胃癌BGC-823細(xì)胞中HIF-1α、HIF-2α對(duì)PKM2的調(diào)控作用

舍 玲，唐 勇，曲顏麗

胃癌BGC-823細(xì)胞中HIF-1α、HIF-2α對(duì)PKM2的調(diào)控作用

舍 玲，唐 勇*，曲顏麗

目的 研究siRNA特異性沉默人胃癌BGC-823細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α、HIF-2α)后PKM2的表達(dá)情況，探索HIF-1α、HIF-2α對(duì)胃癌細(xì)胞內(nèi)PKM2的調(diào)控作用。方法 用Realtime RT-PCR及Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染HIF-1α、HIF-2α及Control siRNA后細(xì)胞內(nèi)PKM2表達(dá)情況。結(jié)果 RNA干擾技術(shù)能有效沉默BGC-823細(xì)胞中的HIF-1α、HIF-2α。轉(zhuǎn)染HIF-1α、HIF-2α siRNA后，PKM2在mRNA及蛋白表達(dá)水平均下降(P<0.05)，其中siRNA抑制HIF-1α后，PKM2下調(diào)最明顯；轉(zhuǎn)染Control siRNA后，PKM2在mRNA及蛋白表達(dá)水平均無(wú)明顯變化(P>0.05)。結(jié)論 HIF-1α和HIF-2α均參與調(diào)控PKM2的表達(dá)，其中HIF-1α起主要調(diào)控作用，HIF-1α、HIF-2α與PKM2共同促進(jìn)腫瘤的Warburg效應(yīng)。

BGC-823細(xì)胞；缺氧誘導(dǎo)因子；M2型丙酮酸激酶；Warburg效應(yīng)

0 引言

實(shí)體腫瘤內(nèi)普遍缺氧，其缺氧水平主要由缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia inducible factors，HIFs)調(diào)節(jié)[1]。為了能夠在缺氧狀態(tài)下繼續(xù)產(chǎn)生足夠的能量，維持一系列生命活動(dòng)，腫瘤細(xì)胞主要采取糖酵解代謝形式，快速大量地產(chǎn)生ATP供能，這一現(xiàn)象稱(chēng)為Warburg效應(yīng)(Warburg effect)[2]。HIFs、M2型丙酮酸激酶(Pyruvate kinase M2)已被多項(xiàng)研究證實(shí)是腫瘤細(xì)胞Warburg效應(yīng)的重要調(diào)控因子。HIFs是腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧表達(dá)的一種核轉(zhuǎn)錄因子，缺氧狀態(tài)下可轉(zhuǎn)錄激活多種下游靶基因，使缺氧的腫瘤細(xì)胞能保持氧穩(wěn)態(tài)，以耐受缺氧狀態(tài)[1]。PKM2是糖酵解途徑中重要的限速酶，PKM2在腫瘤細(xì)胞核中與HIF-1α相互作用充當(dāng)HIF-1α的輔助轉(zhuǎn)錄因子[3]。有大量研究證實(shí)，HIF-1α與PKM2之間存在相互作用，可相互促進(jìn)表達(dá)，鮮有研究探索HIF-1α、HIF-2α對(duì)PKM2調(diào)控的對(duì)比。本研究中，我們檢測(cè)了siRNA抑制HIFs后，胃癌BGC-823細(xì)胞內(nèi)PKM2的表達(dá)情況，探索HIFs對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞內(nèi)PKM2的調(diào)控差異。

1 材料與方法

1.1 試劑 GAPDH抗體、HIF-1α、HIF-2α、Control siRNA購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；兔抗人HIF-1α、HIF-2α多克隆抗體、兔抗人PKM2多克隆抗體、羊抗兔IgG二抗、BGC-823細(xì)胞株、氯化鈷購(gòu)自武漢博士德公司；蛋白提取試劑盒、蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物公司；組織細(xì)胞RNA微量提取試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)自索萊寶公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購(gòu)自Thermo公司；Opti-MEM培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司；RT-PCR 試劑盒購(gòu)自Takara公司；SYBR Green熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自L(fǎng)ife Technologies；RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物有限公司；引物由生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)細(xì)胞 用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)胃癌BGC-823細(xì)胞，至對(duì)數(shù)期時(shí)，接種于六孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞接種于六孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%的融合面積時(shí)，選用LipofectamineTM2000，按其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，每孔加入轉(zhuǎn)染混合液500 mL，分別轉(zhuǎn)入HIF-1α、HIF-2α及Control siRNA。培養(yǎng)6 h后，換為RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，可提取細(xì)胞。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 細(xì)胞經(jīng)處理后，提取RNA，應(yīng)用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，配置20 μL的反應(yīng)液，每個(gè)樣本重復(fù)3個(gè)孔，于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)：7500fast)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min、95 ℃ 2 min預(yù)變性，95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)后測(cè)得各組Ct值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以GAPDH為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用2-ΔΔCt方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。PCR引物見(jiàn)表1。

