• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    黃瓜花葉病毒基因沉默載體的效率和穩(wěn)定性分析

    2017-04-26 02:38:52向志丹張震霄杜志游
    浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報 2017年4期
    關(guān)鍵詞:花葉病毒侵染質(zhì)粒

    向志丹,張震霄,李 超,杜志游

    (浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310018)

    黃瓜花葉病毒基因沉默載體的效率和穩(wěn)定性分析

    向志丹,張震霄,李 超,杜志游*

    (浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310018)

    病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)已被廣泛應(yīng)用于植物基因的功能研究。試驗以八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase, PDS)作為指示基因,在本生煙體內(nèi)分析黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus, CMV)作為VIGS載體對植物內(nèi)源PDS mRNA的沉默效率。采用分子克隆的方法,將Fny-CMV 2b ORF替換為不同長度的PDS序列,并分析了其在本生煙植物上誘導(dǎo)的PDS沉默效率。結(jié)果表明,該重組病毒能誘導(dǎo)上部系統(tǒng)葉的光漂白表型,且沉默效率與插入片段長度呈一定的正相關(guān)性,但在頂端新生葉中均不引起明顯的光漂白現(xiàn)象,過長的片段插入(≥518 nt)影響病毒基因組的遺傳穩(wěn)定性,導(dǎo)致插入片段的部分缺失。CMV作為 VIGS載體,最適合的插入片段約為350 nt。

    病毒誘導(dǎo)的基因沉默;黃瓜花葉病毒;2b;八氫番茄紅素脫氫酶

    病毒誘導(dǎo)的基因沉默 (virus induced gene silencing, VIGS)是一種分子遺傳學(xué)技術(shù),即利用病毒作為一個外源基因片段的載體,通過病毒復(fù)制和寄主RNA沉默機制產(chǎn)生外源片段的siRNA,進而通過siRNA途徑沉默靶標(biāo)mRNA。由于該技術(shù)具有周期短和操作簡便等優(yōu)點,已被廣泛地應(yīng)用于植物的基因功能研究。到目前為止,已有眾多VIGS載體的報道。其中,應(yīng)用最為廣泛的VIGS載體為煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus, TRV)[1]。

    黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus, CMV)是屬于雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)的典型成員。CMV可侵染包括茄科、十字花科、豆科及葫蘆科等重要經(jīng)濟作物在內(nèi)的1 000多種植物[2]。CMV基因組由3條正義單鏈RNA(RNA1-3)組成。RNA1和RNA2可直接作為模板翻譯合成1a和2a(RdRp)蛋白,負責(zé)病毒的復(fù)制;此外,RNA2還通過其亞基因組RNA4A編碼產(chǎn)生約12~15 ku的2b蛋白。2b ORF 5’端與2a ORF的3’端有240個堿基的重疊。2b蛋白是一種多功能蛋白,包括病毒致病因子和RNA沉默的抑制子。RNA3編碼3a蛋白(即移動蛋白,MP)和外殼蛋白(CP),負責(zé)病毒的細胞間移動、長距離移動和病毒粒子的包裝[2-3]。

    CMV的VIGS載體能有效地誘導(dǎo)本生煙和玉米植物內(nèi)源mRNA的沉默[4-6],但是報道的CMV載體均保留了2b蛋白的N端約80個氨基酸序列,內(nèi)含RNA沉默抑制子活性的功能域。因此,保留的2b序列有可能會影響病毒誘導(dǎo)的基因沉默。為此,本試驗利用一段八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase, PDS)cDNA完全替換Fny-CMV株系的2b ORF,在本生煙體內(nèi)分析該CMV重組體對植物內(nèi)源PDS mRNA的沉默效率;在此基礎(chǔ)上,進一步分析PDS插入片段的長度與CMV誘導(dǎo)沉默效率的關(guān)系,以及插入片段的遺傳穩(wěn)定性,從而明確CMV VIGS載體的最適插入片段長度。

    1 材料與方法

    1.1 試劑

    AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、高保真PyrobestTMDNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶均購于TaKaRa公司。T4 DNA連接酶購于NEB公司。RiboMax體外轉(zhuǎn)錄試劑盒、m7GpppG Cap類似物和Klenow大片段均購于Promega公司。其他試劑購于上海生工。

    1.2 植物及其生長

    本生煙(Nicotianabenthamiana)幼苗于22~28 ℃、16 h光周期的植物培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

    1.3 質(zhì)粒及其構(gòu)建

    CMV株系Fny基因組RNA1-3的侵染性克隆pF109、pF209和pF309由Dr. Peter Palukaitis提供[7]。2b缺失質(zhì)粒pF209Δ2b由本實驗室構(gòu)建[8]。根據(jù)前期報道的方法,構(gòu)建pF209Δ2b-PDS353重組質(zhì)粒。擴增片段Ⅰ和片段Ⅲ的PCR引物以及方法完全參照前期描述的方法[8]。片段Ⅱ為PDS序列,利用引物NbPDS1437F和NbPDS1879R (表1),以本生煙的mRNA作為模板,通過常規(guī)RT-PCR擴增獲得353 bp大小的DNA片段。然后,通過重疊PCR,將片段Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ混合作為PCR模板,進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)HindⅢ和PstⅠ酶切,克隆至pF209質(zhì)粒,產(chǎn)生pF209Δ2b-PDS353重組質(zhì)粒。值的一提的是,我們在PDS片段的上下游分別引入ApaⅠ和MluⅠ克隆位點,便于后續(xù)PDS片段的克隆。

