橙皮素對(duì)大鼠離體心臟心功能的影響及其機(jī)制研究

石萌　侯曉敏　劉宇　郭鵬美　宋奇穎　張明升

[摘要] 目的 觀察橙皮素（HSP）對(duì)大鼠離體心臟心功能的影響及其可能的機(jī)制。 方法 建立Langendorff離體心臟灌流模型，記錄不同濃度HSP對(duì)大鼠離體心臟冠狀動(dòng)脈流量（coronary flow，CF）、心率（heart rate，HR）、左心室發(fā)展壓（left ventricular developed pressure，LVDP ）、左心室舒張末壓（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、等容收縮期左心室內(nèi)壓上升的最大速率（positive dp/dtmax，+dp/dtmax）、等容舒張期左心室內(nèi)壓下降的最大速率（negative dp/dtmax，-dp/dtmax）的影響。使用鈣激活K+通道（KCa）阻斷劑四乙胺（TEA）、ATP敏感K+通道（KATP）阻斷劑格列本脲（Gli）、內(nèi)向整流K+通道（KIR）阻斷劑氯化鋇（BaCl2）、電壓依賴(lài)性K+通道（KV）阻斷劑4-氨基吡啶（4-AP）等工具藥探究HSP對(duì)離體大鼠心臟心功能影響的機(jī)制。 結(jié)果 與用藥前相比，HSP可以增加離體大鼠心臟的CF值（P<0.05），降低其LVDP、+dp/dtmax值（P<0.05）。4-AP能抑制HSP對(duì)離體心臟CF、LVDP、+dp/dtmax的作用（P<0.05），而TEA、Gli、BaCl2無(wú)明顯作用（P>0.05）。 結(jié)論 HSP對(duì)離體大鼠心臟有負(fù)性肌力作用，其機(jī)制與心肌細(xì)胞的KV激活有關(guān)，與KCa、KATP、KIR無(wú)關(guān)。

[關(guān)鍵詞] HSP；離體心臟灌流；作用機(jī)制；KV通道

[中圖分類(lèi)號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）04-0032-05

Effects and mechanism of hesperetin on cardiac function in isolated rat hearts

SHI Meng HOU Xiaomin LIU Yu GUO Pengmei SONG Qiying ZHANG Mingsheng

Departmet of Pharmacology， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of hesperetin（HSP） on cardiac function in isolated rat hearts and explore its possible mechanism. Methods The model of Langendorff isolated heart perfusion system was used to record the results including coronary flow（CF）， heart rate（HR）， left ventricular developed pressure（LVDP）， leftventricular end-diastolic pressure（LVEDP）， positive dp/dtmax（+dp/dtmax） and negative dp/dtmax （-dp/dtmax）by different concentrations of HSP perfusion in isolated rat hearts. In this paper， the mechanism of effects of HSP on cardiac function in isolated rat hearts was explored by applying the inhibitors of KCa channel（TEA）， KATP channel（Gli），KIR channel（BaCl2）and KV channel（4-AP）. Results Compared with preadministration，HSP could increase the CF（P<0.05） and decrease the LVDP，+dp/dtmax（P<0.05） of isolated rat hearts. 4-AP could restrain the effects of HSP（P<0.05）， while TEA， Gli and BaCl2 had no obvious effects（P>0.05）. Conclusion HSP has a negative inotropic effect on isolated rat hearts，which could be related to the activation of KV channel on cardiomyocytes， but dont depend on KCa， KATP and KIR channel.

