無(wú)錫市腹瀉病人沙門菌的病原學(xué)特征及分子分型研究

沙 丹，李 泓，管紅霞，馮微宏，肖 勇

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無(wú)錫市腹瀉病人沙門菌的病原學(xué)特征及分子分型研究

沙 丹，李 泓，管紅霞，馮微宏，肖 勇

目的 分析無(wú)錫市腹瀉人群中分離的沙門菌的流行特征；同時(shí)比較主要血清型菌株間的脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)帶型差異，為沙門菌感染的防控提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。方法 收集2015年無(wú)錫市腹瀉病人的糞便標(biāo)本，分別進(jìn)行沙門菌的分離鑒定、藥敏試驗(yàn)、血清型分型以及PFGE分型分析。結(jié)果 756份糞便標(biāo)本中共分離到32株沙門菌，陽(yáng)性率為4.23%；檢出時(shí)間主要集中在5～10月份，感染人群以老年人為主。藥敏試驗(yàn)說(shuō)明無(wú)錫地區(qū)的沙門菌對(duì)氨芐西林的耐藥率最高，達(dá)56.25%；對(duì)環(huán)丙沙星和頭孢他啶的耐藥率最低，均為6.25%。32株沙門菌共鑒定出11種血清型，以腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌為主，分別占31.25%和21.88%。對(duì)這2種血清型的沙門菌進(jìn)行PFGE分析，顯示腸炎沙門菌所有帶型的相似度均在85%以上，鼠傷寒沙門菌的帶型各不相同。結(jié)論 無(wú)錫市沙門菌的感染具有明顯季節(jié)和年齡分布差異性，流行的優(yōu)勢(shì)血清型為腸炎沙門菌。無(wú)錫市需同時(shí)加強(qiáng)對(duì)食品和環(huán)境中沙門菌的監(jiān)測(cè)。

沙門菌；耐藥性；脈沖場(chǎng)凝膠電泳；Luminex 200

沙門菌是引起人類感染性腹瀉和食物中毒最重要的腸道致病菌之一，在自然界中分布廣泛，蛋類、奶類及其制品、肉類等食品均有被其污染的可能，因此每年都有大量由于沙門菌污染食物引起的疾病發(fā)生。為了解沙門菌在無(wú)錫市腹瀉人群中的感染規(guī)律和流行特征，本研究對(duì)2015年無(wú)錫市哨點(diǎn)醫(yī)院的腹瀉病人進(jìn)行腸道沙門菌的感染監(jiān)測(cè)，揭示沙門菌在本地區(qū)的耐藥情況及優(yōu)勢(shì)血清型，結(jié)合脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)的分子分型，為無(wú)錫市沙門菌的臨床治療和暴發(fā)流行的追蹤溯源提供科學(xué)的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源 2015年共采集來(lái)自無(wú)錫市食源性疾病監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院756份腹瀉病患者的糞便標(biāo)本，其中男性患者385例，女性患者371例，男女比例為1.04∶1。按照生活狀態(tài)的不同，將患者分為3個(gè)年齡段：1～20歲患者129例、21～60歲患者478例、>60歲患者149例。腹瀉定義：每日排便≥3次，且糞便性狀異常(稀便、水樣便、粘液便或膿血便等)。

1.2 儀器與試劑 改良亞硒酸鹽璜綠增菌肉湯(SBG)購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，三糖鐵購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，沙門菌顯色培養(yǎng)基購(gòu)自法國(guó)科馬嘉，VITEK 2 GN鑒定卡購(gòu)自法國(guó)BioMerieu公司，xMAP○RSalmonellaSerotyping Assay Kit購(gòu)自美國(guó)Luminex公司，HotStar Taq○RMaster Mix Kit購(gòu)自QIAGEN公司，SSI○R沙門氏菌屬診斷血清套裝購(gòu)自丹麥SSI公司，蛋白酶K、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ均購(gòu)自大連TAKARA公司，SeaKem Gold瓊脂糖為意大利Lonza公司產(chǎn)品。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析儀購(gòu)自法國(guó)BioMerieu公司，Luminex 200多功能流式點(diǎn)陣儀購(gòu)自美國(guó)Luminex公司，Mastercycler○Rep gradient S PCR儀購(gòu)自德國(guó)eppendorf公司，Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)和CHEF Mapper XA脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司。Sensititre(先德)熒光快速微生物鑒定和藥敏分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)TREK公司，革蘭氏陰性致病菌的定制藥敏板(編號(hào)：PRCDCN2)包含的藥物有：氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、四環(huán)素、紅霉素、氯霉素、頭孢唑啉、環(huán)丙沙星、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、頭孢他啶、亞胺培南、萘啶酸、頭孢西丁、頭孢噻肟、慶大霉素、阿奇霉素。

