離軸理論時,樣品是直徑為12 μm的聚合物,選擇了40倍的顯微物鏡,與我們的結(jié)論一致.

3 結(jié) 論

(1) 根據(jù)互(自)相關(guān)理論計算可以得到微離軸狀態(tài)下的物參角,且物參角越大,干涉條紋越密,由此推得干涉條紋的最佳空間頻率.

(2) 通過與傳統(tǒng)干涉法的實驗對比,發(fā)現(xiàn)微離軸干涉重建精度高;并且針對不同直徑的細胞,給出了合適的顯微物鏡的放大倍率,即當(dāng)細胞直徑大于50 μm時,對應(yīng)選用10倍的顯微物鏡;當(dāng)細胞直徑在30～50 μm范圍內(nèi),用16倍物鏡;細胞直徑在12～20 μm之間,用40倍物鏡;直徑小于12 μm時,用60倍或100倍的高倍物鏡.

[1] XUE Liang,LAI Jiancheng,LI Zhenhua.Determining the optimal imaging position in tomographic interference microscopy[J].Proceedings of SPIE-The International Society for Optical Engineering,2009,7513:75130Z-75130Z-8.

[2] HUANG D,SWANSON E A,LIN C P,etal.Optical coherence tomography[J].Science,1991(254):1 178-1 181.

[3] CUCHEN E,MARQUET P,DEPEURSINGE C.Spatial filtering for zero-order and twin-image elimination in digital off-axis holography[J].Applied Optics,2000,39(23):4 070-4 075.

[4] YAMAGUCHI I.Phase-shifting digital holography[J].Optics Letters,1997,22(16):145-171.

[5] SHAKED N T,ZHU Y,RINEHART M T,etal.Two-step-only phase-shifting interferometry with optimized detector bandwidth for microscopy of live cells[J].Optics Express,2009,17(18):15 585-15 591.

(編輯 白林雪)

Determination of Optical Parameters in Slightly-off-axis Interference Microscopy

CHENG Wei, JIANG Chao, XUE Liang, WEI Chunjuan, CHU Fenghong

(SchoolofElectronicsandInformationEngineering,ShanghaiUniversityofElectricPower,Shanghai200090,China)

Slightly-off-axis interferometry theory is introduced and the angle between the object and sample path is calculated via the auto-correlation(cross-correlation) theory.According to this special angle,the optimized fringe spacing is introduced.The slightly-off-axis interference system is compared with on-axis and off-axis interferometry,which is good for high resolution.It is concluded that the biological cells with different size should choose the proper micro objective.As a result,it is convenient for the experiment operating and the enhancement of the phase reconstruction accuracy.The above results shed more lights on novel interferometry.

slightly-off-axis interferometry; confocal microscopy; tomography; fringe spatial frequency

10.3969/j.issn.1006-4729.2017.01.007

2016-03-16

薛亮(1986-),女,博士,講師,江蘇南通人.主要研究方向為光與物質(zhì)的相互作用.E-mail:xueliangokay@gmail.com.

國家自然科學(xué)基金(61205081);上海市教育委員會科研創(chuàng)新項目(13YZ102);上海市大學(xué)生科技創(chuàng)新項目(201210256026).

Q632

A

1006-4729(2017)01-0030-03