    為了構(gòu)建含有不同長度的PDS片段的重組質(zhì)粒,我們利用不同的上游引物與NbPDS1879R組合,PCR擴增獲得104、219、518、750和1 030 bp的PDS DNA片段。經(jīng)ApaI和MluI酶切,克隆至預(yù)先經(jīng)ApaI/MluI酶切的pF209Δ2b-PDS353質(zhì)粒,構(gòu)建產(chǎn)生重組質(zhì)粒PDS104、PDS219、PDS518、PDS750和PDS1030。所有重組質(zhì)粒都經(jīng)測序確定。

    表1 用于構(gòu)建質(zhì)粒PDS重組質(zhì)粒的引物序列

    Table 1 List of primers used for constructing PDS recombinant plasmids

    引物名稱Primername引物序列Primersequence(5’-3’)質(zhì)粒plasmidsNbPDS760FGGGCCCAGAACTAGGGATTGATGATCPDS1030NbPDS1040FGGGCCCAGGGTGACAGATGAGGPDS750NbPDS1272FGGGCCCAGCTGAATGAGGATGGPDS518NbPDS1437FCCAACAAACAGCGAAAGAATTATTGATA-AGGGCCCTGGGAGTTCCTGTGATAAATGTCPDS353NbPDS1571FGGGCCCCAATCAGTCTATGTTGGAPDS219NbPDS1686FGGGCCCTTTCGGCAGATCAGAGPDS104NbPDS1879RAGATGCGGAAGGGGAGGTTTCAACGCGTCCGACAGGGTTCACAACCT—

    1.4 體外轉(zhuǎn)錄和病毒接種

    pF109、pF309、pF209及其突變體和PDS重組體經(jīng)PstI酶切線性化,然后利用RiboMax體外轉(zhuǎn)錄試劑盒合成相應(yīng)的RNA。將CMV的三條基因組以1∶1∶1的比例混合,摩擦接種至5~6葉期的本生煙。

    1.5 病毒RNA的雜交檢測

    根據(jù)Trizol試劑的使用操作說明,提取葉組織總RNA??俁NA經(jīng)nanodrop定量和1×TBE瓊脂糖電泳的質(zhì)量檢測??俁NA的瓊脂糖-甲醛變性電泳、轉(zhuǎn)膜以及Northern雜交檢測參考文獻報道的方法[8]。

    1.6 PDS mRNA的相對定量

    利用Trizol試劑提取CMV重組病毒侵染的本生煙光漂白葉組織的總RNA,然后參考先前描述的方法進行實時熒光定量PCR檢測[9]分析PDS mRNA的相對水平。EF1α作為內(nèi)參基因,引物序列詳見文獻[9]。PDS 特異的上下游引物分別為NbPDS405F: 5’-CCACGACCCGAAGATTGAC-3’和 NbPDS511R: 5’-TAACGCCGCCTCCAAATAG-3’。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 CMV沉默載體的構(gòu)建和沉默效率的測定

    CMV 2b蛋白是一個有效的RNA沉默抑制子,其抑制活性位于其N端61氨基酸[10],且該蛋白在多數(shù)植物上對病毒的復(fù)制和移動是非必需的[3],因此,我們將Fny-CMV的2b ORF替換為353 bp的PDS片段,構(gòu)建了pF209Δ2b-PDS353重組質(zhì)粒(圖1-A)。通過體外轉(zhuǎn)錄,將其與Fny-CMV RNA1和RNA3的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物混合接種本生煙,產(chǎn)生重組病毒Fny-CMVΔ2b-PDS353;同時,以接種2b基因缺失的突變體Fny-CMVΔ2b作為對照。在整個病毒癥狀觀察期間,對照病毒Fny-CMVΔ2b僅引起輕微的花葉癥狀。然而,接種后7 d,F(xiàn)ny-CMVΔ2b-PDS353侵染引起上部系統(tǒng)葉出現(xiàn)明顯的沿脈褪綠;接種后25 d,以上系統(tǒng)葉則發(fā)展為大面積的光漂白表型(白色箭頭所示,圖1-B)。然而,頂部新生葉僅呈現(xiàn)局部有限的光漂白現(xiàn)象(灰色箭頭所示,圖1-B)。以上結(jié)果表明,在病毒侵染的早中期,F(xiàn)ny-CMVΔ2b-PDS353侵染能有效地誘導(dǎo)上部系統(tǒng)葉中PDS mRNA的沉默,然而,沉默效率在新生葉中受到明顯的抑制。

