β-葡萄糖醛酸苷酶的重組表達(dá)及對黃芩苷的生物轉(zhuǎn)化

周 琪，竇同意，丁樂樂，曲明佳，翁仔淼，吳大暢，侯 潔

(1. 大連醫(yī)科大學(xué) 生物技術(shù)系， 遼寧 大連 116044；2. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 生物技術(shù)部 藥用資源開發(fā)組， 遼寧 大連 116023)

?

論 著

β-葡萄糖醛酸苷酶的重組表達(dá)及對黃芩苷的生物轉(zhuǎn)化

周 琪1，竇同意2，丁樂樂1，曲明佳1，翁仔淼1，吳大暢1，侯 潔1

(1. 大連醫(yī)科大學(xué) 生物技術(shù)系， 遼寧 大連 116044；2. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 生物技術(shù)部 藥用資源開發(fā)組， 遼寧 大連 116023)

目的 構(gòu)建表達(dá)β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase，GUS)的重組菌株，得到高純度β-葡萄糖醛酸酶，進(jìn)而對黃芩苷進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化獲得黃芩素。方法 以E.coliK12基因組DNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增GUS基因，經(jīng)酶切后連接到表達(dá)載體pET-28a中，獲得重組表達(dá)載體pET28a-GUS，將重組載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中，對所得基因工程菌進(jìn)行培養(yǎng)條件和表達(dá)條件的優(yōu)化；后經(jīng)分離純化后得到高純度β-葡萄糖醛酸酶。以黃芩苷為底物進(jìn)行酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)黃芩素，并對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果 經(jīng)測序，擴(kuò)增的重組質(zhì)粒目的基因序列與數(shù)據(jù)庫中GUS基因序列一致。經(jīng)IPTG(isopropy-β-D-thiogalactoside)誘導(dǎo)表達(dá)后， SDS-PAGE分析獲得分子質(zhì)量70 kDa的單一蛋白條帶，工程菌最適培養(yǎng)條件為： 37 ℃、pH7.2、IPTG濃度0.6 μmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間12 h。經(jīng)過離心破碎、親和層析、凍干后得到高純度β-葡萄糖醛酸酶凍干粉。在該酶催化轉(zhuǎn)化下，黃芩苷可轉(zhuǎn)化為黃芩素，在40 ℃，pH 6.5，酶濃度60 μg/mL條件下，反應(yīng)2.5 h，黃芩苷轉(zhuǎn)化率可達(dá)72.5%。結(jié)論 成功構(gòu)建了β-葡萄糖醛酸苷酶高表達(dá)菌株，并用于黃芩苷的定向水解制備黃芩素，為生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)黃芩素提供了新思路。

黃芩素；酶解；黃芩苷；β-葡萄糖醛酸苷酶

黃芩是傳統(tǒng)中藥，為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，具有抗菌，抗炎，抗病毒、抗腫瘤等作用[1-2]。黃芩中含有多種黃酮類化合物：黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素等20余種成分[1-3]。其中，黃芩苷經(jīng)口服進(jìn)入腸道后，在腸道內(nèi)經(jīng)腸道菌水解為黃芩素被吸收入血，進(jìn)而發(fā)揮作用[4-5]。臨床藥效實(shí)驗(yàn)證明，黃芩素比黃芩苷具有更強(qiáng)的生理活性[1,6]。目前，黃芩素的制備方法主要有以下3種：(1)從藥材黃芩中分離提取；(2)水解黃芩苷制備黃芩素；(3)黃芩苷生物轉(zhuǎn)化制備黃芩素[7-8]。在黃芩中，黃芩素含量低(一般在0.1%～0.5%之間)，直接提取分離收率很低。采用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)黃芩素反應(yīng)溫和，易于控制，且無環(huán)境污染[9]。目前，國內(nèi)已報(bào)道多種微生物用于黃芩素的生物制備，如黑曲霉[8]、人腸道菌[4]、白腐真菌[10]、米曲霉[11]等。由于黃芩苷為β-葡萄糖醛酸苷，苷元為黃芩素。在β-葡萄糖醛酸酶的催化作用下，黃芩苷可定向水解為黃芩素(圖1)。因此，本實(shí)驗(yàn)提出酶法生物轉(zhuǎn)化黃芩苷制備黃芩素，首先對β-葡萄糖醛酸苷酶基因進(jìn)行克隆，并構(gòu)建β-葡萄糖醛酸苷酶基因工程菌，通過發(fā)酵生產(chǎn)獲得高純度β-葡萄糖醛酸苷酶。在此基礎(chǔ)上，建立β-葡萄糖醛酸苷酶催化體系，對黃芩苷進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化制備黃芩素。