表1 PCR引物

1.2.4 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集、提取并檢測(cè)各組蛋白濃度后，取25 μg總蛋白，經(jīng)用10%的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以5%的脫脂奶粉封閉90 min，放入一抗(HIF-1α、HIF-2α、PKM2以1∶200稀釋?zhuān)珿APDH以1∶1 000稀釋)中，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。用TBST清洗3遍后，加入HPR標(biāo)記的羊抗兔二抗(以1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h，TBST清洗3遍后，用ECL發(fā)光法顯色。應(yīng)用Bio-red Chemi DOC MP全能型成像分析系統(tǒng)攝取圖像，并分析圖形灰度值。

2 結(jié)果

2.1 siRNA沉默HIF-1α、HIF-2α的效果 與未轉(zhuǎn)染組比較，轉(zhuǎn)染HIF-1α、HIF-2α組mRNA、蛋白的表達(dá)量均下調(diào)(P<0.05)。未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染Control siRNA組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，見(jiàn)圖1～圖3、表2。

圖1 RT-qPCR法檢測(cè)RNAi對(duì)BGC-823細(xì)胞中HIF-1α、 HIF-2α mRNA表達(dá)的影響

圖2 Western blot法檢測(cè)RNAi對(duì)BGC-823細(xì)胞中 HIF-1α、HIF-2α蛋白表達(dá)的影響

圖3 Western blot法檢測(cè)RNAi對(duì)BGC-823細(xì)胞中 HIF-1α、HIF-2α蛋白表達(dá)的影響 注：A.未轉(zhuǎn)染組，B.轉(zhuǎn)染相應(yīng)HIF siRNA組，C.轉(zhuǎn)染Control siRNA組表2 不同處理組間HIF mRNA及蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)

項(xiàng)目未轉(zhuǎn)染組mRNA蛋白轉(zhuǎn)染相應(yīng)HIFsiRNA組mRNA蛋白轉(zhuǎn)染ControlsiRNA組mRNA蛋白HIF-1α10.61±0.040.41±0.060.46±0.070.98±0.120.58±0.08HIF-2α10.52±0.070.49±0.080.35±0.041.04±0.200.48±0.08

2.2 siRNA沉默HIF-1α、HIF-2α后對(duì)PKM2 mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響 與未轉(zhuǎn)染組比較，轉(zhuǎn)染各組(分別為轉(zhuǎn)染HIF-1α、HIF-2α、Control siRNA組)PKM2的mRNA表達(dá)量分別為0.74±0.04、0.77±0.06、1.05±0.21。除未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染Control siRNA組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各組與未轉(zhuǎn)染組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA組、轉(zhuǎn)染HIF-2α siRNA組、轉(zhuǎn)染Control siRNA組PKM2的蛋白表達(dá)量分別為0.55±0.06、0.36±0.06、0.42±0.07、0.58±0.11。轉(zhuǎn)染HIF-1α、HIF-2α后，PKM2表達(dá)水平均下降(P<0.05)，其中siRNA抑制HIF-1α后，PKM2下調(diào)最明顯；轉(zhuǎn)染Control siRNA后，PKM2蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變(P>0.05)，見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 RNAi對(duì)BGC-823細(xì)胞中PKM2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

圖5 Western blot法檢測(cè)各處理組蛋白的表達(dá) 注：A.未轉(zhuǎn)染組，B.轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA組，C.轉(zhuǎn)染HIF-2α siRNA組，D.轉(zhuǎn)染Control siRNA組

