番茄紅素對荷肝癌裸小鼠移植瘤生長的作用及機制研究

趙孟雷

番茄紅素對荷肝癌裸小鼠移植瘤生長的作用及機制研究

趙孟雷*

目的 研究番茄紅素(Lycopene，LP)對荷肝癌裸小鼠移植瘤生長的影響及其機制。方法 通過背部皮下注射接種肝癌HepG2細胞的方法建立荷肝癌裸小鼠模型，并分別腹腔注射5、10、20 mg/(kg·d)的LP和2 mg/(kg·d)的順鉑進行干預(yù)治療，療程為14 d。治療后，觀察各組裸小鼠的一般生存狀態(tài)及腫瘤生長狀況，稱取瘤體質(zhì)量并計算抑瘤率；通過蘇木精-尹紅(HE)染色觀察腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，末端標記法(TUNEL)檢測腫瘤組織細胞凋亡狀況，免疫組織化學(xué)法(IHC)觀察腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白(caspase-3、Bax、bcl-2)表達。結(jié)果 經(jīng)LP治療14 d，荷肝癌裸小鼠飲食狀況和精神狀態(tài)明顯改善，瘤體減小，活動度和硬度降低，腫瘤組織呈現(xiàn)細胞皺縮、片狀壞死等病理性改變，凋亡細胞數(shù)量明顯增多；瘤體質(zhì)量顯著減輕、抑瘤率顯著升高；腫瘤組織中caspase-3和Bax表達顯著上調(diào)，而bcl-2顯著下調(diào)，Bax/bcl-2比值顯著升高；LP上述作用均具有一定的劑量依賴性。結(jié)論 番茄紅素對荷肝癌裸小鼠移植瘤生長具有一定的抑制作用，其機制可能與番茄紅素調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因蛋白表達而促進腫瘤組織細胞凋亡有關(guān)。

番茄紅素；肝癌；移植瘤；裸小鼠

0 引言

番茄紅素(Lycopene，LP)是廣泛存在于蔬菜水果中的一種具有多種生物學(xué)活性的胡蘿卜素[1-4]，近年來，番茄紅素的抗腫瘤作用逐漸得到醫(yī)藥工作者的普遍關(guān)注，既往研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素對肺癌、胃癌、前列腺癌等均具有一定的抑制作用[5-7]，但番茄紅素對肝癌是否具有治療作用尚未見文獻報道。既往病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，促進腫瘤細胞凋亡是抑制腫瘤生長的重要機制之一[8]，而趙其輝等[9]研究發(fā)現(xiàn)，LP能夠通過促進細胞凋亡而表現(xiàn)出對人結(jié)腸癌生長的抑制作用。本實驗通過皮下注射接種人肝癌HepG2細胞，建立荷肝癌裸小鼠模型，并給予LP進行干預(yù)治療，通過相關(guān)指標檢測，探討LP對荷肝癌裸小鼠移植瘤生長的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞 Balb/C裸小鼠(雄性，鼠齡4～6周齡，體重18～22 g)購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，動物許可證號：SCXK(滬)2012-0005，實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周；人肝癌HepG2細胞株由河北醫(yī)科大學(xué)細胞生物研究室惠贈。

1.2 藥物與試劑 番茄紅素購自南京澤朗生物科技有限公司(純度≥96%)；注射用順鉑購自山東齊魯制藥有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購自Gibco公司；caspase-3、Bax、bcl-2單克隆抗體和SP免疫組織化學(xué)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；TUNEL試劑盒購自南京建成生物研究所。

1.3 模型的制備、分組與給藥 荷肝癌裸小鼠模型的制備[10]：人肝癌HepG2細胞株經(jīng)復(fù)蘇后，植入DMEM高糖培養(yǎng)基，進行培養(yǎng)，并取對數(shù)生長期細胞進行下一步實驗：調(diào)整濃度為2×107個/mL后注射接種(0.5 mL)于裸小鼠背部右后腿外側(cè)皮下，7 d后接種部位出現(xiàn)>0.3 cm2移植瘤即可認定為造模成功。取80只裸小鼠模型按隨機數(shù)字表法分為陰性對照組、LP [5、10、20 mg/(kg·d)]組和順鉑[2 mg/(kg·d)]組，各16只；療程14 d，陰性對照組給予等體積生理鹽水。