    A, pF209與pF209Δ2b-PDS353的侵染性克隆示意圖;B, 本生煙接種病毒或緩沖液后(mock)的表型,接種25 d后拍照;C, pF209Δ2b-PDS353轉(zhuǎn)接3代后引起的本生煙表型,轉(zhuǎn)接14 d后拍照A, Diagram of infectious constructs pFny209 and its mutant pF209Δ2b-PDS353; B, Phenotype of N. benthamiana plants inoculated with virus or inoculation buffer (mock). The photos were taken at 25 dpi; C, Phenotype of N. benthamiana plant with infection of pF209Δ2b-PDS353 after three passages. The photo was taken at 14 dpi圖1 CMV誘導(dǎo)的PDS沉默F(xiàn)ig.1 PDS silencing induced by CMV

    為了分析Fny-CMVΔ2b-PDS353重組病毒的遺傳穩(wěn)定性,對該病毒進行了3次轉(zhuǎn)接本生煙。第三次轉(zhuǎn)接后14 d,接種植物的系統(tǒng)葉同樣表現(xiàn)明顯的光漂白表型(圖1-C)。然后,通過RT-PCR和測序分析,結(jié)果表明,插入PDS序列沒有出現(xiàn)任何片段缺失和突變(數(shù)據(jù)未顯示),這說明該重組病毒在植物體內(nèi)能穩(wěn)定遺傳,而且新生葉中減弱的沉默效率不是由于PDS插入片段的不穩(wěn)定性導(dǎo)致。

    2.2 PDS插入片段的大小對CMV誘導(dǎo)沉默效率的影響

    為了分析不同插入片段對CMV誘導(dǎo)沉默效率的影響,我們將2b ORF系列替換為不同長度的PDS片段:104 bp(PDS104)、219 bp(PDS219)、353 bp(PDS353,即Fny-CMVΔ2b-PDS353)、518 bp(PDS518)、750 bp(PDS750)和1030 bp(PDS1030)(圖2-A)。將以上重組質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別與RNA1和RNA3混合接種本生煙。接種后14 d,以上重組病毒在上部系統(tǒng)葉中引起差異的光漂白效果。PDS104幾乎不引起光漂白現(xiàn)象,葉片輕微出現(xiàn)少量的褪綠表型。PDS219則出現(xiàn)大面積褪綠,但光漂白現(xiàn)象不明顯。PDS518表現(xiàn)與PDS353相近的光漂白程度,而PDS750和PDS1030二者表現(xiàn)最為嚴重的光漂白表型。然而,在頂部的新生葉上,PDS518引起的光漂白最為明顯,而PDS750和PDS1030則與PDS104和PDS219相似,沒有引起明顯的PDS沉默表型(圖2-B)。

    A, pF209Δ2b攜帶不同長度的PDS插入片段的示意圖;B, 重組病毒在本生煙植物上引起的光漂白表型,接種后25 d拍照;C, 實時定量PCR分析重組病毒引起的PDS mRNA的下調(diào),PDS mRNA 提取自下部呈現(xiàn)光漂白的葉片(非頂葉)A, Diagram of pF209Δ2b harboring PDS inserts in different sizes. B, Photobleaching phenotype on N. benthamiana plants with infection of the recombinant viruses. Photos were taken at 25 dpi. C, Analysis of down-regulation of PDS mRNA by the recombinant viruses using real-time PCR. PDS mRNA was extracted from the leaf tissues showing photobleaching, rather than the top leaves圖2 不同長度的PDS插入對CMV誘導(dǎo)PDS沉默效率的影響Fig.2 Effect of PDS insertion in different sizes on CMV-induced PDS silencing

    利用熒光定量PCR方法,對上述表現(xiàn)光漂白表型的上部系統(tǒng)葉(非頂部葉片)中的PDS mRNA水平進行相對定量,結(jié)果如圖2-C所示。PDS104與PDS219侵染分別只降低了11%和25%;PDS353侵染則顯著降低了PDS mRNA水平,降低效率為65%。與mock相比,PDS518、PDS750和PDS1030分別降低了73%、82%和80%。以上結(jié)果說明,CMV誘導(dǎo)的PDS沉默效率與PDS插入片段的大小呈一定的相關(guān)性。

    2.3 重組病毒的遺傳穩(wěn)定性分析

    為分析以上重組病毒的遺傳穩(wěn)定性,對重組病毒進行了3次轉(zhuǎn)接。轉(zhuǎn)接后第14天,通過Northern雜交對系統(tǒng)葉中的病毒子代RNA進行檢測。結(jié)果顯示(圖3-A),在轉(zhuǎn)接的植物中均檢測到病毒RNA條帶,且各重組病毒間基因組含量沒有顯著區(qū)別。但是,我們注意到PDS1030、PDS750和PDS518三者的基因組RNA2遷移速率比PDS353快,這與理論大小不相符,說明前三者的RNA2很可能發(fā)生PDS片段的缺失。為此,通過RT-PCR和測序分析,我們發(fā)現(xiàn),PDS353、PDS219和PDS104病毒的PDS插入片段沒有發(fā)生缺失和突變,但是,PDS1030、PDS750和PDS518在插入片段的5’端分別缺失813、542和332 nt(圖3-B)。這些結(jié)果說明,CMV作為沉默載體,最適插入片段為350 nt左右。