3 討論

胃癌是中國(guó)發(fā)病率極高的惡性腫瘤之一，2015年其死亡率僅次于肺癌，位居第二[4]。在胃癌中HIFs及PKM2高表達(dá)，共同促進(jìn)胃癌細(xì)胞Warburg效應(yīng)，在胃癌的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡、預(yù)后等過(guò)程中起重要作用。HIFs包括3種，其中，HIF-1和HIF-2是參與缺氧調(diào)節(jié)最重要的2種缺氧誘導(dǎo)因子，HIF-1、HIF-2的區(qū)別是α亞基不同，β亞基是HIFs的結(jié)構(gòu)性亞基，在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定，兩者的HIF-1β亞基相同。在常氧狀態(tài)下，α亞基迅速降解，在低氧狀態(tài)下，α亞基降解受阻，HIF-α?xí)掷m(xù)穩(wěn)定表達(dá)，不斷積聚，之后移至細(xì)胞核，與核內(nèi)HIF-1β結(jié)合形成二聚體HIF[5]。研究表明，HIF-1α[6-7]、HIF-2α[8-10]的高表達(dá)不僅是反映胃癌組織缺氧的重要指標(biāo)，其在胃癌增殖、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等過(guò)程中起到極其重要的作用。研究表明，胃癌中PKM2高表達(dá)與腫瘤TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移、預(yù)后差顯著相關(guān)[11-13]。此外，PKM2在胃腸道惡性腫瘤患者血清、糞便樣品中呈高表達(dá)，在胃癌的診斷方面有重要的價(jià)值[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α、HIF-2α、PKM2蛋白及mRNA在常氧下均表達(dá)。用RNA干擾技術(shù)特異性沉默HIF-1α、HIF-2α后，二者的蛋白及mRNA均受到明顯抑制，提示RNA干擾技術(shù)成功抑制了細(xì)胞內(nèi)HIFs的轉(zhuǎn)錄及翻譯。同時(shí)，其下游調(diào)控因子PKM2的蛋白及mRNA隨HIF-1α、HIF-2α表達(dá)的下降亦降低，其中HIF-1α抑制后，PKM2的表達(dá)下降更明顯。而轉(zhuǎn)染Control siRNA組與未轉(zhuǎn)染組間比較，HIFs、PKM2表達(dá)無(wú)明顯變化。提示HIF-1α、HIF-2α均可調(diào)控PKM2的表達(dá)。而目前研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α與PKM2通過(guò)PHD3[3]、雙加氧酶JMJD5[15]、EGFR[16]、STAT3[17]、mTOR[18]等介導(dǎo)相互作用。目前研究顯示，在脂類(lèi)代謝中，HIF-2α是起到主要調(diào)控作用的因子[19]，而在糖代謝途徑中，HIF-1α是發(fā)揮主導(dǎo)功能的調(diào)控因子。關(guān)于HIF-2α對(duì)糖代謝調(diào)控的研究甚少，早期Song等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌HIFs中，僅HIF-1α調(diào)控糖代謝。Shah等[21]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-2α在乳腺癌細(xì)胞代謝途徑方面起主要作用。Xu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在人紅白血病細(xì)胞中，HIF-2α通過(guò)調(diào)控pmt1調(diào)節(jié)細(xì)胞糖代謝。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，HIF-2α在調(diào)節(jié)糖代謝方面亦起到重要調(diào)節(jié)作用，本研究發(fā)現(xiàn)，HIF-2α對(duì)PKM2有調(diào)控作用，但具體的調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

綜上所述，HIF-1α、HIF-2α調(diào)控PKM2的表達(dá)，三者在促進(jìn)腫瘤代謝方面起重要作用，本研究為以HIF-1α、HIF-2α、PKM2為靶點(diǎn)的基因治療提供了一定的依據(jù)，旨在通過(guò)抑制信號(hào)通路和能量限制聯(lián)合治療腫瘤，進(jìn)而有望通過(guò)圍繞HIFs的綜合治療使惡性腫瘤成為一種普通的慢性病。

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Regulation effect of HIF-1α and HIF-2α on PKM2 in BGC-823 cells of gastric cancer

SHE Ling,TANG Yong*,QU Yan-li

(Department of Gastroenterology,Affiliated Tumor Hospital of Urumqi Medical University,Urumqi 830011,China)

Objective To compare the expression of PKM2 in BGC-823 cells after transfection with small interfering RNA of hypoxia-inducible factors (HIF-1α and HIF-2α) and investigate the effect of HIF-1α and HIF-2α on the regulation of PKM2 in gastric cancer.Methods Small RNA interference (RNAi) was used to silence BGC-823 cells.The mRNA and protein expression levels of HIF-1α,HIF-2α and PKM2 were detected by quantitative real-time reverse transcription PCR and western blotting.Results Small RNA interference (RNAi) could effectively silence the expressions of HIF-1α and HIF-2α genes and down-regulate the expression of PKM2 (P<0.05),and the levels of PKM2 decreased most obviously when being transfected with HIF-1α siRNA.The expression of PKM2 levels did not change significantly (P>0.05) when being transfected with control siRNA.Conclusion The results suggest that HIF-1α and HIF-2α are both involved in regulating PKM2.Compared to HIF-2α pathway,HIF-1α pathway plays a major role in regulating PKM2,and thus they all contribute to the Warburg effect of tumor.

BGC-823 cell;Hypoxia-inducible factors;Pyruvate kinase M2;Warburg effect

2016-11-10

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院消化內(nèi)科，烏魯木齊 830011

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2015211C124)

10.14053/j.cnki.ppcr.201704004

*通信作者