圖1 黃芩苷生物轉(zhuǎn)化過程Fig 1 Biotransformation of baicalin to baicalein

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌E.coliK12菌株、質(zhì)粒載體pET-28a(+)、表達(dá)菌株感受態(tài)細(xì)胞JM109、BL21(DE3)、DNA Polymerase(Code No.R045A)、Nde I和Xho I限制性內(nèi)切酶、DNA純化試劑盒、5×In-Fusion HD Enzyme Premix均購自大連Takara公司。LB培養(yǎng)基瓊脂、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、苯甲基磺酰氟(PMSF, Phenylmethanesulfonyl fluoride)、對硝基酚-β-葡萄糖醛酸苷(PNPG, p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)等均為國產(chǎn)分析純。黃芩苷、黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，其他試劑為分析純。

電泳儀(Bio-rad)，高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司)，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(JY-96-Ⅱ?qū)幉粕鷥x器廠)，PCR擴(kuò)增儀(美國Applied Biosystems公司)，酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)，高效液相色譜儀(日本島津公司)。

1.2 方 法

1.2.1 GUS基因PCR擴(kuò)增

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫查找E.coliK12 GUS基因序列，并根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物對將大腸桿菌E.coliK12株菌體于50 μL 裂解液(TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.9164))中變性后離心取上清作為模版，擴(kuò)增GUS基因，反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，2×PrimeSTAR Max Premix: 25 μL，P1 (20 pmol/μL) 1 μL，P2 (20 pmol/μL) 1 μL，ddH2O 20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃變性10 s，55 ℃復(fù)性15 s，72 ℃延伸10 s，35個(gè)循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收PCR產(chǎn)物。

引物： P1，5'-GGTGCCGCGCGGCAGCCATATG-TTACGTCCTGTAGAA-3',P2，5'-GGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCATTGTTTGCCTCC-3'，劃線部分分別為Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)。

1.2.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-GUS

使用限制酶Nde I和Xho I對pET-28a(+)質(zhì)粒進(jìn)行酶切，反應(yīng)體系如下：pET-28a(+)30 μL，10×H Buffer 5 μL，Nde I(10 U/μL)2.5 uL，Xho I(10 U/μL)2.5 μL，用ddH2O 補(bǔ)至總體積為50 μL，反應(yīng)條件37 ℃，16 h。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

將PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒進(jìn)行連接反應(yīng)制備重組表達(dá)載體pET-28a-GUS。反應(yīng)體系：質(zhì)粒 5 μL，PCR產(chǎn)物 (50 ng/μL ) 2 μL，5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2 μL，用ddH2O將體積補(bǔ)至10 μL。連接反應(yīng)條件：50 ℃，15 min。取連接產(chǎn)物1 μL熱轉(zhuǎn)化至E.coliCompetent Cell JM109(Code No.9052)中，涂布平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆植菌，提取質(zhì)粒后對其進(jìn)行測序。

1.2.3 重組β-葡萄糖醛酸苷酶在大腸桿菌中的表達(dá)

經(jīng)證實(shí)，質(zhì)粒測序結(jié)果與參考序列完全一致后，取該質(zhì)粒1 μL熱轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)菌株中，涂布平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆菌即為重組基因工程菌。在劃線平板上選取陽性重組子放入5 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；按1%接種量轉(zhuǎn)接到含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃ 振蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期(OD600=0.6～0.8)時(shí)，加入IPTG至終濃度1 μmol/L，繼續(xù)在37 ℃ 搖床振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)過夜，取出1 mL培養(yǎng)物，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析及酶活力測定，選取酶活力及表達(dá)量最高的發(fā)酵條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 β-葡萄糖醛酸酶的分離純化

誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，取菌液于5000×g條件下離心15 min，棄上清，用PBS(pH 7.4)對沉淀進(jìn)行重懸，加入PMSF(終濃度0.1 mmol/L)后于冰浴條件下超聲破碎1 h。隨后在20000×g、4 ℃條件下離心20 min，所得上清即含有目的蛋白。