1.3 菌株的分離鑒定 根據(jù)2015年江蘇省食源性疾病主動(dòng)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)最新檢測(cè)方法，對(duì)采集到的糞便標(biāo)本進(jìn)行沙門菌的分離培養(yǎng)，純培養(yǎng)的可疑菌落經(jīng)三糖鐵初步鑒定后使用VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析儀進(jìn)行生化鑒定。

1.4 藥敏試驗(yàn) 藥敏測(cè)定采用Sensititre(先德)熒光快速微生物鑒定和藥敏分析系統(tǒng)的微量肉湯稀釋法(MIC)進(jìn)行操作。取50 μL 0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙杭尤氲?1 mL CAMHT肉湯中，混勻后取100 μL該肉湯菌懸液加到定制藥敏板孔中，在30 min內(nèi)完成接種。36 ℃培養(yǎng)20 h后，使用Vizion進(jìn)行讀板。以未接種的CAMHT肉湯作為陰性對(duì)照，大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株。

1.5 血清型分型 本研究使用Luminex公司生產(chǎn)的xMAP○RSalmonellaSerotyping Assay Kit(SSA)試劑盒對(duì)分離到的沙門菌進(jìn)行血清型分型，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、雜交反應(yīng)均嚴(yán)格按照SSA試劑盒檢測(cè)流程和要求操作。

1.6 脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分型 參照美國(guó)CDC PulseNet實(shí)驗(yàn)室使用的標(biāo)準(zhǔn)化PFGE分子分型方法，對(duì)分離純化的沙門菌進(jìn)行DNA膠塊的制備，經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切后使用CHEF Mapper XA進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型。電泳條件：電壓6.0 V/cm，脈沖參數(shù)2.2～ 63.8 s，電泳18.5 h。利用BioNumerics軟件讀取并聚類分析PFGE電泳圖譜。

2 結(jié) 果

2.1 流行狀況分析 756份糞便標(biāo)本中共檢出32株沙門菌，陽(yáng)性率為4.23%。沙門菌感染主要集中在夏秋季，尤其是5～10月份，占總檢出數(shù)的90.62%。年齡分布上，沙門菌感染的高發(fā)人群以老年人為主。>60歲患者中共檢出10例沙門菌陽(yáng)性，陽(yáng)性率為6.71% ；其次是21～60歲患者19例，陽(yáng)性率為3.97% ；1～20歲患者3例，陽(yáng)性率為2.33%。男、女沙門菌感染陽(yáng)性數(shù)分別為15例和17例，檢出率分別為3.90%和4.58%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.22，P>0.05)。

2.2 藥敏結(jié)果 分離到的32株沙門菌對(duì)氨芐西林的耐藥率最高(56.25%)，對(duì)環(huán)丙沙星和頭孢他啶的耐藥率最低(6.25%)。在本次試驗(yàn)中共有10株沙門菌對(duì)氨芐西林、環(huán)丙沙星、萘啶酸、頭孢他啶、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑均敏感，有2株沙門菌為多重耐藥菌，出現(xiàn)了對(duì)3類或以上抗菌藥物全部耐藥的情況。32株沙門菌對(duì)這5種抗菌藥物的耐藥結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 32株沙門菌對(duì)5種抗菌藥物的藥敏結(jié)果

Tab.1 Results of antibiotic resistance for 32 strains ofSalmonella

抗菌藥物Antibiotics耐藥株(耐藥率%)Resistant(%)敏感株(敏感率%)Sensitive(%)氨芐西林(Ampicillin)18(56．25)14(43．75)環(huán)丙沙星(Ciprofloxa?cin)2(6．25)30(93．75)萘啶酸(Nalidixicacid)16(50．0)16(50．0)頭孢他啶(Ceftazidime)2(6．25)27(84．4)甲氧芐啶/磺胺甲惡唑(Cotrimoxazole)6(18．75)26(81．25)