    3 討論

    到目前為止,已有多達40個植物病毒的VIGS載體報道[11],這說明許多病毒都具有誘導(dǎo)基因沉默的能力。但是,不同病毒的沉默效率可能存在著差異性。Ratcliff等[1]發(fā)現(xiàn):相比于馬鈴薯X病毒(Potatovirusx, PVX)、煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus, TMV)和番茄金花葉病毒(Tomatogoldenmosaicvirus, TGMV),TRV具有明顯的沉默效率優(yōu)勢:表現(xiàn)為更高的沉默程度和更久的持續(xù)時間。PVX不能有效地誘導(dǎo)頂部新生葉的PDS沉默,但是TRV則能有效地誘導(dǎo)沉默,這方面的差異很可能與二者病毒能否侵染植物頂端分生組織有關(guān)[1]。TRV由于其編碼的RNA沉默抑制子16k,使得該病毒能有效地侵染植物的頂端分生組織[12],但是PVX則不能[1]。

    A, RNA 雜交分析病毒子代RNA的積累,總RNA 提取自病毒轉(zhuǎn)接3代后第14天的系統(tǒng)葉;B, CMV病毒中PDS插入片段的缺失示意圖,網(wǎng)格方形代表PDS序列的缺失部分,括號中數(shù)字代表缺失的堿基數(shù)目,其他數(shù)字表示缺失片段在原插入片段中的位置,灰色代表在病毒基因組中保留的序列部分A, Analysis of viral progeny RNAs by RNA blotting. Total RNA was extracted from the upper systemic leaves at 14 dpi after 3 passages; B, Diagrams of PDS deletion from the PDS inserts in CMV. Rectangles with grids indicate deletion from the inserted PDS fragments. The numbers in brackets indicate deletion size. Other numbers represent the positions of deletion fragment in the original inserts. Gray rectangles indicate the sequence remained in the viral genomes after passages圖3 CMV重組病毒的遺傳穩(wěn)定性分析Fig.3 Analysis of genetic stabilities of CMV recombinants

    CMV 2b蛋白是該病毒侵染植物的頂端分生組織所必需的[13]。我們所測試的CMV沉默載體由于完全缺失2b基因,從而使得CMV重組病毒喪失了侵染本生煙頂端分生組織的能力,這合理地解釋了該CMV沉默載體無法有效地沉默頂端新生葉組織中PDS的現(xiàn)象。另外一種可能是2b蛋白的缺失,使得病毒無法克服寄主的抗病毒RNA沉默,導(dǎo)致病毒積累顯著降低[9,14],從而影響了PDS siRNA在體內(nèi)的豐度。當(dāng)在特定CMV株系的基因組中保留2b N端約80個氨基酸(包含RNA抑制子的活性結(jié)構(gòu)域),在其后插入靶標(biāo)的部分序列,能有效地抑制本生煙和玉米植物體內(nèi)相應(yīng)內(nèi)源基因的RNA沉默[4,6]。由此可見,選擇特定CMV 2b蛋白,并保留其抑制子的功能結(jié)構(gòu)域,對CMV 誘導(dǎo)植物內(nèi)源的基因沉默是有利的。

    Burch-Smith等[15]報道300~500 bp 插入片段的沉默效果最佳。然而,我們發(fā)現(xiàn),插入片段的長度與CMV誘導(dǎo)的沉默效率呈現(xiàn)一定的相關(guān)性,353 nt和518 nt的插入片段均能有效地誘導(dǎo)沉默,但是,750 nt片段的插入達到最高的沉默效率(圖2)。盡管長片段的插入增強了沉默效率,但是,插入片段大于518 nt則降低了病毒的遺傳穩(wěn)定性,出現(xiàn)插入片段的丟失(圖3)。外源片段丟失的現(xiàn)象也在侵染玉米的CMV沉默載體中發(fā)生[6]。片段的缺失很可能是由于長片段的插入影響了病毒基因組的病毒粒子組裝和長距離運輸。基于沉默的效率和穩(wěn)定性,CMV載體的理想插入片段在350 nt左右。

    [1] RATCLIFF F, MARTIN-HERNANDEZ A M, BAULCOMBE D C. Technical advance. Tobacco rattle virus as a vector for analysis of gene function by silencing [J].PlantJournal, 2001, 25(2): 237-245.

    [2] PALUKAITIS P, GARCIA-ARENAL F. Cucumoviruses [J].AdvancesinVirusResearch, 2003, 62: 241-323.

    [3] JACQUEMOND M. Cucumber mosaic virus [J].AdvancesinVirusResearch, 2012, 84: 439-504.

    [4] 程曉東,施偉,杜志游,等. 基于黃瓜花葉病毒(CMV)基因沉默載體的構(gòu)建 [J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2015, 23(12): 1550-1558. CHENG X D, SHI W, DU Z Y, et al. Construction of virus-induced gene silencing vector based onCucumbermosaicvirus(CMV) [J].JournalofAgriculturalBiotechnology, 2015, 23(12): 1550-1558. (in Chinese with English abstract)

    [5] OTAGAKI S, ARAI M, TAKAHASHI A, et al. Rapid induction of transcriptional and post-transcriptional gene silencing using-a novel Cucumber mosaic virus vector [J].PlantBiotechnologyJournal, 2006, 23(3): 259-265.