[Key words] HSP； Isolated heart perfusion； Mechanism； KV channel

橙皮素是一種黃烷酮類(lèi)糖苷，主要來(lái)自柑橘屬植物果實(shí)的果皮和果肉。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道HSP具有顯著的抗炎[1]、抗氧化[2]、抗腫瘤[3]作用。流行病學(xué)研究顯示，在日常膳食中增加HSP的攝入可以有效地降低人類(lèi)由于心血管疾病的死亡率[4]。研究表明，HSP可以通過(guò)JNK/Bax信號(hào)通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡[5]，還可以通過(guò)阻斷PKCa/bⅡ-AKT、JNK和TGFb1-Smad信號(hào)通路抑制超壓力負(fù)荷小鼠的心臟重構(gòu)[6]。以上研究成果均提示，HSP有望成為保護(hù)心血管系統(tǒng)的良藥。然而，HSP對(duì)正常心臟有何影響及其機(jī)制目前尚未有明確報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立Langendorff離體心臟模型，研究HSP對(duì)正常心臟的直接作用及其可能的作用機(jī)制，旨在為臨床應(yīng)用HSP防治心血管疾病提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

橙皮素（HSP）、四乙胺（TEA）、格列本脲（Gli）、氯化鋇（BaCl2）、4-氨基吡啶（4-AP）、戊巴比妥鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，分析純氯化鈉（NaCl2）、分析純氯化鉀（KCl）購(gòu)自天津市北辰方正試劑廠，分析純氯化鈣（CaCl2）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、磷酸氫鈉（NaHCO3）、氯化鎂（MgCl2）、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，分析純葡萄糖、無(wú)水乙醇購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

用無(wú)水乙醇溶解HSP，DMSO溶解Gli，TEA、BaCl2、4-AP均使用三蒸水溶解。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性Spraguue Dawley （SD）大鼠80只，8周齡，體重為200～250 g，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究所，許可證號(hào)SCXK（京）2014-0013。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

恒溫水浴箱：HW-1000 超級(jí)恒溫水浴箱，購(gòu)自成都泰盟科技有限公司；多通道數(shù)顯蠕動(dòng)泵：LEAD-2-A，購(gòu)自保定蘭格恒流泵有限公司；離體心臟灌流系統(tǒng)：GL-2，購(gòu)自成都泰盟科技有限公司；生物信號(hào)采集系統(tǒng)：Power LabPS4/8、Lab Chart 7.0 pro，購(gòu)自埃德儀器（上海）有限公司；計(jì)算機(jī)：DELL E520。

1.4 Langendorff離體心臟模型的建立

按照文獻(xiàn)所示方法[7]，大鼠稱(chēng)重后，40 mg/kg戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠后，迅速開(kāi)胸取心，置于4℃臺(tái)式液（配方為：NaCl2 118、KCl 5.0、CaCl2 1.5、NaH2PO4 1.2、NaHCO3 20、MgCl2 1.2、葡萄糖11，單位：mmol/L）中，迅速將心臟轉(zhuǎn)移固定到Langendorff灌流裝置上，以臺(tái)式液行主動(dòng)脈逆行灌流。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中灌流液中持續(xù)通入95%O2+5%CO2混合氣，維持恒溫（37℃）、恒壓（75 mmHg， 1 mmHg=0.133 kPa），恒定pH（pH 7.4）灌流。待心臟恢復(fù)跳動(dòng)后，用眼科剪在左心房上剪一小口，把通過(guò)腰麻管與換能器相連通的小球囊經(jīng)過(guò)左心房置于左心室內(nèi)，球囊內(nèi)注入少量水，使心臟初始前負(fù)荷維持于4～10 mmHg。當(dāng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)嚴(yán)重的心律失常時(shí)舍棄該心臟8。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組

離體心臟隨機(jī)分為10組，每組8只。待心臟穩(wěn)定30 min后，可繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。（1）正常組：離體心臟持續(xù)灌注臺(tái)式液。（2）溶劑對(duì)照組：乙醇組和DMSO組，用含0.1%（V/V）的Vehicle或DMSO臺(tái)式液灌注心臟30 min。（3）藥物作用組：分別用HSP終濃度為10-5、3×10-5、10-4 moL/L的臺(tái)式液灌注心臟30 min，觀察不同濃度HSP對(duì)心功能的影響。（4）鉀通道阻斷劑+HSP組：分別用含四種鉀通道阻斷劑TEA、Gli、BaCl2、4-AP的臺(tái)式液（終濃度分別為1、0.01 、1、1 mmoL/L）預(yù)灌注心臟30 min，再用HSP終濃度為3×10-5 moL/L的臺(tái)式液灌注心臟30 min。