2.3 血清型分型 32株沙門菌經(jīng)SSA試劑盒進(jìn)行血清型分型后，確定了20株沙門菌的血清型別，檢出率為62.5%，其余的12株沙門菌無(wú)法判斷具體的血清型別，仍需使用SSI血清進(jìn)行進(jìn)一步的O抗原或H抗原的鑒定。使用SSI血清對(duì)所有的沙門菌結(jié)果進(jìn)行復(fù)核，已確定型別的20株沙門菌的鑒定符合率為100%。32株沙門菌共鑒定出11種血清型別，以腸炎沙門菌為主，共檢出9株，占28.13%，其他依次為鼠傷寒沙門菌8株，占25.0%，倫敦沙門菌4株，占12.5%，阿貢納沙門菌3株，占9.38%，湯卜遜沙門菌2株，占6.25%。

2.4 PFGE分析 分別對(duì)腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳分子分型，聚類分析結(jié)果顯示，9株腸炎沙門菌可分為7種帶型，所有帶型的相似度均在85%以上。8株鼠傷寒沙門菌的帶型各不相同，為高度散發(fā)，有3株鼠傷寒沙門菌的帶型相似度大于85%。見(jiàn)圖1。

圖1 腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌的PFGE帶型聚類圖Fig.1 PFGE patterns of the S. enteritidis and the S. typhimurium

3 討 論

本調(diào)查研究顯示，無(wú)錫地區(qū)沙門菌引起的腹瀉散發(fā)病例占全部腹瀉人群的4.23%，陽(yáng)性病例在老年人群中所占的比例最高，在低齡人群中的感染率最低，這與其他地區(qū)的報(bào)道有所不同[1-2]。老年人群可能由于長(zhǎng)期的餐飲習(xí)慣和生活環(huán)境的限制，使其暴露于傳染源所受到感染的風(fēng)險(xiǎn)較其他人群高。隨著無(wú)錫地區(qū)經(jīng)濟(jì)文化的發(fā)展，低齡人群的飲食和衛(wèi)生已經(jīng)受到家長(zhǎng)越來(lái)越多的重視和指導(dǎo)，沙門菌在低齡人群中的感染得到了很好的控制。夏秋季是沙門菌感染的高發(fā)季節(jié)，多是由于人們食用了生冷或不潔的食品導(dǎo)致，說(shuō)明食品更容易在夏秋季受到沙門菌的污染。在本次調(diào)查研究的陽(yáng)性病例中有1名是從事餐飲業(yè)的服務(wù)人員，可成為沙門菌感染潛在的傳染源，也增加了沙門菌引起食源性疾病暴發(fā)事件的可能。

沙門菌屬包括了2 500多種血清型別[3]，不同的血清型別攜帶有不同的抗原，致病能力也不相同[4]。此外由于抗生素在臨床治療和畜牧業(yè)的不當(dāng)使用，使得沙門菌多重耐藥的情況日益嚴(yán)重[5-6]，因此監(jiān)測(cè)沙門菌的血清型流行規(guī)律和耐藥性特征，對(duì)沙門菌感染的防治具有重要作用。本研究分別使用兩種方法對(duì)分離到的沙門菌進(jìn)行血清型分型，將SSA試劑盒血清分型法與傳統(tǒng)的SSI血清凝集法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示SSA試劑盒血清分型法的血清鑒定率為62.5%，血清鑒定的準(zhǔn)確率達(dá)100%，未能鑒定的沙門菌需進(jìn)一步使用SSI血清凝集法進(jìn)行判定。SSA試劑盒血清分型法可同時(shí)對(duì)多個(gè)沙門菌進(jìn)行血清鑒定，分型時(shí)間控制在一天內(nèi)，結(jié)合SSI血清凝集法比較適用于大批量沙門菌的血清分型鑒定。本次研究中的沙門菌均來(lái)源于臨床腹瀉病人，對(duì)32株沙門菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，無(wú)錫地區(qū)的沙門菌對(duì)氨芐西林的耐藥率最高，而對(duì)環(huán)丙沙星最為敏感。喹諾酮類和三代頭孢菌素是目前臨床治療沙門菌感染的主要藥物，本研究分別對(duì)這兩類藥物進(jìn)行沙門菌的藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)無(wú)錫地區(qū)的沙門菌對(duì)三代喹諾酮類的敏感性要高于三代頭孢菌素，且三代喹諾酮類的耐藥率遠(yuǎn)低于一代喹諾酮類藥物，因此三代喹諾酮類可作為臨床治療的首選藥物推薦使用。在32株沙門菌中產(chǎn)生多重耐藥菌的比率為6.25%，說(shuō)明沙門菌在無(wú)錫地區(qū)的耐藥情況尚不嚴(yán)重，但多重耐藥菌的出現(xiàn)也提示了沙門菌的耐藥前景不容樂(lè)觀，需引起臨床醫(yī)生的高度重視。