    [6] WANG R, YANG X, WANG N, et al. An efficient virus-induced gene silencing vector for maize functional genomics research [J].PlantJournal, 2016, 86(1): 102-115.

    [7] RIZZO T M, PALUKAITIS P. Construction of full-length cDNA clones of cucumber mosaic virus RNAs 1, 2 and 3: generation of infectious RNA transcripts [J].MolecularGeneralGenetics, 1990, 222(2): 249-256.

    [8] DU Z Y, CHEN F F, LIAO Q S, et al. 2b ORFs encoded by subgroup IB strains of cucumber mosaic virus induce differential virulence on Nicotiana species [J].JournalGeneralVirology, 2007, 88(9): 2596-2604.

    [9] DU Z Y, CHEN A Z, CHEN W H, et al. Nuclear-cytoplasmic partitioning of the Cucumber mosaic virus 2b protein determines the balance between its roles as a virulence determinant and RNA silencing suppressor [J].JournalVirology, 2014, 88(10):5228-5241.

    [10] DUAN C G, FANG Y Y, ZHOU B J, et al. Suppression of Arabidopsis ARGONAUTE1-mediated slicing, transgene-induced RNA silencing, and DNA methylation by distinct domains of the Cucumber mosaic virus 2b protein [J].PlantCell, 2012, 24(1): 259-274.

    [11] RAMANNA H, DING X S, NELSON R S. Rationale for developing new virus vectors to analyze gene function in grasses through virus-induced gene silencing [J].MethodsinMolecularBiology, 2013, 975: 15-32.

    [12] MARTIN-HERNANDEZ A M, BAULCOMBE D C. Tobacco rattle virus 16-kilodalton protein encodes a suppressor of RNA silencing that allows transient viral entry in meristems [J].JournalofVirology, 2008, 82(8): 4064-4071.

    [13] SUNPAPAO A, NAKAI T, DONG F, et al. The 2b protein of cucumber mosaic virus is essential for viral infection of the shoot apical meristem and for efficient invasion of leaf primordia in infected tobacco plants [J].JournalofGeneralVirology, 2009, 90(12): 3015-3021.

    [14] DIAZ-PENDO J A, Li F, Li W X, et al. Suppression of antiviral silencing by cucumber mosaic virus 2b protein in Arabidopsis is associated with drastically reduced accumulation of three classes of viral small interfering RNAs [J].PlantCell, 2007, 19(6): 2053-2063.

    [15] BURCH-SMITH T M, ANDERSON J C, MARTIN G B, et al. Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants [J].PlantJournal, 2004, 39(5): 734-746.

    (責(zé)任編輯 張 韻)

    Investigation of efficiency and stability ofCucumbermosaicvirus-based gene silencing vector

    XIANG Zhidan, ZHANG Zhenxiao, LI Chao, DU Zhiyou*

    (CollegeofLifeSciences,ZhejiangSci-TechUniversity,Hangzhou310018,China)

    Virus-induced gene silencing (VIGS) has been widely used for analysis of plant gene function. In this work, using phytoene desaturase (PDS) as an indicator, efficiency ofCucumbermosaicvirus(CMV) as a VIGS vector was investigated to silence PDS mRNA inNicotianabenthamiana. Recombinant viruses were generated by replacing the 2b ORF with a set of PDS fragments, and tested inN.benthamianaplants. Results showed that these recombinants induced photobleaching phenotype in the upper systemic leaves and silencing efficiency was correlated with the length of the PDS inserts in some extents, but they did not cause obvious photobleaching phenotype in the newly top leaves and oversized inserts (≥518 nt) reduced genetic stability of viral genome, leading to partial deletion of the inserts. Thus, the optimal insert is about 350 nt in length for CMV-based VIGS vector.

    virus-induced gene silencing;Cucumbermosaicvirus; 2b; phytoene desaturase

    http://www.zjnyxb.cn

    10.3969/j.issn.1004-1524.2017.04.16

    2016-11-30

    國家自然科學(xué)基金(31470007)

    向志丹(1992—),女,湖北宜昌人,碩士研究生,從事分子植物病毒學(xué)研究。E-mail: wjgqzwwl@qq.com

    *通信作者,杜志游,E-mail: duzy@zstu.edu.cn

    Q933

    A

    1004-1524(2017)04-0625-06

    浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報ActaAgriculturaeZhejiangensis, 2017,29(4): 625-630

    向志丹,張震霄,李超,等. 黃瓜花葉病毒基因沉默載體的效率和穩(wěn)定性分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報,2017,29(4): 625-630.