1.4 觀察各組裸小鼠生存狀態(tài)和腫瘤組織生長狀況 小鼠生存狀態(tài)包括：飲食狀況、精神狀態(tài)等；瘤體特征包括：瘤體大小、活動度、硬度等。

1.5 測定瘤體質(zhì)量和抑瘤率 頸椎脫臼處死動物后剝?nèi)∧[瘤組織并稱重，抑瘤率的計算公式：抑瘤率(%)=(陰性對照組瘤重-治療組瘤重)/陰性對照組瘤重×100%

1.6 腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變和細胞凋亡狀況 取稱重后腫瘤組織置于4%多聚甲醛溶液中進行固定后，依次行石蠟包埋、切片、脫蠟水化、常規(guī)HE染色和復(fù)染，然后通過顯微鏡觀察腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。腫瘤組織石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟水化處理后，按照TUNEL試劑盒說明書步驟進行處理，然后通過顯微鏡觀察細胞凋亡狀況；凋亡指數(shù)(Apoptosis Index，AI)的計算：計數(shù)每張染色切片中細胞總數(shù)和凋亡細胞數(shù)，然后計算AI。AI(%)=(凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%

1.7 腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白表達的檢測 取腫瘤組織石蠟切片，按照SP試劑盒說明書步驟，采用免疫組織化學(xué)法(Immunohistochemistry，IHC)檢測凋亡相關(guān)蛋白(caspase-3、Bax、bcl-2)表達；半定量分析：每張染色組織切片隨機選取5個視野，通過醫(yī)學(xué)圖像分析軟件，測定每個視野平均光密度(Optical density，OD)，以O(shè)D值代表caspase-3、Bax、bcl-2蛋白表達密度；并根據(jù)Bax、bcl-2表達OD值計算Bax/bcl-2比值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS 15.0進行數(shù)理統(tǒng)計分析，計量資料組間均數(shù)比較采用one-way ANOVA分析，兩兩比較采用LSD檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組裸小鼠生存狀態(tài)及腫瘤特征 陰性對照組裸小鼠呈現(xiàn)精神萎靡不振、飲食狀況差等狀態(tài)，腫瘤組織呈現(xiàn)質(zhì)硬、活動、與胸壁不黏連等特征。與陰性對照組比較，LP各劑量組和順鉑組荷肝癌裸小鼠飲食狀況、精神狀態(tài)等一般生存狀態(tài)均呈不同程度好轉(zhuǎn)，瘤體減小，活動度和硬度均有所降低，LP作用具有一定劑量依賴性。

2.2 各組裸小鼠移植瘤瘤體質(zhì)量和抑瘤率 與陰性對照組比較，LP或順鉑治療14 d，能夠顯著降低荷肝癌裸小鼠移植瘤瘤體質(zhì)量，并顯著提高抑瘤率(P<0.05，P<0.01)；LP 20 mg/(kg·d)組瘤重和抑瘤率與順鉑2 mg/(kg·d)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

2.3 各組裸小鼠腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變 觀察HE染色病理切片，結(jié)果如圖2所示：陰性對照組荷肝癌裸小鼠移植瘤組織形態(tài)和細胞結(jié)構(gòu)均未見異常；與陰性對照組比較，LP各劑量組和順鉑組移植瘤組織細胞呈現(xiàn)不同程度皺縮、細胞數(shù)量減少、細胞間隙增大、片狀壞死等病理性改變，LP該作用呈現(xiàn)一定劑量依賴性。

圖1 各組裸小鼠移植瘤瘤體質(zhì)量和抑瘤率 注：與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。LP1組：LP 5 mg/(kg·d);LP2組：LP 10 mg/(kg·d); LP3組：LP 20 mg/(kg·d);順鉑組：順鉑2 mg/(kg·d)

2.4 各組裸小鼠腫瘤組織細胞凋亡狀況 陰性對照組裸小鼠移植瘤組織存在極少量凋亡細胞，而LP各劑量和順鉑2 mg/(kg·d)組裸小鼠移植瘤凋亡細胞數(shù)量較陰性對照組明顯增多，LP該作用具有一定的劑量依賴性。見圖3。計算AI結(jié)果如圖4所示：陰性對照組AI為2.58%±1.16%，LP [5、10、20 mg/(kg·d)組和順鉑2 mg/(kg·d)組AI分別為23.04%±5.31%、40.29%±7.46%、61.07%±9.58%、46.91%±6.72%。治療14 d后，與陰性對照組比較，LP各劑量組及順鉑組荷肝癌裸小鼠移植瘤細胞AI顯著提高(P<0.01)；LP 20 mg/(kg·d)組AI較順鉑2 mg/(kg·d)組顯著升高(P<0.05)。