1.6 左心功能評(píng)價(jià)指標(biāo)

心臟固定好后，經(jīng)臺(tái)式液預(yù)灌注穩(wěn)定30 min后，采用LabChart 7.0 pro生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)監(jiān)測(cè)記錄離體心臟心率（HR）、左心室發(fā)展壓（LVDP）、左心室舒張末壓（LVEDP）、等容收縮期左心室內(nèi)壓上升的最大速率（+dp/dtmax）、等容舒張期左心室內(nèi)壓下降的最大速率（-dp/dtmax）等指標(biāo)，在特定時(shí)間點(diǎn)記錄離體心臟冠狀動(dòng)脈流量（CF）。以穩(wěn)定30 min末的值為基礎(chǔ)值，計(jì)算各指標(biāo)的改變率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，比較進(jìn)行t檢驗(yàn)或單因素重復(fù)測(cè)量方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 溶劑對(duì)大鼠離體心臟心功能及CF的影響

正常組與乙醇組、DMSO組各項(xiàng)數(shù)值之間差異無(wú)顯著性（P>0.05），各組給藥前后無(wú)顯著差異（P>0.05）（表1～6），表明溶劑對(duì)大鼠離體心臟心功能及CF無(wú)明顯影響。

2.2 不同濃度HSP對(duì)大鼠離體心臟心功能的影響

2.2.1 不同濃度HSP對(duì)大鼠離體心臟CF和HR的影響 HSP可以增加離體心臟的CF。隨著HSP濃度增加，離體心臟的CF值逐漸增大，最大值為（10.4±0.9）mL/min（表7）。HSP對(duì)離體心臟的HR無(wú)明顯影響（表8）。

2.2.2 不同濃度HSP對(duì)大鼠離體心臟左心室收縮功能（LVDP，+dp/dtmax）的影響 HSP可以濃度依賴(lài)性地降低離體心臟的LVDP，+dp/dtmax。隨著HSP濃度增加，離體心臟的LVDP，+dp/dtmax值逐漸降低，最小值分別為（50±3）mmHg、（1592±261）mmHg/s（表9、10）。

2.3 四種鉀通道阻斷劑對(duì)HSP灌流心臟的影響

與HSP 3×10-5 mol/L組相對(duì)比，用KV阻斷劑4-AP預(yù)處理心臟30 min后，4-AP可以顯著抑制HSP對(duì)離體心臟CF的增加，其增長(zhǎng)率由（22.8±3.8）%降至（6.1±2.4）%（圖1A）；減弱HSP對(duì)LVDP的抑制作用，其抑制率由（26.8±4.7）%降至（5.9±5.6）%（圖1C）；減弱HSP對(duì)+dp/dtmax的抑制作用，其抑制率由（11.4±4.7）%降至（5.8±2.3）%（圖1D）（P<0.05）。而KCa阻斷劑TEA、KATP阻斷劑Gli和KIR阻斷劑BaCl2對(duì)HSP灌流心臟心功能的影響均不顯著（P>0.05）。

3 討論

多酚類(lèi)包括黃酮類(lèi)和單寧類(lèi)。黃酮類(lèi)是由兩個(gè)芳香環(huán)以及一個(gè)含氧雜環(huán)構(gòu)成。根據(jù)結(jié)構(gòu)以及中央雜環(huán)的氧化狀態(tài)，黃酮類(lèi)又可以分為八種：黃酮類(lèi)化合物、黃酮醇、黃烷酮、查爾酮、異黃酮、花色素類(lèi)、橙酮類(lèi)、雙黃酮類(lèi)和新黃酮類(lèi)聚合物。