    猜你喜歡
    花葉病毒侵染質(zhì)粒
    揭示水霉菌繁殖和侵染過程
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
    藜草花葉病毒的研究概述
    中國蔬菜(2016年8期)2017-01-15 14:23:34
    蕓薹根腫菌侵染過程及影響因子研究
    甘藍根腫病菌休眠孢子的生物學(xué)特性及侵染寄主的顯微觀察
    我國甜菜花葉病毒基因與馬鈴薯Y病毒屬其它家族序列的比較與分析
    中國糖料(2015年6期)2015-11-25 08:40:58
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對其增殖的影響
    Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y的作用
    芯片技術(shù)檢測黃瓜花葉病毒、煙草花葉病毒和馬鈴薯Y病毒
    BAG4過表達重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細胞的鑒定
    99热6这里只有精品| 日本一二三区视频观看| 一区二区三区免费毛片| 一夜夜www| 国国产精品蜜臀av免费| 国产av不卡久久| 国产精品av视频在线免费观看| 村上凉子中文字幕在线| 99国产极品粉嫩在线观看| 中文字幕av成人在线电影| 全区人妻精品视频| 国产黄片美女视频| 三级经典国产精品| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲av二区三区四区| 国产伦在线观看视频一区| 中文字幕av在线有码专区| 成人综合一区亚洲| 精品久久久久久久久久免费视频| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产视频内射| 少妇熟女欧美另类| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 麻豆成人午夜福利视频| 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲va在线va天堂va国产| 久久久久国内视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 日韩高清综合在线| 一边摸一边抽搐一进一小说| 免费观看人在逋| 免费观看人在逋| 日韩欧美免费精品| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 欧美激情在线99| 村上凉子中文字幕在线| 悠悠久久av| 日韩人妻高清精品专区| 日本免费一区二区三区高清不卡| 中文亚洲av片在线观看爽| 黄色日韩在线| 黄色配什么色好看| 国产精品99久久久久久久久| 国产探花极品一区二区| 亚洲性久久影院| 日本熟妇午夜| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲色图av天堂| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 婷婷精品国产亚洲av| 黄色日韩在线| 久久精品91蜜桃| 两个人的视频大全免费| av.在线天堂| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 精品久久久久久久久亚洲| 此物有八面人人有两片| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 午夜a级毛片| 亚洲av免费在线观看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 69av精品久久久久久| av卡一久久| 亚洲高清免费不卡视频| 老司机影院成人| 午夜爱爱视频在线播放| 在线免费十八禁| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 老司机影院成人| 春色校园在线视频观看| 亚洲国产色片| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 欧美成人免费av一区二区三区| 欧美国产日韩亚洲一区| av黄色大香蕉| 免费人成在线观看视频色| 亚洲无线观看免费| 亚洲av五月六月丁香网| 中文亚洲av片在线观看爽| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | av天堂中文字幕网| 一个人看视频在线观看www免费| 国内精品一区二区在线观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 欧美+亚洲+日韩+国产| 一级a爱片免费观看的视频| 国产伦精品一区二区三区视频9| 日日撸夜夜添| 色哟哟·www| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 高清毛片免费观看视频网站| 午夜免费激情av| 99热全是精品| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久久久精品国产欧美久久久| 美女被艹到高潮喷水动态| 午夜日韩欧美国产| 免费无遮挡裸体视频| 女同久久另类99精品国产91| 国产高清三级在线| 成人亚洲精品av一区二区| 国产在视频线在精品| 真人做人爱边吃奶动态| 午夜视频国产福利| 国产探花极品一区二区| 身体一侧抽搐| 亚洲欧美日韩无卡精品| 91麻豆精品激情在线观看国产| 少妇的逼好多水| 国产精品女同一区二区软件| 性插视频无遮挡在线免费观看| 春色校园在线视频观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 午夜精品国产一区二区电影 | 一本精品99久久精品77| 国产人妻一区二区三区在| 美女内射精品一级片tv| 一区二区三区四区激情视频 | 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久九九热精品免费| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| av在线播放精品| 最近手机中文字幕大全| 可以在线观看的亚洲视频| 精品日产1卡2卡| 久久久a久久爽久久v久久| 色5月婷婷丁香| 中文亚洲av片在线观看爽| 午夜福利在线在线| 欧美日韩精品成人综合77777| 97超视频在线观看视频| 有码 亚洲区| 亚洲国产精品成人综合色| 禁无遮挡网站| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国内精品久久久久精免费| 日韩成人伦理影院| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 亚洲不卡免费看| 亚洲在线观看片| 亚洲成av人片在线播放无| 又黄又爽又免费观看的视频| 欧美三级亚洲精品| 最好的美女福利视频网| 色综合亚洲欧美另类图片| 长腿黑丝高跟| 69av精品久久久久久| 成人av在线播放网站| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产色爽女视频免费观看| 99久久九九国产精品国产免费| 精品人妻偷拍中文字幕| 深夜a级毛片| 欧美精品国产亚洲| 亚洲av熟女| 亚洲人与动物交配视频| 在线播放国产精品三级| 赤兔流量卡办理| av福利片在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 香蕉av资源在线| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 男女视频在线观看网站免费| 久久精品夜色国产| 国产av一区在线观看免费| av专区在线播放| 小说图片视频综合网站| 最好的美女福利视频网| 国产一区亚洲一区在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产真实乱freesex| 亚洲第一电影网av| 久久久久免费精品人妻一区二区| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 精品久久久久久久久久久久久| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 