2.5 各組裸小鼠移植瘤組織中caspase-3蛋白表達 LP各劑量組和順鉑2 mg/(kg·d)組裸小鼠移植瘤組織中caspase-3蛋白表達較陰性對照組顯著上調(diào)，LP該作用具有一定劑量依賴性見圖5。半定量分析結(jié)果如表3所示：LP[10、20 mg/(kg·d)]組和順鉑2 mg/(kg·d)組裸小鼠移植瘤組織IHC染色切片caspase-3蛋白表達OD值較陰性對照組顯著升高(P<0.05，P<0.01)；其中LP 20 mg/(kg·d)組caspase-3蛋白表達OD值顯著高于順鉑2 mg/(kg·d)組(P<0.05)。

圖2 各組裸小鼠腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變(HE，400×) 注：A：陰性對照組；B：LP 5 mg/kg組；C：LP 10 mg/kg組；D：LP 20 mg/kg組；E：順鉑2 mg/kg組(下同)

圖3 各組裸小鼠腫瘤組織細胞凋亡狀況(TUNEL，400×)

圖4 各組裸小鼠腫瘤組織細胞AI比較

注：與陰性對照組比較，**P<0.01；與順鉑組比較，△P<0.05。

LP1組：LP 5 mg/(kg·d);LP2組：LP 10 mg/(kg·d);LP3組：LP 20 mg/(kg·d);順鉑組：順鉑2 mg/(kg·d)

2.6 各組裸小鼠移植瘤組織bcl-2蛋白和Bax蛋白表達 結(jié)果如圖6、圖7所示：LP各劑量組和順

鉑2 mg/(kg·d)組裸小鼠移植瘤組織中bcl-2蛋白表達較陰性對照組呈不同程度下調(diào)，Bax蛋白表達呈不同程度上調(diào)，LP上述作用均具有一定劑量依賴性。半定量分析結(jié)果如表1所示：LP[10、20 mg/(kg·d)]組和順鉑2 mg/(kg·d)組裸小鼠移植瘤組織IHC染色切片Bax蛋白表達OD值顯著上調(diào)，bcl-2蛋白表達OD值顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；LP 20 mg/(kg·d)組bcl-2、Bax蛋白表達較順鉑2 mg/(kg·d)組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.7 各組裸小鼠移植瘤組織中Bax/bcl-2比值 結(jié)果如表1所示，與陰性對照組比較，LP或順鉑治療14 d能夠顯著提高荷肝癌裸小鼠移植瘤組織Bax/bcl-2表達比值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；LP 20 mg/(kg·d)組腫瘤組織Bax/bcl-2表達比值較順鉑2 mg/(kg·d)組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖5 各組裸小鼠移植瘤組織中caspase-3蛋白表達(IHC，400×)

圖6 各組裸小鼠移植瘤組織bcl-2蛋白表達(IHC，400×)

圖7 各組裸小鼠移植瘤組織Bax蛋白表達(IHC，400×)表1 各組裸小鼠移植瘤組織中caspase-3、Bax、bcl-2表達OD值及Bax/bcl-2比值

組別只數(shù)caspase-3(OD)Bax(OD)bcl-2(OD)Bax/bcl-2陰性對照組160.08±0.020.29±0.070.50±0.090.58±0.16LP5mg/(kg·d)組160.15±0.04*0.53±0.11**0.46±0.121.14±0.23*LP10mg/(kg·d)組160.18±0.04**0.65±0.14**0.38±0.06*1.71±0.38**LP20mg/(kg·d)組160.21±0.05**△0.82±0.19**0.31±0.05**2.65±0.74**△順鉑2mg/(kg·d)組160.16±0.04*0.75±0.13**0.35±0.08**2.14±0.48**

注：與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與順鉑組比較，△P<0.05

3 討論

肝癌具有發(fā)病隱匿、發(fā)展迅速、轉(zhuǎn)移及侵襲能力強、惡性度高的特點[11-12]，目前臨床上對于肝癌的治療主要采取手術(shù)切除結(jié)合術(shù)后放化療的綜合治療方案[13-16]，但大多數(shù)患者就診時已達病程中晚期、失去手術(shù)機會，目前臨床上手術(shù)切除率僅為20%[17]，且5年復(fù)發(fā)率高達60%以上[18]，嚴重威脅人類的生命健康。所以研發(fā)能夠有效抑制肝臟腫瘤生長和復(fù)發(fā)的新型藥物是迫待解決的臨床難題。