使用Ni親和層析柱對目的蛋白進(jìn)行親和層析，目的蛋白將隨洗脫液一起流下。收集洗脫液于透析袋中，在水中透析2次，每次1～2 h，隨后透析過夜即可，透析結(jié)束后透析袋中的蛋白會有所析出而使袋內(nèi)液體呈現(xiàn)白色。收集透析后液體于離心管中，于-80 ℃冰箱放置過夜，隨后至凍干機(jī)冷凍干燥，即得到高純度β-葡萄糖醛酸酶凍干粉。

1.2.5 酶活力的測定

取10 μL PNPG(20 mmol/L)的PBS溶液，加入5 μL的酶溶液(10 μg/mL)，補(bǔ)充85 μL的PBS緩沖液，混勻后，在37 ℃條件下連續(xù)測定反應(yīng)液在405 nm條件下的OD變化值，將在37 ℃，pH 7.4條件下，每分鐘形成1 μmol pNP所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.6 黃芩苷轉(zhuǎn)化分析方法的建立

參照文獻(xiàn)[4]方法，測定轉(zhuǎn)化液中黃芩苷水解產(chǎn)物黃芩素的含量。黃芩素的測定選用紫外吸光光度法。黃芩素結(jié)構(gòu)中A環(huán)上有5,6,7三羥基結(jié)構(gòu)，經(jīng)測定黃芩素在紫外光區(qū)355 nm處有最大吸收，可通過其吸光度值來測定黃芩素生成量。以DMSO為溶劑，配制10 mmol/L 的黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用PBS分別稀釋到20、40、60、80、100、120、160 和200 μmol/L，然后利用酶標(biāo)儀在355 nm處檢測其吸光度值，以吸光度對溶液濃度作黃芩素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 黃芩苷的生物轉(zhuǎn)化

取200 μmol/L的黃芩苷溶液10 μL，加入10 μL的酶溶液，補(bǔ)充PBS緩沖液至100 μL，混勻后，在37℃下孵育一定時(shí)間后，向反應(yīng)液中加入等體積的乙醇終止反應(yīng)，反應(yīng)體系經(jīng)高速(20000×g)離心后取上清液用甲醇稀釋后備用。以PBS為空白參照，測定離心上清液中黃芩素的吸光度值，根據(jù)黃芩素標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算黃芩素的生成量。

1.2.8 反應(yīng)條件的優(yōu)化及確定

對以下6個(gè)因素：pH、接種比、培養(yǎng)時(shí)間、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度(表1)，使用minitab 17 軟件的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)部件對蛋白表達(dá)的最適條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和探究，得出因子回歸方程。對不同誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)的總酶活力、細(xì)菌密度和總蛋白濃度進(jìn)行測定，探究誘導(dǎo)時(shí)間與總酶活力之間的關(guān)系。

按照表2中的試驗(yàn)因素和水平進(jìn)行正交設(shè)計(jì)。選擇L9(34)正交表作為實(shí)驗(yàn)方案(表3)進(jìn)行條件優(yōu)化。通過單因素實(shí)驗(yàn)確定正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)范圍，優(yōu)化黃芩甘苷轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件，并進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表2 實(shí)驗(yàn)因素和水平Tab 2 Factors and levels in orthogonal array design for reaction optimization

表3 正交試驗(yàn)優(yōu)化方案Tab 3 Orthogonal assay for reaction optimization

2 結(jié) 果

2.1 β-葡萄糖醛酸酶的重組表達(dá)

2.1.1 GUS基因的克隆與序列分析

瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)物的分子量約為1.8 kb(圖 2)，擴(kuò)增目的基因序列與數(shù)據(jù)庫中GUS基因(GenBank accession no: NC_000913.3)序列一致。

圖2 GUS基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig 2 PCR amplification of GUS gene

2.1.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)純化

將重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)前后的粗酶提取物(未經(jīng)純化的β-葡萄糖醛酸酶，含雜質(zhì))進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖3a)，結(jié)果表明，與誘導(dǎo)前相比，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后酶的表達(dá)量明顯提高，且分布于細(xì)胞裂解液中(圖3a，條帶3)。經(jīng)鎳親和色譜進(jìn)一步純化后得到蛋白，并進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明蛋白條帶清晰單一，大小約為70 kDa，與目標(biāo)蛋白相符，且純度較高(圖3b)。

a:1和2條帶分別為未誘導(dǎo)細(xì)胞裂解液的上清和沉淀；3和4條帶分別為誘導(dǎo)細(xì)胞裂解液的上清和沉淀。b:1～6條帶為依次被洗脫下的后β-葡萄糖醛酸苷酶，7條帶為純化前的粗酶液。 M 均為蛋白marker 圖3 裂解細(xì)胞和β-葡萄糖醛酸苷酶純化酶的SDS-PAGE分析Fig 3 SDS-PAGE analyze of lysis cell and β-glucuronidase