伊人久久精品亚洲午夜| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产三级中文精品| 99热网站在线观看| 深爱激情五月婷婷| 在现免费观看毛片| 午夜福利成人在线免费观看| 国产av麻豆久久久久久久| 精品福利观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 听说在线观看完整版免费高清| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | h日本视频在线播放| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲av第一区精品v没综合| 欧美xxxx性猛交bbbb| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 小说图片视频综合网站| 亚洲乱码一区二区免费版| 美女黄网站色视频| 一级毛片久久久久久久久女| 国产精品一区www在线观看| 亚洲人成网站在线播| 一个人看视频在线观看www免费| 午夜福利高清视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲精品国产成人久久av| 久99久视频精品免费| 国产av一区在线观看免费| 国产免费男女视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产精品人妻久久久影院| 久久6这里有精品| 老司机福利观看| 在线播放无遮挡| 99国产极品粉嫩在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 丝袜美腿在线中文| 成人亚洲精品av一区二区| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产精品久久久久久精品电影| 成人午夜高清在线视频| 日本黄色片子视频| 精品国内亚洲2022精品成人| h日本视频在线播放| 美女免费视频网站| 激情 狠狠 欧美| 一级黄片播放器| 国产综合懂色| av福利片在线观看| 欧美日韩在线观看h| 亚洲最大成人av| 搡老妇女老女人老熟妇| 日韩欧美精品v在线| 精品久久国产蜜桃| 国产欧美日韩一区二区精品| 日韩欧美国产在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 日韩欧美 国产精品| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲av第一区精品v没综合| 性欧美人与动物交配| 日韩成人伦理影院| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久99热这里只有精品18| 国产一区二区激情短视频| 免费观看的影片在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产高清激情床上av| 日韩欧美免费精品| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美最黄视频在线播放免费| 波野结衣二区三区在线| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 免费大片18禁| 欧美丝袜亚洲另类| 99热精品在线国产| 日韩一本色道免费dvd| 国产成人福利小说| 美女cb高潮喷水在线观看| 精品久久久久久久久久久久久| 看免费成人av毛片| eeuss影院久久| 69av精品久久久久久| 精品日产1卡2卡| 色综合色国产| www.色视频.com| 久久6这里有精品| 校园春色视频在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 精品久久久久久久久亚洲| 午夜亚洲福利在线播放| 午夜激情福利司机影院| 精品国内亚洲2022精品成人| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 久久久成人免费电影| 成人特级av手机在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 九色成人免费人妻av| 99riav亚洲国产免费| 久久精品国产亚洲av天美| 黄色日韩在线| 草草在线视频免费看| 毛片一级片免费看久久久久| 日本三级黄在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 99热只有精品国产| 国产欧美日韩一区二区精品| 联通29元200g的流量卡| 欧美+亚洲+日韩+国产| 九九热线精品视视频播放| 可以在线观看的亚洲视频| 中文字幕av在线有码专区| 久久人人精品亚洲av| 岛国在线免费视频观看| 内地一区二区视频在线| 一级黄色大片毛片| 丰满的人妻完整版| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产在视频线在精品| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲熟妇熟女久久| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 欧美一区二区国产精品久久精品| 成人性生交大片免费视频hd| 18+在线观看网站| 国产真实伦视频高清在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看 | 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 男女之事视频高清在线观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲av五月六月丁香网| 美女黄网站色视频| 热99re8久久精品国产| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 在线观看一区二区三区| 久久久色成人| av专区在线播放| 悠悠久久av| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 欧美精品国产亚洲| 国产中年淑女户外野战色| 少妇熟女aⅴ在线视频| avwww免费| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 久久这里只有精品中国| 亚洲av免费高清在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 91av网一区二区| 日韩av在线大香蕉| 在线播放国产精品三级| 国产精品一区二区性色av| 18禁在线播放成人免费| 成年av动漫网址| 天天一区二区日本电影三级| 1000部很黄的大片| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产69精品久久久久777片| 国产精品不卡视频一区二区| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 床上黄色一级片| 国产亚洲精品久久久com| 日本三级黄在线观看| 国内精品美女久久久久久| 欧美一区二区国产精品久久精品| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 一级黄色大片毛片| 床上黄色一级片| 免费看日本二区| 可以在线观看的亚洲视频| 国产高清三级在线| 久久欧美精品欧美久久欧美| 两个人视频免费观看高清| av黄色大香蕉| ponron亚洲| 日日干狠狠操夜夜爽| av黄色大香蕉| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产高清有码在线观看视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产午夜福利久久久久久| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲国产精品国产精品| 22中文网久久字幕| 观看美女的网站| 又爽又黄a免费视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲国产精品成人综合色| 天美传媒精品一区二区| 床上黄色一级片| 