LP是一種具有多種生物學(xué)活性的胡蘿卜素，廣泛存在于蔬菜和水果中。張濤等[19]和唐莉莉等[20]通過體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，LP能夠通過改變細胞周期而抑制前列腺癌細胞增殖；張衛(wèi)國等[21]研究發(fā)現(xiàn)，LP能夠通過干預(yù)NDA合成、改變細胞周期而表現(xiàn)出對胃癌細胞增殖的抑制作用。本實驗通過建立荷肝癌裸小鼠模型并給予LP干預(yù)進行治療，結(jié)果顯示，LP治療14 d，能夠有效改善荷肝癌裸小鼠的生存狀態(tài)，降低瘤體硬度和活動度，抑制移植瘤生長、提高抑瘤率，此外，LP還能夠誘導(dǎo)腫瘤組織細胞壞死，并促進腫瘤組織細胞凋亡；提示LP對荷肝癌裸小鼠移植瘤生長具有一定的抑制作用。

細胞凋亡過程由多種基因參與調(diào)控，其中caspase-3是激活各種凋亡刺激因子(Apaf-1)的關(guān)鍵蛋白酶，參與細胞凋亡的啟動及整個凋亡過程的調(diào)節(jié)；bcl-2能夠抑制線粒體破裂，可直接與Apaf-1結(jié)合而抑制caspase-3激活，抑制促凋亡蛋白Bax的細胞毒性作用，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣濃度，從而起到抑制細胞凋亡的作用[22-23]；Bax屬于bcl-2基因家族成員，誘導(dǎo)線粒體滲透性改變而釋放細胞色素C，激活促凋亡蛋白caspase-9，從而表現(xiàn)出促細胞凋亡的作用[24]。此外，Bax能夠與bcl-2聚合成二聚體，從而抑制bcl-2活性而促進細胞凋亡，所以Bax/bcl-2比值能夠明顯體現(xiàn)bcl-2基因家族對細胞凋亡的調(diào)控作用[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，LP治療14 d能夠有效上調(diào)荷肝癌裸小鼠腫瘤組織caspase-3蛋白和Bax蛋白表達，下調(diào)bcl-2表達，提高Bax/bcl-2比值，這可能是LP誘導(dǎo)移植瘤細胞凋亡的重要分子機制之一。

總之，LP可能通過誘導(dǎo)移植瘤細胞凋亡從而對荷肝癌裸小鼠移植瘤生長起到一定的抑制作用，其機制可能與LP能夠調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達有關(guān)。

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Effects and mechanism of lycopene on xenografts growth in liver cancer of nude mice

ZHAO Meng-lei*

(Department of the 3rd General Surgery,Handan Central Hospital,Handan 056001,China)

Objective To investigate the effects of Lycopene (LP) on xenografts growth in liver cancer of nude mice.Methods The nude mice models bearing liver cancer were made by injecting inoculation human liver cell line HepG2 and were treated with 5,10 and 20 mg/(kg·d) of LP and 2 mg/(kg·d) of cisplatin for 14 d.The rats′ general states and tumor growth conditions were observed,and the histopathological change of tumor tissue was observed by HE staining.The tumor cells apoptosis was detected by TUNEL.The expression of caspase-3,Bax and bcl-2 protein was detected by immunohistochemistry (IHC).Results The food and mental condition was improved after nude mice bearing liver cancer was treated with LP for 14 d,the tumor was reduced,and the activity and hardness was decreased.There were necrosis presentation,tumor cell shrinkage and other pathological morphological changes that appeared,and the number of apoptotic cells in tumor tissue was increased.The tumor weights of LP groups were decreased and the inhibition rates were increased.The expression of caspase-3 and Bax was significantly increased,while the expression of bcl-2 protein was decreased,and the ratio of Bax/bcl-2 was significantly increased;all the above effects were dose-dependent.Conclusion LP has inhibitive effects on xenografts growth in liver cancer of nude mice,which is perhaps related to its effects of regulating the expression of apoptosis-related genes and protein to promote tumor cell apoptosis.

Lycopene;Liver cancer;Xenografts;Nude mice

2016-10-06

河北省邯鄲市中心醫(yī)院普外三科，河北 邯鄲 056001

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201704002