2.1.3 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

使用minitab 17軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，條件1～8(表1)誘導(dǎo)的粗酶液總酶活力分別為471.4 U,2988 U,2177.1 U,2338.2 U,1256.3 U,1028.5 U,2948.5 U,1332 U，可知誘導(dǎo)時(shí)間是粗酶液總酶活力的顯著性影響因素(圖4a)。對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，其因子回歸方程如下：酶液活力(U)=-10393+1170A+104.2B+60.42C+594.6D+397.7E+300.1F-37.27A*F。其中A: pH; B: 接種比(mL); C: 培養(yǎng)時(shí)間 (h); D: IPTG 濃度 (μmol/L); E: 誘導(dǎo)時(shí)間 (h); F: 誘導(dǎo)溫度 (℃)。

a：誘導(dǎo)時(shí)間對總酶活力的影響；b：IPTG濃度對總酶活力影響圖4 誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度對總酶活力的影響Fig 4 Effect of induction time and IPTG concentration on the total enzyme activity

2.1.4 誘導(dǎo)表達(dá)條件的確定

當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為8 h時(shí)蛋白濃度達(dá)到最高，而誘導(dǎo)時(shí)間為12 h時(shí)總酶活力達(dá)到最高(圖5a和b)，并且此時(shí)菌處于穩(wěn)定期生長。因此，β-葡萄糖醛酸苷酶表達(dá)的最適條件為37 ℃、pH 7.2、0.6 μmol/L IPTG誘導(dǎo)12 h，在此條件下可以從1 L培養(yǎng)液中獲得320 mg高純度β-葡萄糖醛酸酶凍干粉純酶。

a：誘導(dǎo)時(shí)間對總酶活力及細(xì)菌密度的影響，1為總酶活力，2為細(xì)菌密度；b：誘導(dǎo)時(shí)間對總酶活力及總蛋白濃度的影響，1為總酶活力，2為總蛋白濃度圖5 誘導(dǎo)時(shí)間對蛋白表達(dá)及酶活力的影響Fig 5 Effect of the induction time on the protein expreesion and enzyme activity

2.2 黃芩苷的生物轉(zhuǎn)化

2.2.1 黃芩苷轉(zhuǎn)化分析方法的建立

對黃芩素和黃芩苷進(jìn)行了吸收波長波譜掃描，黃芩素最大吸收峰出現(xiàn)在355 nm處(圖6a)，而在相同情況下黃芩苷幾乎沒有吸收(圖6b)。利用酶標(biāo)儀檢測355 nm處吸光度值，并以吸光度對溶液濃度作黃芩素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以進(jìn)行反應(yīng)體系中黃芩素的定量檢測。

a：黃芩素和黃芩苷吸收波長波譜；b：黃芩素的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖6 黃芩素檢測方法的建立Fig 6 Analysis method for the biotransformation

2.2.2 優(yōu)化轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件

正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，采用A3B3C3方案確定底物轉(zhuǎn)化效率最高的反應(yīng)條件。即在底物濃度為200 μmol/L，pH為6.5，酶濃度為60 μg/mL，反應(yīng)溫度為40 ℃時(shí)，經(jīng)過2.5 h的孵育后黃芩苷的轉(zhuǎn)化率最高，可達(dá)72.5%。見表4。

表4 黃芩苷轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化Tab 4 Condition optimization of the baicalin biotransformation to baicalein

3 討 論

生物轉(zhuǎn)化是一種高效和具有選擇性的溫和催化體系，酶及酶體系能將許多天然化合物轉(zhuǎn)化為具有高生物活性物質(zhì)。酶法生物轉(zhuǎn)化黃芩苷制備黃芩素，可以獲得更高效、更穩(wěn)定的活性物質(zhì)。黃芩苷結(jié)構(gòu)中包含黃芩素苷元和1個(gè)分子葡萄糖醛酸，利用β-葡萄糖醛酸苷酶或產(chǎn)酶菌可對黃芩苷進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，得到黃芩素。β-葡萄糖醛酸苷酶是一種酸性水解酶，黑曲霉[8]、人腸道菌E.coli[4]、白腐真菌[10]、米曲霉均可作為野生型產(chǎn)酶菌，在發(fā)酵過程中將黃芩苷作為底物，對其催化水解。然而微生物發(fā)酵過程中，發(fā)酵液成分復(fù)雜，分離純化困難，往往收率較低。通過對β-葡萄糖醛酸苷酶基因進(jìn)行克隆制備得到高效產(chǎn)酶菌，進(jìn)而獲得高純度酶粉，對黃芩苷進(jìn)行酶催化水解，體系穩(wěn)定且有利于黃芩素的分離提取。