美女免费视频网站| 日韩人妻高清精品专区| 国产午夜福利久久久久久| 身体一侧抽搐| 色哟哟·www| 一级av片app| 久久精品91蜜桃| 综合色丁香网| 中文在线观看免费www的网站| av在线观看视频网站免费| 给我免费播放毛片高清在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 免费电影在线观看免费观看| 美女高潮的动态| 成人av一区二区三区在线看| 一区二区三区四区激情视频 | 久久久欧美国产精品| 午夜福利18| 日本欧美国产在线视频| 欧美+日韩+精品| 黑人高潮一二区| 免费看日本二区| 身体一侧抽搐| 最近中文字幕高清免费大全6| 国内精品久久久久精免费| h日本视频在线播放| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产成人91sexporn| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲国产高清在线一区二区三| 综合色丁香网| 亚洲丝袜综合中文字幕| 丰满的人妻完整版| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 18禁在线播放成人免费| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 五月伊人婷婷丁香| 久99久视频精品免费| 在线a可以看的网站| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久久精品国产自在天天线| 熟女人妻精品中文字幕| 看免费成人av毛片| 综合色av麻豆| 久久人妻av系列| 嫩草影视91久久| 国产一区二区激情短视频| av黄色大香蕉| 亚洲成人精品中文字幕电影| 麻豆成人午夜福利视频| 国产精品1区2区在线观看.| 俄罗斯特黄特色一大片| 精品久久久噜噜| 婷婷色综合大香蕉| 日本一二三区视频观看| 免费看光身美女| 久久久精品94久久精品| 亚洲在线观看片| 成人国产麻豆网| 国产亚洲欧美98| 国产高潮美女av| 亚洲va在线va天堂va国产| 久久久久久久久久成人| 久久人人爽人人爽人人片va| 欧美3d第一页| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲,欧美,日韩| 一级毛片电影观看 | 黄色一级大片看看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久久久a久久爽久久v久久| www日本黄色视频网| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 男女视频在线观看网站免费| 搞女人的毛片| 久久久精品94久久精品| 天堂网av新在线| av免费在线看不卡| 色尼玛亚洲综合影院| 最新中文字幕久久久久| 夜夜夜夜夜久久久久| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美又色又爽又黄视频| 人妻少妇偷人精品九色| 日韩欧美 国产精品| 老司机影院成人| 国产极品精品免费视频能看的| 春色校园在线视频观看| 国产老妇女一区| 一区二区三区免费毛片| 少妇高潮的动态图| 亚洲av熟女| 日韩国内少妇激情av| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产精品人妻久久久久久| 久久久精品94久久精品| 99久久精品一区二区三区| 精品乱码久久久久久99久播| 真实男女啪啪啪动态图| 日韩欧美三级三区| 黄色欧美视频在线观看| 日本免费a在线| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 日本五十路高清| 久久久久久久久久久丰满| 国产一区二区激情短视频| 久久久久国产网址| 国产片特级美女逼逼视频| 欧美日韩在线观看h| 最近最新中文字幕大全电影3| 国国产精品蜜臀av免费| 黄色一级大片看看| 成人av在线播放网站| 日韩欧美精品v在线| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 综合色av麻豆| 成人亚洲欧美一区二区av| 热99re8久久精品国产| 日本 av在线| 国产精品电影一区二区三区| 99国产精品一区二区蜜桃av| 12—13女人毛片做爰片一| 久久草成人影院| 亚洲精品色激情综合| 国产伦在线观看视频一区| 久久久久九九精品影院| 国产精品一区二区性色av| aaaaa片日本免费| 久久这里只有精品中国| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美在线一区亚洲| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 亚洲精品国产av成人精品 | 尤物成人国产欧美一区二区三区| 欧美性猛交黑人性爽| 看十八女毛片水多多多| 三级毛片av免费| 日韩制服骚丝袜av| 国产精品人妻久久久久久| 国模一区二区三区四区视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产在视频线在精品| av在线天堂中文字幕| 欧美区成人在线视频| 久久99热6这里只有精品| 日韩欧美三级三区| 国产探花极品一区二区| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲国产精品sss在线观看| 天堂网av新在线| 国产高清有码在线观看视频| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲美女搞黄在线观看 | 三级经典国产精品| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 久久这里只有精品中国| 亚洲成av人片在线播放无| 黄色欧美视频在线观看| 免费大片18禁| 三级国产精品欧美在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 有码 亚洲区| 亚洲av二区三区四区| 亚洲人与动物交配视频| www.色视频.com| 久久久久免费精品人妻一区二区| 免费观看的影片在线观看| 国产一区二区三区av在线 | 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产91av在线免费观看| 久久久久久大精品| 亚洲中文字幕日韩| 如何舔出高潮| 久久久精品94久久精品| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久久国产成人精品二区| 久久精品影院6| 国产黄片美女视频| aaaaa片日本免费| 国产精品人妻久久久影院| 看免费成人av毛片| 少妇人妻精品综合一区二区 | 露出奶头的视频| av.在线天堂| 成人亚洲精品av一区二区| 九九热线精品视视频播放| 在线天堂最新版资源| 晚上一个人看的免费电影| 国产精品日韩av在线免费观看| 波野结衣二区三区在线| 国产亚洲欧美98| 哪里可以看免费的av片| av天堂中文字幕网| 欧美3d第一页| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产高清不卡午夜福利| 成人二区视频| 国产一区二区在线av高清观看| 小说图片视频综合网站| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲内射少妇av| 一级黄色大片毛片| 老司机午夜福利在线观看视频| 久久久久久国产a免费观看| 插逼视频在线观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 色综合站精品国产| 插逼视频在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 我要看日韩黄色一级片| 我的老师免费观看完整版| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 18禁在线播放成人免费| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 日本免费a在线| 日韩一本色道免费dvd| 丝袜喷水一区| 夜夜爽天天搞| 日本与韩国留学比较| 国产av麻豆久久久久久久|