目前沙門菌分子分型在我國(guó)運(yùn)用最多的方法是脈沖場(chǎng)凝膠電泳，其標(biāo)準(zhǔn)化方案為不同實(shí)驗(yàn)室之間的比對(duì)分析提供了可能，可用于追蹤傳染源及傳播途徑，為疫情的控制提供實(shí)驗(yàn)室診斷依據(jù)[7-8]。沙門菌在無(wú)錫地區(qū)腹瀉人群中流行的優(yōu)勢(shì)血清型是腸炎沙門菌，對(duì)其進(jìn)行PFGE分子分型，結(jié)果顯示9株腸炎沙門菌按100%相似度聚類可分成7個(gè)PFGE型別，而按85%相似度進(jìn)行聚類分析這些腸炎沙門菌均屬于同一個(gè)PFGE型別。根據(jù)TENOVE原則對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷，本次調(diào)查研究中分離的9株腸炎沙門菌在遺傳學(xué)上可能存在一定的相關(guān)性，具有來(lái)源于同一個(gè)克隆群菌株的可能，說(shuō)明無(wú)錫地區(qū)腹瀉人群中流行的腸炎沙門菌在流行傳播過(guò)程中存在著基因變異現(xiàn)象，形成了基因組流行形式的多樣性。其他血清型別的沙門菌感染目前均呈高度散發(fā)狀態(tài)，繼續(xù)監(jiān)測(cè)這些型別沙門菌的流行與分布，對(duì)防控沙門菌的暴發(fā)感染具有重要意義。流行病學(xué)溯源角度，本研究?jī)H對(duì)腹瀉人群中分離到的沙門菌進(jìn)行了PFGE分析，缺少對(duì)傳染源和傳播途徑的監(jiān)測(cè)調(diào)查，因此在今后的工作中還需加強(qiáng)對(duì)食品和環(huán)境樣品中沙門菌的監(jiān)測(cè)工作。

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Pathogenic characteristics and molecular typing ofSalmonellastrains isolated from diarrhea patients in Wuxi City, Jiangsu Province, China

SHA Dan, LI Hong, GUAN Hong-xia, FENG Wei-hong, XIAO Yong

(WuxiCenterforDiseaseControlandPrevention,Wuxi214023,China)

We analyzed the pathogenic characteristics ofSalmonellastrains isolated from diarrhea patients in Wuxi City, Jiangsu Province, China and compared the differences among pulse field gel electrophoresis (PFGE) patterns of main serotype strains,so as to provid scientific basis for disease control. After biochemical identification of theSalmonellastrains isolated from infectious diarrhea patients in Wuxi in 2015, drug susceptibility test, serotyping and PFGE were applied to analyze these strains. Results showed that a total of 32Salmonellastrains were detected from 756 diarrhea specimens with a positive rate of 4.23%. The infection occurred more frequently between May and October and adults aged more than 60 years old affected mostly. There was no significant difference between genders in infected population. The drug susceptibility test indicated that the antibiotic resistance rate of theseSalmonellastrains to ampicillin (56.25%) was the highest, and to ciprofloxacin(6.25%) and Ceftazidime (6.25%) were the lowest. The 32Salmonellastrains belonged to 11 serotypes, andS.enteritidis(31.25%) andS.typhimurium(21.88%) were the predominant serotypes. PFGE showed that the pattern similarity of allS.enteritidiswas more than 85%; PFGE patterns ofS.typhimuriumwere different. In conclusion, the infection ofSalmonellafrom diarrhea patients in Wuxi City had obvious season and age specific distribution, and the most prevalent serotype ofSalmonellawas theS.enteritidis. It is necessary to strengthen the surveillance ofSalmonellaconcurrently in food and environment.

Salmonella; antibiotic resistance; PFGE; Luminex 200

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.04.017

無(wú)錫市疾病預(yù)防控制中心，無(wú)錫 214023

Supported by the Health Bureau Foundation of Wuxi City, China (No. Q201508)

R378.2

B

1002-2694(2017)04-0378-04

2016-04-06 編輯：梁小潔

無(wú)錫市衛(wèi)生局科研項(xiàng)目(No.Q201508)資助