鑒于β-葡萄糖醛酸苷酶在野生E.coli中高度表達(dá)，本研究通過對野生型E.coliK12中的β-葡萄糖醛酸苷酶基因進(jìn)行克隆表達(dá)，使用pET-28a(+)作為質(zhì)粒載體，最終將其轉(zhuǎn)入BL21(DE3)宿主菌種，構(gòu)建了基因工程菌。通過對比發(fā)酵后，野生型及工程菌中發(fā)酵液及破碎后菌體中的蛋白成分，發(fā)現(xiàn)野生型發(fā)酵液及裂解液中，蛋白成分均比較復(fù)雜，將為β-葡萄糖醛酸苷酶的純化帶來困難；而工程菌細(xì)胞裂解液中，β-葡萄糖醛酸苷酶為單一蛋白成分，有利于蛋白的進(jìn)一步分離純化。使用鎳柱親和層析對酶進(jìn)行純化，得到高純度的凍干酶粉。以上結(jié)果說明通過基因克隆及誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了目標(biāo)單酶。

工程菌發(fā)酵過程中，蛋白在誘導(dǎo)早期迅速積累并容易形成結(jié)構(gòu)折疊錯(cuò)誤、無功能的蛋白，而在誘導(dǎo)后期由于營養(yǎng)缺乏使菌體處于應(yīng)激狀態(tài)，結(jié)構(gòu)折疊錯(cuò)誤的蛋白進(jìn)行重新折疊形成結(jié)構(gòu)正確、功能完整的蛋白[12]。因此，為了探究誘導(dǎo)時(shí)間與總酶活力之間的關(guān)系，對不同誘導(dǎo)時(shí)間的總酶活力、細(xì)菌密度和總蛋白濃度進(jìn)行了考察。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)β-葡萄糖醛酸苷酶最適條件為37 ℃、pH 7.2、0.6 μmol//L IPTG誘導(dǎo)12 h，在此條件下可以從1 L培養(yǎng)液中獲得320 mg純酶。

將上述分離得到的β-葡萄糖醛酸苷酶用于黃芩苷的催化水解中，得到黃芩素。通過前期對單一條件實(shí)驗(yàn)確定正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)范圍，采用A3B3C3方案對反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化。最終確定底物濃度為200 μmol/L，pH為6.5，酶濃度為60 μg/mL，反應(yīng)溫度為40 ℃時(shí)，經(jīng)過2.5 h的孵育后黃芩苷的轉(zhuǎn)化率最高，可達(dá)72.5%。在3種因素中，溫度對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率影響最大，pH影響較小，而酶濃度的增加有利于轉(zhuǎn)化率的提高。由于產(chǎn)物黃芩素本身對酶活性可能存在一定的抑制關(guān)系，延長反應(yīng)時(shí)間并不能明顯提高黃芩苷的轉(zhuǎn)化率。在前期工作中，我們利用C18WAX固相萃取柱可以實(shí)現(xiàn)葡萄糖醛酸苷和苷元的快速分離，由于黃芩苷與黃芩素兩者存在類似的結(jié)構(gòu)差異[13]，因此，可以利用此方法進(jìn)行分離純化產(chǎn)物黃芩素，在后續(xù)研究中將體系中黃芩素的分離提純進(jìn)行優(yōu)化，為黃芩素的生物制備提供條件。

本研究成功構(gòu)建了表達(dá)β-葡萄糖醛酸苷酶的高產(chǎn)菌株，并得到高純度β-葡萄糖醛酸苷酶，成功對黃芩苷進(jìn)行催化水解獲得黃芩素，并建立了利用β-葡萄糖醛酸苷酶對黃芩苷進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的方法。本方法成本低、對環(huán)境無污染，為生物轉(zhuǎn)化黃芩苷制備黃芩素提供了新的思路。

[1] 辛文妤, 宋俊科, 何國榮, 等. 黃芩素和黃芩苷的藥理作用及機(jī)制研究進(jìn)展 [J]. 中國新藥雜志, 2013, 22(6): 647-659.