研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類(lèi)可以降低缺血性腦卒中以及慢性血管性疾病的死亡率[9]。黃酮類(lèi)具有顯著地心血管保護(hù)作用[10]，在心血管系統(tǒng)，黃酮類(lèi)化合物影響膽固醇的內(nèi)源性合成以及自由基的清除。在體外實(shí)驗(yàn)中Havsteen BH[11]發(fā)現(xiàn)，黃酮類(lèi)可以促進(jìn)家兔主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴(lài)性的舒張作用。有研究表明，枳類(lèi)果實(shí)的黃酮類(lèi)提取物可以通過(guò)NO-cGMP途徑舒張豬冠狀動(dòng)脈[12]。HSP是柑橘屬二氫黃酮類(lèi)中具有多種生物學(xué)活性的一種物質(zhì)，在柑橘汁、橙汁、西柚汁等中含量豐富。我們的實(shí)驗(yàn)表明HSP可以抑制心肌收縮功能并且可以舒張冠狀動(dòng)脈。

Langendorff離體心臟模型廣泛應(yīng)用于生理、藥理等領(lǐng)域的研究，其優(yōu)點(diǎn)是可以排除神經(jīng)體液調(diào)節(jié)，從而研究某單一因素對(duì)心功能及代謝的影響。LVDP和+dp/dtmax反映了心臟收縮功能，+dp/dtmax可以間接地反映心肌的收縮速度[13]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HSP可以降低正常大鼠離體心臟的LVDP、+dp/dtmax值，證明HSP對(duì)心臟收縮功能有抑制作用。LVEDP和-dp/dtmax反映了心臟舒張功能，-dp/dtmax可以反映左心室等容舒張期左心室內(nèi)壓力最大下降速率以及左心室順應(yīng)性[14]。CF可以一定程度上反應(yīng)冠脈的收縮與舒張狀況，本實(shí)驗(yàn)中HSP可以濃度依賴(lài)性的增加離體大鼠心臟的CF值，證明HSP對(duì)冠脈有一定的舒張作用，該結(jié)論本課題組前期15的研究結(jié)果相一致。HR也是反映心功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，與心輸出量密切相關(guān)，此外，HR減慢可延長(zhǎng)冠脈灌注時(shí)間，改善心肌血供。

在本實(shí)驗(yàn)研究中，為了進(jìn)一步探索HSP對(duì)心功能影響的機(jī)制，我們采用了四種K+通道抑制劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HSP對(duì)心功能的影響可以被4-AP所阻斷，而不被TEA、Gli、BaCl2所影響，證明HSP對(duì)離體大鼠心臟的負(fù)性肌力作用可能與心肌細(xì)胞的KV激活有關(guān)，而與KCa、KATP、KIR無(wú)關(guān)。

Ca2+是肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)的關(guān)鍵因子，由于心肌細(xì)胞的肌質(zhì)網(wǎng)不發(fā)達(dá)，儲(chǔ)存的Ca2+較少，所以主要依賴(lài)外Ca2+通過(guò)肌膜及橫管膜中的L型鈣通道內(nèi)流入胞質(zhì)觸發(fā)興奮-收縮耦聯(lián)。KV通道的活性與心肌細(xì)胞靜息電位的形成，動(dòng)作電位的時(shí)程與頻率尤其是動(dòng)作電位復(fù)極相密切相關(guān)16。在心肌細(xì)胞動(dòng)作電位2期，Ca2+通過(guò)L型鈣通道內(nèi)流形成去極化電流，而這一內(nèi)向電流則被KV外向電流所抗衡，當(dāng)KV激活時(shí)，Ca2+內(nèi)流減少，從而導(dǎo)致心肌收縮力減弱。我們的研究表明KV的激活的參與了HSP對(duì)心臟收縮功能的抑制。

綜上所述，HSP可以濃度依賴(lài)性地抑制心肌收縮功能，舒張冠狀動(dòng)脈，其機(jī)制與KV激活有關(guān)，而與KCa、KATP、KIR無(wú)關(guān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Hirata A，Murakami Y，Shoji M，et al. Kinetics of radical-scavenging activity of hesperetin and hesperidin and their inhibitory activity on COX-2 expression[J]. Anticancer research，2005，25（5）：3367-3374.