[2] Chen J, Li Z, Chen AY. Inhibitory effect of baicalin and baicalein on ovarian cancer cells [J]. Int J Mol Sci, 2013, 14(3): 6012-6025.

[3] 馬文轉(zhuǎn), 王金玲, 屠鵬飛. 黃芩苷納米膠束的制備、表征及其對MCF-7細(xì)胞抑制作用的研究 [J]. 中草藥, 2015, 46(4): 507-512.

[4] 劉伶文, 司磊，任樹勇，等. 人腸道菌對黃芩苷的生物轉(zhuǎn)化 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2012, 24: 1437-1440, 1392.

[5] Muto R, Motozuka T, Nakano M, et al. The chemical structure of new substance as the metabolite of baicalin and time profiles for the plasma concentration after oral administration of sho-saiko-to in human [J]. Yakugaku Zasshi, 1998, 118(3): 79-87.

[6] Noh K, Kang Y, Nepal MR, et al. Role of intestinal microbiota in baicalin-induced drug interaction and its pharmacokinetics [J]. Molecules, 2016, 21(3): 337.

[7] 于蓓蓓, 呂凌, 于宗淵, 等. 基于抑菌藥效的黃芩提取物精制工藝優(yōu)選[J]. 中草藥, 2014, 45(3): 362-366.

[8] 薛慧玲, 徐萌萌, 陽泰, 等. 黃芩苷微生物發(fā)酵產(chǎn)物的分離提取[J]. 天然產(chǎn)物分離, 2005, 3(5): 5-7.

[9] 馮冰, 馬白平. 天然產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2005,36(6): 941-945.

[10] 楊希, 劉伶文, 王璐倩, 等. 白腐真菌轉(zhuǎn)化黃芩苷生成黃芩素的研究[J]. 西安工程大學(xué)學(xué)報(bào), 2015(1): 57-61.

[11] 賀美, 邱德全, 柏仕杰. 米曲霉兩步活化法對黃芩苷的生物轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的純化與鑒定[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 27(6): 41-44.

[12] Villaverde A, Carrió MM. Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies [J]. Biotechnol Lett, 2003, 25(17), 1385-1395.

[13] 楊剛, 朱亮亮, 呂俠, 等. 雙酚A葡萄糖醛酸苷的高效制備[J]. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 35(2): 314-318.

Bioconversion of baicalin to baicalein with recombinantβ-glucuronidase in Escherichia coli

ZHOU Qi1, DOU Tongyi2, DING Lele1, QU Mingjia1, WENG Zimiao1, WU Dachang1, HOU Jie1

(1.DepartmentofBiotechnology,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China; 2.DalianInstituteofChemicalPhysics,ChineseAcademyofSciences,Dalian116023,China)

Objective To develop a novel and environmental-friendly method for bioconversion of baicalin to baicalein with recombinantβ-glucuronidase. Methods Theβ-glucuronidase encoding gene (GUS) was cloned fromEscherichiacoliwild strain K12, and transformed intoEscherichiacoliBL21 (DE3) with pET-28a (+) as the vector.β-Glucuronidase was overexpressed and then purified by Ni affinity chromatography in one step. The biotransformation of baicalin to baicalein was performed by the recombinantβ-glucuronidase, and the reaction conditions were optimization with orthogonal design. Results The protein was identified by SDS-PAGE with 70 kDa, and the maximum expression level could be achieved after induction for 12 h with 0.6 μmol/L IPTG, and 320 mg of purified enzyme, which could be obtained from one liter of bacterial culture. With the catalysis of the recombinantβ-glucuronidase, the baicalin was transformed to baicalein with 72.5% conversion ratio under optimized conditions. Conclusion A novel and environmental-friendly scheme for bioconversion of baicalin to baicalein with recombinantβ-glucuronidase was established. The method would hold great promise for further applications in both scientific research and biomedical industry.

baicalein;biosynthesis; baicalin;β-glucuronidase

10.11724/jdmu.2017.02.02

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81273590，81302793);精細(xì)化工國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(KF1408)

周 琪(1988-)，女，助理實(shí)驗(yàn)師。E-mail: zhouqi@dmu.edu.cn

侯 潔，副教授。E-mail: houjie@nankai.edu.cn

Q819; R284.3

A

1671-7295(2017)02-0110-06

周琪，竇同意，丁樂樂，等.β-葡萄糖醛酸苷酶的重組表達(dá)及對黃芩苷的生物轉(zhuǎn)化[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,39(2)：110-115.

2016-12-14；

2017-03-28)