[2] Choi EJ. Antioxidative effects of hesperetin against 7，12-dimethylbenz（a） anthracene-induced oxidative stress in mice[J]. Life sciences，2008，82（21-22）：1059-1064.

[3] Li F，Chow S，Cheung WH，et al. The citrus flavonone hesperetin prevents letrozole-induced bone loss in a mouse model of breast cancer[J]. The Journal of nutritional biochemistry，2013，24（6）：1112-1116.

[4] Knekt P，Kumpulainen J，Jarvinen R，et al. Flavonoid intake and risk of chronic diseases[J]. The American journal of clinical nutrition，2002，76（3）：560-568.

[5] Yang Z，Liu Y，Deng W，et al. Hesperetin attenuates mitochondria-dependent apoptosis in lipopolysaccharide-induced H9C2 cardiomyocytes[J]. Molecular medicine reports，2014，9（5）：1941-1946.

[6] Deng W，Jiang D，F(xiàn)ang Y，et al. Hesperetin protects against cardiac remodelling induced by pressure overload in mice[J]. Journal of molecular histology，2013，44（5）：575-585.

[7] Stojic I，Srejovic I，Zivkovic V，et al. The effects of verapamil and its combinations with glutamate and glycine on cardiodynamics，coronary flow and oxidative stress in isolated rat heart[J]. Journal of physiology and biochemistry，2016.

[8] Ikizler M，Erkasap N，Dernek S，et al. Dietary polyphenol quercetin protects rat hearts during reperfusion：Enhanced antioxidant capacity with chronic treatment[J]. Anadolu kardiyoloji dergisi：AKD=the Anatolian journal of cardiology，2007，7（4）：404-410.

[9] Toufektsian MC，de Lorgeril M，Nagy N，et al. Chronic dietary intake of plant-derived anthocyanins protects the rat heart against ischemia-reperfusion injury[J]. The Journal of nutrition，2008，138（4）：747-752.

[10] Cassidy A，Rimm EB，O'Reilly EJ，et al. Dietary flavonoids and risk of stroke in women[J]. Stroke，2012，43（4）：946-951.

[11] Havsteen BH. The biochemistry and medical significance of the flavonoids[J]. Pharmacology & therapeutics，2002， 96（2-3）：67-202.

[12] Yu DJ，Jun JH，Kim TJ，et al. The relaxing effect of Poncirus fructus and its flavonoid content on porcine coronary artery[J]. Laboratory animal research，2015，31（1）：33-39.

[13] Gao XM，Dart AM，Dewar E，et al. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice[J]. Cardiovascular research，2000，45 （2）：330-338.

[14] Ji DB，Zhang LY，Li CL，et al. Effect of Hydroxysafflor yellow a on human umbilical vein endothelial cells under hypoxia[J]. Vascular pharmacology，2009，50（3-4）：137-145.

[15] Liu Y，Niu L，Cui L，et al. Hesperetin inhibits rat coronary constriction by inhibiting Ca（2+） influx and enhancing voltage-gated K（+） channel currents of the myocytes[J]. European journal of pharmacology，2014，735：193-201.

[16] Hatano N，Ohya S，Muraki K，et al. Dihydropyridine Ca2+ channel antagonists and agonists block Kv4.2，Kv4.3 and Kv1.4 K+ channels expressed in HEK293 cells[J]. British journal of pharmacology，2003，139（3）：533-544.

（收稿日期：2016-10-13）